全 文 ：5期
收稿日期：2014-11-18
基金项目：广西自然科学基金项目（20130231）；亚热带生物资源保护与利用国家重点实验室项目（C190014)；广西教育厅高校
科学技术研究重点项目（20130300)；广西教育厅高校科学技术研究一般项目（KY2015YB012）
作者简介：*为通讯作者，姜伟（1975-），副教授，主要从事微生物与植物相互作用研究工作，E-mail：weijiang@gxu.edu.cn。岑卫健
（1982-），主要从事微生物功能基因组学及生物靶向研究工作，E-mail：cweijian@gxu.edu.cn
十字花科黑腐病菌中假定糖基水解酶基因
与致病力相关研究
岑卫健1，2，吴 赞3，邹海凡3，刘 娇3，姜伯乐1，3，姜 伟1，3*
（1亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530005； 2广西理工科学实验中心，南宁 530005；
3广西大学 生命科学与技术学院，南宁 530005）
摘要：【目的】已报道的十字花科黑腐病菌Xcc 8004菌株基因组中XC1077被注释编码一个假定糖基水解酶，初步
研究XC1077基因的致病性，为深入研究Xcc 8004中的糖基水解酶在植物病原菌侵染及定殖过程中的作用奠定基础。
【方法】通过同源单交换构建XC1077整合突变体NK1077，用带有全长XC1077基因序列的pLAFRJ质粒对NK1077进行
功能互补并检测致病性。【结果】PCR及酶切验证表明整合突变体NK1077和互补菌株C1077构建成功。在MMX基本培
养基上，NK1077及C1077的生长情况与Xcc 8004一致。致病性试验结果表明，NK1077在满身红萝卜的致病性下降到
Xcc 8004的48.3%，过敏反应（HR）检测结果表明NK1077在辣椒ECW-10R上产生的HR反应明显滞后，而互补菌致病
力及过敏反应能恢复至野生型水平。【结论】XC1077基因在Xcc 8004中是一个与致病相关的基因。
关键词：十字花科黑腐病菌；XC1077基因；整合突变体；致病力；过敏反应
中图分类号：Q754 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2015）05-0793-07
0 引言
【研究意义】十字花科黑腐病菌（Xanthomonas
campestris pv. campestris，Xcc）能引起几乎所有的十
字花科植物黑腐病，是研究微生物—植物相互作用的
Correlation analysis between putative glycosyl hydrolase gene
and pathogenicity in Xanthomonas campestris pv. campestris
CENWei-jian1，2，WUZan3，ZOUHai-fan3，LIUJiao3，JIANGBo-le1，3，JIANGWei1，3*
（1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning 530005，China，China；2
Guangxi Experiment Centre of Science and Technology，Nanning 530005，China；3College of Life Science and Technology，
Guangxi University，Nanning 530005，China）
Abstract：【Objective】XC1077 gene was annotated to encode a putative glycosyl hydrolase in the reported genome se-
quence of Xanthomonas campestris pv. campestris strain 8004（Xcc 8004）. The present experiment was concudcted to pre-
liminarily investigate pathogenicity of XC1077 gene to lay the foundation for further study on the function of glycosyl hy-
drolase protein in the infection and colonization process of plant pathogenic bacteria. 【Method】The integrate mutant
NK1077 of XC1077 gene was constructed by using homologous single exchange method. The pLTRAJ plasmid with whole
sequence of XC1077 gene made a functional supplement for NK1077. Then the pathogenicity of complementation strain
C1077 was detected. 【Result】The identification of PCR and enzyme digestion showed that the integrate mutant NK1077
and complementation strain C1077 were constructed successfully. NK1077 and C1077 strains could grow as well as Xcc
8004 on basic medium MMX. The pathogenic experiment demonstrated that the pathogenicity of NK1077 decreased to
48.3% that of Xcc 8004 in Chinese radish （Raphanussativus var. radiculus） cv. Manshenhong. Hypersensitive reaction
（HR） results showed that HR of NK1077 was obviously lagging behind in pepper ECW-10R C1077.The pathogenicity and
HR of complementation strain C1077 could returned to the wild-type level. 【Conclusion】XC1077 gene plays an important
role of pathogenicity in Xcc 8004 strain.
