全 文 ：研究报告
Research Report
金属离子对十字花科黑腐病菌不同致病系统表达的影响
唐江涛 1 王成 2 周乐 3 韦载娲 3 付秋霞 3 杨丽超 3 梁晓夏 3,4 姜伯乐 3,4*
1玉林市玉州区政府,玉林, 537000; 2广西大学化学化工学院,南宁, 530004; 3广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530004; 4亚热带农业生物
资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530004
*通讯作者, jbl1971@gxu.edu.cn
摘 要 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的病原细
菌，其通过不同的分泌系统将效应物蛋白或细胞毒素转运进真核宿主细胞产生病害，对农业生产造成巨大的
经济损失。本研究利用 GUS融合报告系统，考察了常见的几种不同金属离子(Zn2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+)对 Xcc 8004
不同致病系统装置基因表达的影响。结果表明，在 1 滋mol/L~1 mmol/L浓度区间，Zn2+和Mn2+同时对 Xcc域型
分泌系统(T2SS)和芋型分泌系统(T3SS)有抑制作用；在大于 0.01 mmol/L浓度时，Ca2+特异性抑制 T3SS；Fe2+
同时抑制 T2SS、T3SS和郁型分泌系统(T4SS)装置基因的表达。金属离子 Zn2+、Mn2+、Ca2+和 Fe2+在不同浓度下
对 Xcc的致病系统均有抑制作用。本研究为分析病原细菌不同分泌系统响应金属离子的模式奠定了基础。
关键词 十字花科黑腐病菌,致病系统,金属离子
The Impact of Metal Ions on Expression of Different Virulence System in
Xanthomonas campestris pv. campestris
Tang Jiangtao 1 Wang Cheng 2 Zhou Le 3 Wei Zaiwa 3 Fu Qiuxia 3 Yang Lichao 3 Liang Xiaoxia 3,4
Jiang Bole 3,4*
1 The Yuzhou District Peoples Government of Yulin City, Yulin, 537000; 2 School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University,
Nanning, 530004; 3 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530004; 4 State Key Laboratory for Conservation and
Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning, 530004
* Corresponding author, jbl1971@gxu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.034.000332
Abstract Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) is the pathogen of black rot in cruciferous plants. Xcc
delivered diverse effector proteins or cell toxins into the eukaryotic host cells to result in disease via different
virulence system, causing huge economic loss in agricultural production. We examined the influence of different
metal ions (Zn2+, Mn2+, Ca2+ and Fe2+) on the gene expression of diverse virulence system in Xcc 8004. Results
indicated that the metal ions of Zn2+ and Mn2+ at the concentration range of 1 滋mol/L~1 mmol/L should repress
expression of the apparatus genes of type域 secretion system (T2SS) and type芋 secretion system (T3SS), Ca2+ can
specifically inhibit T3SS when the concentration is greater than 0.01 mmol/L, and Fe2+ suppressed T2SS, T3SS and
type 郁 secretion system (T4SS) simultaneously. The metal ions of Zn2+, Mn2+, Ca2+ and Fe2+ inhibited the virulence
system of Xcc under certain concentration. This study laid a solid foundation for analyzing the pattern that
different secretion system of pathogenic bacteria response to metal ions.
Keywords Xanthomonas campestris pv. campestris, Virulence system, Metal ions
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31260443, 31060017)、广西自然科学基金项目(2013GXNSFAA019097)和广西大学
科研基金项目(DD040077)共同资助
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.