Key words： X. campestris pv. campestris； XC1077 gene； integrate mutant； pathogenicity； HR
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2015.5.793
南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2015，46（5）：793-799
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.cn
南 方 农 业 学 报 46卷
模式菌株之一（Alvarez，2000）。不同的植物病原细菌
利用不同类型的致病生化因子，使寄主表现出各种各
样的病症。植物病原细菌对寄主的侵染是个复杂的生
理过程，一般将致病过程分为接触、侵入、识别、定殖
扩展和发病五个阶段（Kiemtrup et al.，2000）。Xcc对
十字花科植物的病理作用是研究微生物与植物相互
作用机理的重要模型系统之一（Meyer et al.，2005），
从基因组水平全面、系统地研究Xcc的致病基因，弄清
致病机理，可以有效提高对农业病害的防治效率。【前
人研究进展】植物细胞壁是植物病原菌侵染寄主植物
的一道屏障，植物病原菌需分泌一系列细胞壁降解酶
（Cell wall-degrading enzymes，CWDEs）参与植物细
胞壁的降解作用才能顺利侵染寄主植物（周洁等，
2009）。病原菌接触、侵入、识别、定殖扩散及营养吸收
等过程都需要这些酶先对植物细胞壁进行降解
（Schafer，1994）。研究发现，致病菌在侵染寄主植物过
程中分泌的胞外糖基水解酶（Glycoside hydrolases，
GHs）可以将植物多糖分解成寡糖或者单糖，从而破
坏植物细胞壁结构，致病菌在突破表皮障碍侵染寄主
植物的同时也吸取了自身繁殖所需的营养物质
（Coutinho et al.，2009；Battaglia et al.，2011；Vano Fos-
sen et al.，2011）。同时，Feil等（2005）在丁香假单孢菌
全序列分析中发现有一个基因的核心序列具有纤维
素酶的特征，是糖基水解酶的第5家族基因，其编码的
产物作用可能是降解植物纤维素。这些酶在细胞壁降
解过程中起重要作用，对植物病原菌的致病性影响显
著。【本研究切入点】十字花科黑腐病菌引起的黑腐病
可以造成巨大的经济损失，进一步研究明确该菌的致
病机理是一项重要工作。编号为XC1077基因的ORF全
长1779 bp，目前注释的蛋白为假定的糖基水解酶蛋
白，经BLAST比对分析发现，该基因与在Xanthomonas
campestris pv. raphani（Xcr）中注释为糖基水解酶的
XCR3421的核酸和氨基酸的相似性均为100%，是糖
基水解酶的第15家族基因。目前关于十字花科黑腐病
菌对糖基水解酶的研究还较少。【拟解决的关键问题】
利用自杀质粒pK18mob通过同源单交换构建XC1077
整合突变体NK1077，以NK1077为受体菌构建XC1077
的互补菌株C1077，同时检测NK1077和C1077的致病
性和过敏反应，对XC1077基因在致病中的作用进行
初步分析，以期为进一步了解十字花科黑腐病菌细胞
壁降解酶在植物病原菌侵染及定殖过程中的作用奠
定基础。
1 材料与方法
1. 1试验材料
本研究所使用的菌株及质粒见表1。大肠杆菌
（Escherichia coli）的培养温度为37 ℃，用LB培养基培
养（Miller，1972）；Xcc培养温度为28，用NYG培养基
培养（Daniels et al.，1984）；基本培养基为MMX（Liu
et al.，2013）。抗菌素的使用参见文献（蒋国凤等，
2014）。
表 1 供试菌株及质粒
Tab.1 Strain and plasmid tested
菌株
Strain
Xcc 8004
NK1077
C1077
JM109
ED8767
特征
Relevant characteristics
野生型菌株，Rif r
Xcc 8004的XC1077整合突
变体，Rif r，Kmr
XC1077突变体的互补菌，
Rif r，Kmr，Tcr
转化受体
RecA，met，含有帮助质粒
pRK2073，Spcr
来源
Source
Daniels et al.，1984
本研究
本研究
Yanisch-Perron et al.，1985
Murray et al.，1977
质粒
Plasmid
pK18mob
pLAFRJ
pLJ1077
pK1077
特征
Relevant characteristics
黄单胞菌属的自杀质粒；Kmr
pLAFR3的MCS置换成pUC18的
MCS；Tcr
将XC1077的互补片段克隆至
pLAFRJ；Tcr
将XC1077的互补片段克隆至自
杀质粒pK18mob；Kmr
来源
Source
Sch fer et al.，1994
Jiang et al.，2009
本研究
本研究
1. 2试验方法
1. 2. 1 引物设计与合成 根据待扩增片段的DNA序
列，用Vector NTI 软件进行引物设计，引物退火温度
一般设为60 ℃左右，与模板互补的长度为18~24 bp，
根据需要在引物的5端加上相应的酶切位点序列和保
护碱基。一般使用1×TE 或ddH2O将引物配成10或20
μmol/L，所用引物见表2。
表 2 引物序列
Tab.2 Primer used in present study
引物名称 Primer name 引物序列（5-3）Sequence 用途 Purpose
pKmob18-F CCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATG 公用验证引物
pKmob18-R GCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTG
XC1077-F GGGGAATTCGACCGCCAGGCACGTGTGGTGTG NK1077构建
XC1077-R GGGGGATCC CACATCGGTGGTCAGGCGCAGG
C1077-F（Sc） GGGGAGCTC TGTTTGTCGGCGACGACCTCAC 扩增XC1077互补片段
C1077-R（K） GGGGGTACC CCGCTCCAGCCGAACCACACCC 2134 bp
794· ·
5期 岑卫健等：十字花科黑腐病菌中假定糖基水解酶基因与致病力相关研究
1. 2. 2 整合突变体 通过PCR扩增目标基因的内部
片段（150~300 bp），然后连接到自杀质粒pK18mob上，
通过三亲本接合导入Xcc 8004中获得接合子。由于接
合子质粒上的外源片段与目标基因同源，使得二者间
发生同源单交换，从而将质粒整合到目标基因上，最
终导致目标基因发生突变。通过PCR验证基因组上目
标基因是否已发生突变。由于自杀质粒整合到目标基
因上，使得基因组上拥有两个目标基因的不完全拷贝，
因此可以用自杀质粒的公用引物加上上游或下游基因
的一个引物来验证是否存在预期的目标带。
1. 2. 3 互补菌构建 根据KEGG上Xcc 8004菌株的
hrp基因核苷酸序列设计引物（表2），PCR扩增XC1077
基因开放阅读框及其上游约500 bp和下游约100 bp左
右的DNA片段，经双酶切后连接至pLAFRJ载体上，获
得重组载体。将重组子通过三亲本接合的方法导入相
应的突变体和Xcc 8004菌株中，在含有Rif、Tc抗性的
NYG培养基上筛选，经PCR和酶切验证，分别得到各
hrp基因突变体的互补菌株。
1. 2. 4 致病性测定 供试植物材料为满身红萝卜，
Xcc 8004、XC1077突变体菌株NK1077及互补菌株
C1077在NYG液体培养基中培养至菌体浓度达到
OD600=1.0左右，用无菌水稀释至OD600=0.001，用无菌
剪刀蘸取菌液，选择萝卜苗的第3、4叶距叶尖约1 cm
处垂直中脉缓慢地剪断，使菌液充分粘在被剪的叶边
缘。置于25~30℃保湿24 h，然后28℃常规培养。9~10 d
后观察并测量病斑长度。
1. 2. 5 细菌在寄主植物满身红萝卜上的生长繁殖 将
野生型Xcc 8004、NK1077及C1077在NYG液体培养基
中培养至菌体浓度达到OD600=1.0左右 ，用无菌水稀释
至OD600=0.001，剪叶接种萝卜叶片后分别于接种后第
1、3、5、7和9 d取样。每次每株菌株随机取9张叶片，每3
张叶片为1组（重复）。叶片表面用75%酒精轻轻擦拭
消毒晾干，放入研钵充分研磨使呈匀浆，加入NYGB 3
mL。每个重复取100 μL研磨液，加入900 μL NYGB中
进行10×梯度稀释涂板。每株菌株重复涂3个浓度，每
浓度涂2块板。28 ℃培养2~3 d，计算菌落数。以每菌株
每天3个浓度平均值的log值为纵坐标、取样时间（d）为
横坐标绘出待测菌株在叶内的生长曲线。
1. 2. 6 非寄主植物HR反应 所用非寄主植物材料
为辣椒苗ECW-10R，具有抗性基因Bs1。Xcc 8004、
XC1077突变体菌株NK1077及互补菌株C1077在NYG
液体培养基中培养至菌体浓度达到OD600=1.0左右，用
无菌水稀释至OD600=0.001，用无针头的针筒吸取菌液
压渗到辣椒叶片背面的叶肉中，形成一个可见的浸润
斑；将经过接种的植株置于荧光灯下连续照射8 h以
上，在照射期间随时注意观察HR病斑的变化结果，并
随时拍照记录。
1. 2. 7 XC1077生物信息学分析 在http：//www.kegg.