campestris , Xcc)能在全球范围内侵染几乎所有十字
花科植物，引发黑腐病。由于目前还没有有效的防治
方法，黑腐病的周期性爆发对农业生产造成了巨大
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 2期，第 332-338页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.2, 332-338
的经济损失(Williams, 1980)。植物病原细菌产生胞外
多糖、胞外酶、脂多糖、植物毒素和芋型效应物等一
系列致病生化因子(Dow and Daniels, 1994)，在致病
过程中协助病原菌瓦解宿主天然防御系统，帮助病
原菌成功感染并在宿主内增殖，最终导致病症产生
(He and Zhang, 2008)。
近年来研究发现，大多数效应物蛋白或植物毒
素依赖于不同的分泌系统分泌或转运进入真核宿主
细胞，并在病原细菌对寄主的致病过程中发挥重要
作用。如通过域 型分泌系统(T2SS)分泌的胞外酶、细
胞毒素和 XPS蛋白(Chen et al., 2005; Szczesny et al.,
2010)；通过芋 型分泌系统(T3SS)分泌的效应物蛋
白，可作为最关键的致病因子参与寄主胞内识别
(Kay and Bonas, 2009)；通过郁型分泌系统(T4SS)分泌
的胞外蛋白和单链 DNA (Christie and Cascales, 2005;
Mudgett, 2005)，这些都是致病相关因子。不同分泌系
统装置对细菌致病性起着关键作用，当 T3SS转运装
置单一组分缺失时，病原菌的致病性一般会丧失(Vi-
boud and Bliska, 2005)。由于 XC3563 (xpsD)、XC3011
(hrpB1)和 XC1638 (virB3)分别作为 T2SS、T3SS 和
T4SS分泌系统组成部分在不同菌株中具有保守性，
因此，以其作为研究对象对于不同病原菌致病机理
研究具有重要学术和实际意义。
金属离子对细菌具有多重作用，一方面，许多金
属离子作为“微量元素”，是菌体生长必不可少的；另
一方面，当它们在细胞内的浓度过高时会和某些细
胞组分形成非特异的复合物从而造成细胞中毒和死
亡；同时金属离子在植物病原菌感受外界信号的过
程中扮演着重要的角色，如 Ca2+调节，Na+/K+平衡等
(Nies and Silver, 1995)。因此，研究金属离子在不同浓
度下对致病相关基因的表达和菌体生长的影响显得
尤为重要。本研究利用 茁- 葡糖醛酸酶(GUS)融合报
告系统，探索了金属离子对 Xcc 8004不同致病系统
装置基因表达的影响。这将有助于我们了解病原细
菌致病因子的调控机制，并有利于抑制或瓦解病原
细菌的新型抗菌药物的开发。
1结果与分析
1.1 8004/pLgus3011的分子构建
以 Xcc 8004总 DNA为模板，P3011-F/P3011-R
为引物对，PCR反应扩增 XC3011上游启动子区片
段，产物大小 521 bp (图 1A)；经 EcoR玉和 BamH玉
双酶切，克隆至 pK18mob载体上，获得重组质粒
pK3011，酶切验证见图 1B；经测序验证正确后，EcoR玉
和 BamH玉双酶切胶回收启动子片段，克隆至 pLgus
载体上，获得重组质粒 pLgus3011，酶切验证见图1C；
将质粒 pLgus 和重组报告质粒 pLgus3011分别通过
三亲接合导入野生型 Xcc 8004菌株，获得菌株 8004/
pLgus 和 8004/pLgus3011，三亲子 8004/pLgus3011酶
切验证如图 1C (目标产物大小 521 bp)。将两个菌株接
种在含有X-gluc (5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -茁-D-葡萄糖
苷)的MMX平板上培养 2 d，对照菌株 8004/pLgus无
色，8004/pLgus3011菌株形成的菌落呈深蓝色(图 1D)，
表明 XC3011启动子能驱动 gus 基因的表达，翻译融
合报告质粒构建成功。
图 1 XC3011启动子区序列 PCR产物(A),重组质粒 pK3011 (B),报告质粒 pLgus3011和三亲接合子 8004/pLgus3011酶切验证
(C),定性验证三亲子的 GUS活性(D)
注: M1: 100 bp DNA ladder; M2: 姿/Hind芋 DNA ladder; 1: XC3011启动子序列的 PCR产物; 2:酶切重组质粒 pK3011; 3:酶切报
告质粒 pLgus3011; 4:酶切三亲接合子 8004/pLgus3011
Figure 1 PCR products of promoter sequence of XC3011 (A), enzyme-digested recombinant plasmid pK3011 (B), enzyme-digested re-
porter plasmid pLgus3011 and transconjugant of 8004/pLgus3011 (C), qualitative examination of GUS activity of transconjugant (D)