jp/网站上对XC1077基因定位，利用网站http：//smart.
embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl对XC1077编
码的蛋白进行结构域分析。
2 结果与分析
2. 1XC1077生物信息学分析
基因组注释表明，XC1077位于Xcc 8004基因组的
1297882~1299660 bp，全长1778 bp，转录方向为反向，
其编码592个氨基酸（图1）。其中，XC1076与XC1077有
3个碱基重合，XC1077与XC1078只相差50个碱基，这3
个基因有可能是同一个操纵子。用SMART（Schultz
et al.，2000）进一步分析，发现XC1077编码蛋白的C-
端含有一个糖基水解酶结构域，XC1074是一个趋化
蛋白，参与信号传导，含一个跨膜区域，2个HAMP功
能域。XC1075编码蛋白为葡萄糖脱氢酶，是一类氧化
还原酶，参与磷酸戊糖途径，含5个跨膜区域。XC1076
编码1种糖基转移酶，含糖基转移酶结构域。XC1078
编码脂类水解酶，参与碳水化合物代谢，含1个水解酶
的结构域。XC1079编码的蛋白是铁外膜受体蛋白，含
1个信号肽。
图 1 XC1077基因在Xcc 8004基因组上的位置
Fig.1 Locus of XC1077 gene in Xcc 8004 genome
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南 方 农 业 学 报 46卷
2. 2XC1077的分子构建及验证
XC1077的内源片段连到pK18mob上得到pK1077，
结果测序验证后，将其通过三亲整合到Xcc 8004的基
因组上，得到突变体NK1077，如图2所示。重组质粒
pK1077采用EcoR I/BamH I进行酶切验证，得到长435
bp的片段（图3-A）。用互补引物C1077-F/C1077-R（表
1）对野生型和突变体总DNA进行PCR扩增，野生型菌
株获得预期2134 bp的DNA条带，而突变体未能扩增
出条带（图3-B），表明XC1077基因被成功突变。提取
互补菌株的质粒，采用Sac I/Kpn I进行双酶切验证，得
到长度为2134 bp的片段即为阳性三亲结合子（图
3-C），命名为C1077。
2. 3突变体和互补菌的致病性和叶内生长情况
为了研究XC1077基因在Xcc致病中的作用，同时
检测了Xcc 8004、突变体NK1077和互补菌株C1077在
寄主植物满身红萝卜上的致病力和叶内生长情况。结
果（图4）表明，接种10 d后突变体NK1077的病斑明显
小于Xcc 8004，病斑长度下降到Xcc 8004的48.3%，而
互补菌C1077与Xcc 8004相似。单因素方差分析结果
显示，Xcc 8004与突变体NK1077差异显著（P＜0.05），
而与互补菌C1077差异不显著（P＞0.05）。寄主叶内的
生长情况表明突变体的生长较野生型缓慢，而互补
菌株几乎与野生型持平。可见，XC1077基因与Xcc在
寄主植物上致病相关。
图 2 构建整合突变体NK1077菌株的策略
Fig.2 Construction of integrant mutant strain NK1077
2. 4突变体和互补菌的HR检测
以菌株Xcc 8004为正对照，菌株8004△hrcV为负
对照，在辣椒ECW-10R上检测突变体NK1077和互补
菌C1077的过敏反应。HR反应检测结果表明（图5），相
比于野生型菌株Xcc 8004，突变体NK1077的HR反应
滞后约3 h，而互补菌株C1077几乎与野生型菌株Xcc
8004同时产生HR，说明XC1077基因对非宿主的HR反
应有影响。
3 讨论
细菌中主要有革兰氏阴性的农杆菌属（Agrobac-
terium）、欧文氏菌属（Erwinia）、假单胞菌属（Pseu-