Note: M1: 100 bp DNA ladder; M2: 姿/Hind芋 DNA ladder; 1: PCR products of promoter sequence of XC3011; 2: Enzyme-digested re-
combinant plasmid pK3011; 3: Enzyme-digested reporter plasmid pLgus3011; 4: Enzyme-digested transconjugant of 8004/pLgus3011
金属离子对十字花科黑腐病菌不同致病系统表达的影响
The Impact of Metal Ions on Expression of Different Virulence System in Xanthomonas campestris pv. campestris 333
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
1.2 Zn2+、Mn2+、Ca2+和 Fe2+对细菌分泌系统装置基因
表达的影响
为了研究 ZnCl2、MnCl2、CaCl2、FeSO4 对 T2SS、
T3SS、T4SS和看家基因 XC3806表达的影响，通过
添加外源性的不同金属离子溶液，以添加相应体积
的无菌 ddH2O为对照，培养 20 h 后检测 T2SS 的
038G09 (XC3563)、T3SS的 8004/pLgus3011 (XC3011)、
T4SS 的 117H12 (XC1638)和 8004/pLgus3806 (看家
基因 XC3806)四个 GUS报告菌株在XCM2中添加化
合物前后的相对总 GUS活性和相对菌体密度，结果
如图 2所示(图中数据为 3个重复的平均值及标准误
差,实验重复 3次且结果一致)。
随着 ZnCl2 浓度的增加，038G09 和 8004/pL-
gus3011的相对总 GUS值显著降低，而菌体生长影
响不显著，表明 ZnCl2浓度在 0.01~1 mmol/L之间能
显著抑制 XC3563基因的表达(p<0.01)，在 1 滋mol/L~
1 mmol/L 之间能显著抑制基因 XC3011 的表达(p<
0.01)；在 ZnCl2低于 1 mmol/L时，117H12和 8004/
pLgus3806 相对总 GUS 值和菌体生长影响都不显
著，当浓度高达 1 mmol/L时，总 GUS值和菌体生长
都受到抑制(图 2A; 图 2B)。结果表明 Zn2+同时对
T2SS和 T3SS有抑制作用。
当MnCl2浓度<0.1 mmol/L时，随着 MnCl2浓度
的增加，038G09相对总 GUS值降低，而菌体生长不
受影响；8004/pLgus3011的总 GUS活性在 ZnCl2浓
度为 1 滋mol/L~0.1 mmol/L之间受到抑制，而菌体生
长影响不显著；在 MnCl2低于 1 mmol/L时，117H123
和 8004/pLgus3806相对总 GUS活性和菌株生长影
响都不显著；当浓度达到 1 mmol/L时，四个报告菌
株的 GUS活性和生长都受到抑制。表明MnCl2浓度
在 1 滋mol/L~1 mmol/L之间能显著抑制 XC3011 基
因的表达，MnCl2浓度在 0.1 mmol/L时，XC3563 基
因的表达被显著抑制，而在测定浓度范围内，对
XC1638、XC3806基因表达的影响不显著，如图 2C
和图 2D所示。结果表明Mn2+同时对 T2SS和 T3SS
有抑制作用。
随着 CaCl2 浓度的增加，8004/pLgus3011 在
0.01~5 mmol/L浓度之间相对总 GUS值显著降低，
而且菌体生长影响不显著；038G09和 117H12在测
定浓度区间，总 GUS活性和菌株生长影响都不显
著；8004/pLgus3806在 CaCl2浓度高达 5 mmol/L时，
GUS活性显著被抑制，而不影响菌体生长。表明
CaCl2在 0.01~5mmol/L浓度之间能显著抑制XC3011
基因的表达；CaCl2浓度为 5 mmol/L时，XC3806 基
因的表达被显著抑制，而在测定浓度范围内，对
XC1638、XC3563基因表达的影响不显著(图 2E;图 2G)。
结果表明 Ca2+能特异性抑制 T3SS。
当 FeSO4 浓度在 0.01~1 mmol/L 之间，038G09
的相对总 GUS 活性显著性降低；在 0.1 滋mol/L~
1 mmol/L之间，8004/pLgus3011的相对总 GUS活性
显著降低；当浓度高达 1 mmol/L时，117H12的总
GUS活性被抑制；在测定浓度区间，8004/pLgus3806
相对总 GUS活性影响不显著(图 2H)。在测定浓度范
围内菌株生长影响都不显著(图 2I)。表明 FeSO4浓
度在 0.1 滋mol/L~1 mmol/L 之间能显著抑制基因
XC3011的表达；在 0.01~1 mmol/L之间，显著抑制基
因 XC3563的表达；在浓度高达 1 mmol/L时，显著抑
制基因 XC1638 的表达；而在测定浓度范围内，对
XC3806基因表达的影响不显著。结果表明 Fe2+同时
抑制 T2SS、T3SS和 T4SS装置基因的表达。
2讨论
近年来提出了一种利用小分子化合物控制病原
细菌致病因子的抗菌策略，并报道了一系列特异性
作用于 T3SS的小分子化合物，然而大部分的化合物