domonas）、黄单胞菌属（Xanthomonas）和茄科罗尔斯
通氏菌属（Ralstonia）等几个属的细菌均可引起植物病
害（Alfano and Collmer，1996）。广义的细菌致病生化
因子包括植物细胞壁降解酶、毒素、胞外多糖、脂多
M 1 M 1 2 M 1
2000 bp
1000 bp
500 bp
2000 bp
1000 bp
500 bp
435 bp
2134 bp
2134 bp2000 bp
1000 bp
500 bp
图 3 突变体NK1077和互补菌C1077的验证
Fig.3 Identification of mutant NK1077 and complementation strain C1077
A：重组质粒pK1077的PCR验证，M：100 bp的Marker，1：PCR验证重组质粒pK1077；B：突变体NK1077的PCR验证，M：100 bp的Marker，1：PCR验
证重组质粒NK1077，2：PCR扩增Xcc 8004；C：互补菌C1077的PCR验证，M：100 bp的Marker，1：酶切验证C1077
A：PCR verification of recombinant plasmid pK1077，M：100 bp DNAMarker，1：PCR verification of recombinant plasmid pK1077；B：PCR
verification of mutant NK1077，M：100 bp DNAMarker，1：PCR verification of NK1077，2：PCR amplification of Xcc 8004；C：PCR verification of
complementation strain C1077，M：100 bp DNAMarker，1：Verification of C1077 digested by enzyme
A B C
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5期
图 5 辣椒苗ECW-10R植株HR检测
Fig.5 HR detection of pepper ECW-10R plant
糖、激素、核酸、含铁细胞、信号分子及外膜蛋白等，其
作用包括干扰寄主免疫识别、抵御寄主的过敏性反
应、瓦解寄主抗侵染的机械屏障、阻塞寄主维管束、降
解寄主细胞质等，最终使感病寄主表现出明显的病症
（He and Zhang，2008）。据报道，Xcc ATCC33913和
Xac 306两个菌株都具有较发达的细胞壁降解酶系
统，包括纤维素降解酶类、半纤维素降解酶类和果胶
降解酶类等（da Silva et al.，2002）。茄青枯假单胞菌
A
0
2
4
6
8
10
12
14
Xcc8004 NK1077 C1077
病
斑
长
度
（
m
m）
Le
ng
th
of
di
se
as
e
sp
ot
B
菌
体
数
量
对
数
值
Lo
g（
CF
U
/le
af）
Lo
g
va
lu
e
of
ba
ct
er
ia
nu
m
be
r
菌株Strain
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8
8004
NK1077
C1077
取样天数（d）Daysofsampling
C
Xcc 8004 NK1077 C1077
16 h
NK1077 C1077
cc 04
岑卫健等：十字花科黑腐病菌中假定糖基水解酶基因与致病力相关研究
a
b
a
图 4 Xcc 8004、NK1077和C1077在寄主满身红萝卜的致病性及叶内生长情况
Fig.4 Pathogenicity and growth in leaf of Xcc 8004，NK1077 and C1077 in host plant Chinese radish（Raphanussativus var.
radiculus）cv. Manshenhong
A：Xcc 8004、NK1077和C1077在寄主满身红萝卜上接种10 d后所产生的病斑；B：Xcc 8004、NK1077和C1077在寄主满身红上的致病力；C：Xcc
8004、NK1077和C1077在寄主满身红萝卜上的叶内生长曲线。图中不同小写字母表示差异达显著水平（P＜0.05）
A：Disease spot of Chinese radish（Raphanussativus var. radiculus）cv. Manshenhong on 10 days after inoculating of Xcc 8004、NK1077 and C1077
strains；B：Pathogenicity of Xcc 8004，NK100 and C1077 strains on Chinese radish（Raphanussativus var. radiculus）cv. Manshenhong；C：Growth
curve of Xcc 8004，NK100 and C1077 strains in leaf of Chinese radish（Raphanussativus var. radiculus）cv. Manshenhong. Different lowercase letters in
the figure represented significant difference at 0.05 level
Xcc 8004
1077
77
8 h
Xcc 8004 8004△hrcV
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南 方 农 业 学 报 46卷
基因组中，有5个胞壁降解酶类基因（Salanoubat et al.，
2002）。植物细胞壁的主要结构组分为多糖，主要包括
纤维素、半纤维素和多聚糖等（J rgensen et al.，2007）。
GHs酶类通过将植物多糖分解成寡糖或单糖来破坏
寄主植物细胞壁结构，进而实现侵染寄主和获取自身
繁殖所需的营养物质，但这一过程可能需要致病菌分
泌多种GHs才能完成。GHs广泛存在于植物病原菌中，
共分为133个家族。在Xcc 8004中注释为糖基水解酶
的有2个基因，分别是XC1003和XC3172，XC1003是糖
基水解酶第2家族基因，XC3172是糖基水解酶第30家
族基因，XC1077目前注释为假定蛋白，但其含有糖基
水解酶第15家族的结构域。目前对这些糖基水解酶
基因的功能尚无文献报道。
XC1077编码的蛋白是一个非常保守蛋白，在几乎
所有的黄单胞菌属、假单胞菌属的其他变种中均编码
该蛋白，且相似性均在95%以上，但该基因在Xcc 8004
中具有何种功能鲜有报道。为此，本研究通过构建
XC1077突变体，分析突变体及野生型菌株的致病性，
突变体的致病力下降到野生型的48.3%，说明该基因
在十字花科黑腐病菌致病方面发挥重要作用，是一个
与致病相关的基因。同时，XC1077突变体能激发非寄
主植物产生过敏反应，但反应有延迟，激发能力有所
降低。根据“基因对基因”理论（Flor，1971），寄生关系
的建立取决于病原物与植物间的亲和识别（Bonas and
van den Ackerveken，1999）。Xcc在非寄主及抗性寄主
上引起的HR反应是效应物蛋白与植物相关抗性蛋白
或基因相互作用的过程，这一反应依赖于III型分泌系
统有效地转运效应物至植物细胞内，而III型分泌系统
受HrpG和HrpX的调控（Jiang et al.，2009）。NK1077
HR反应有延迟，可能与III型分泌途径有关，是否受
HrpG和HrpX的调控，还有待进一步的研究。
本研究仅初步确定了XC1077是一个与致病相关
的基因，而该基因在Xcc中是否还有其他重要功能，是
否会影响其他胞壁降解酶类以及与III型分泌途径之
间是否有影响等问题还有待进一步研究。
4 结论
本研究结果表明，在Xcc 8004中的XC1077基因突
变后对细菌的生长不会产生影响，突变体致病力下降
至野生型菌株的48.3%，在非寄主植物产生过敏反应，
但反应有延迟。XC1077基因的互补菌可以将致病力
和过敏反应互补到野生型菌株的水平，即XC1077是
一个与致病相关的基因。
参考文献：
蒋国凤，吴秋菊，梁晓夏，杨丽超，阳丽艳，王凛，吴小建，姜伯
乐. 2014. 十字花科黑腐病菌 III型效应物基因 avrACXcc
8004推测的启动子区［J］.微生物学报，54（2）：159-166.
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（责任编辑 麻小燕）
岑卫健等：十字花科黑腐病菌中假定糖基水解酶基因与致病力相关研究 799· ·