的分子靶标仍然未知(Duncan et al., 2012)。文献报道
邻羟亚苄基酰肼在一定程度上通过限制铁离子的利
用而起作用，并且这种抑制活性可通过添加外源铁
离子而被逆转 (Layton et al., 2010)，而金属离子对
Xcc 8004致病因子影响的研究没有相关报道。本研
究通过测定金属离子对 Xcc 8004不同分泌系统装置
基因表达的影响，了解到 Zn2+和Mn2+同时对 T2SS
和 T3SS有抑制作用；Ca2+特异性抑制 T3SS；Fe2+同
时抑制 T2SS、T3SS和 T4SS装置基因的表达。本研
究的结果为今后了解病原细菌毒性因子表达的操纵
过程奠定了基础。
这些金属离子可能通过影响了一些关键酶的活
性或调控蛋白结构，从而影响 Xcc 8004中相应基因
表达，而不同金属对 Xcc 8004不同分泌系统的作用
不同，说明不同分泌系统间存在交集和差异，具体机
制尚不明确有待进一步研究。Xcc 8004和植物相互
作用并感受植物信号的过程中，Zn2+、Mn2+、Ca2+ 和
Fe2+金属离子可能起到了一定程度的调控作用。
3材料与方法
3.1菌株尧培养条件和试剂
本研究所用菌株和质粒见表 1。Xcc 8004的培养
334
金属离子对十字花科黑腐病菌不同致病系统表达的影响
The Impact of Metal Ions on Expression of Different Virulence System in Xanthomonas campestris pv. campestris
图 2不同金属离子梯度浓度下 038G09 (XC3563), 8004/pLgus3011, 117H12 (XC1638)和 8004/pLgus3806在 XCM2中相对总 GUS
(A,C,E,H)和相对菌体密度(B,D,G,I)的测定
注: *:相对于对照组差异极显著(p<0.01)
Figure 2 Examination of relative cellular GUS (A,C,E,H) and relative cell density (B,D,G,I) of 038G09 (XC3563), 8004/pLgus3011,
117H12 (XC1638) and 8004/pLgus3806 in XCM2 mediums in the presence of gradient concentration of different metal ions
Note: *: Significantly difference compared to the control group (p<0.01)
335
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
基为丰富培养基 NYG、基本培养基MMX (Daniels et
al., 1984) 和 XCM2 (1.05% K2HPO4, 0.45% KH2PO4,
0.1% (NH)4SO4, 0.025% MgSO4, 0.24%琥珀酸, 0.02%
酸性水解酪蛋白胨)，培养条件及抗菌素四环素(tetra-
cycline, Tc)、利福平(rifampicin, Rif)、卡那霉素(kana-
my-cin, Kan)的使用参见文献(Lu et al., 2008)。Zn-
Cl2、MnCl2、CaCl2和 FeSO4母液浓度为 0.1 mol/L。
3.2方法
3.2.1分子克隆
细菌总DNA和质粒 DNA的快速提取、限制内
切酶酶切及 DNA的连接转化方法依照文献(Sam-
brook and Russe, 2001)，三亲本接合的方法参照文献
(Turner et al., 1984)。限制性核酸内切酶、T4连接酶
和 DNA 分子量 Marker 为 Promega 公司产品，Taq
DNA聚合酶和 dNTP为 TaKaRa公司产品，胶回收
试剂盒购自杭州博日科技有限公司。
3.2.2报告菌株的分子构建
根据 Xcc 8004 XC3011 基因开放阅读框(ORF)
表 1本研究所用的菌株和质粒
Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this research
菌株和质粒
Strains or plasmids
菌株
Strains
Xcc 8004
038G09
117H12
8004/pLgus3806
8004/pLgus3011
质粒
Plasmids
pK18mob
pLgus
pK3011
pLgus3011
相关特征
Relevant characteristics
野生型菌株, Rifr
Wild type strain, Rifr
8004的 XC3563 Tn5gusA5正向插入突变体, Rifr, Kanr
XC3563 Tn5gusA5 inserted mutants of Xcc 8004, Rifr, Kanr
8004的 XC1638 Tn5gusA5正向插入突变体, Rifr, Kanr
XC1638 Tn5gusA5 inserted mutants of Xcc 8004, Rifr, Kanr
8004含有质粒 pLgus3806, Rifr, Tcr
Xcc 8004 harboring plasmid pLgus3806, Rifr, Tcr
8004含有质粒 pLgus3011, Rifr, Tcr
Xcc 8004 harboring plasmid pLgus3011, Rifr, Tcr
克隆质粒, Kanr
Cloning vector, Kanr
pLAFR6含有一个没有启动子的 gus基因, Tcr
pLAFR6 containing a promoterless gus gene, Tcr
pK18mob含有 XC3011 的启动子区, Kanr
pK18mob containing the promoter of XC3011, Kanr
pLgus 衍生质粒含有 XC3011的启动子区, Tcr
pLgus fused with the promoter of XC3011, Tcr
来源
Source or reference
Daniels et al., 1984
本实验室
Our labs collection
本实验室
Our labs collection
本实验室
Our labs collection
本工作
This work
Sch覿fer et al., 1994
本实验室
Our labs collection
本工作
This work
本工作
This work
上游约 500 bp 的 DNA 序列设计，并合成引物
P3011-F/P3011-R (AAAGAATTCCAGGCAGGCCG
TCACGAAGGG/GGGGGATCCCATACCGCACCTC
TTCATTCA)，分别引入 EcoR玉和 BamH玉酶切位点
(下划线部分)。以 Xcc 8004总 DNA为模板，P3011-F/
P3011-R为引物对，PCR扩增目标片段，经 EcoR玉
和 BamH玉酶切后，克隆至载体 pK18mob上，获得重
组质粒 pK3011；测序正确后，经 EcoR玉和 BamH玉
酶切胶回收 XC3011启动子片段，克隆至 pLgus载体
上，获得重组质粒 pLgus3011；将重组质粒 pLgus3011
通过三亲本接合导入 Xcc 8004中，在丰富培养基上
以 Rif+Tc 筛选三亲接合子，提取三亲子质粒，经
EcoR玉和 BamH玉酶切验证和 GUS定性检测验证，
获得 T3SS GUS 报告菌株 8004/pLgus3011。T2SS
GUS报告菌株选取实验室已构建的 XC3563 (xpsD)
Tn5正向插入突变体 038G09，T4SSGUS报告菌株选
取 XC1638 (virB3)的 Tn5正向插入突变体 117H12，对
照选取实验室已构建的看家基因 XC3806 GUS报告
菌株 8004/pLgus3806 (实验室未发表数据)。
336
3.2.3 茁- 葡糖醛酸酶(GUS)活性测定
将 8004/pLgus3011、038G09、117H12和 8004/pL-
gus3806待测 Xcc 菌株过夜培养 16 h后，调整至相
同 OD600值，收集菌体，按 8%分别接种到含梯度金属
离子(0.01 滋mol/L~1 mmol/L)的 10 mL XCM2 培养
基中(同一离子浓度设 3个重复)，以添加相应体积的
ddH2O作为对照，28℃，200 r/min 震荡摇床中培养
20 h后，以对硝基苯基 -茁-D- 葡萄糖醛酸苷(PNPG)
为反应底物测定 GUS活性(Jefferson et al., 1987)，总
GUS 酶活(mg/min伊OD600伊mL)=(OD415-β )伊0.5/(琢伊10伊
0.125伊OD600)，其中，0.5为反应的总体积，即 0.5 mL；
10为反应所需时间，即 10 min；0.125为所用菌液量；
OD415、OD600分别为相应波长的吸收值；琢、茁 为标准
曲线方程式中所测定的系数，琢=0.011 7，茁=0.26。相
对总 GUS活性=添加离子化合物实验组总 GUS活
性 /未添加离子化合物对照组总 GUS活性，相对菌
体密度 =添加离子化合物实验组菌体 OD600/未添加
离子化合物对照组菌体 OD600。
作者贡献
姜伯乐是项目的构思者及负责论文审核；唐江
涛、王成、周乐、韦载娲和付秋霞完成实验设计、实验
研究、数据分析和论文初稿写作；杨丽超和梁晓夏
参与论文修改。全体作者都已阅读、校对全文并同
意论文发表。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目 (31260443,
31060017)、广西自然科学基金项目 (2013GXNS-
FAA019097)和广西大学科研基金项目(DD040077)共
同资助。
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叶分子植物育种曳中文网络版
《分子植物育种》(中文网络版, ISSN 1923-8258)是一本基于同行评审、开放取阅以及在线即时发表的期
刊。主要发表植物育种领域中关于转基因育种与分子标记辅助育种的新知识与先进技术的原始研究论文。
本刊致力于为转基因育种与分子标记辅助育种服务，主要发表在植物育种领域中涉及的分子遗传育种
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物育种领域中具有创新意义的最新研究，特别是转基因、分子遗传学、作物 QTL分析、种质资源的遗传多样
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