全 文 ：西北农业学报　2008 , 17(2):142-146
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
6种葫芦科瓜类蔬菜亲缘关系的 RAPD分析＊
付颖颖 , 葛　蔚 , 朱新产＊
(青岛农业大学生命科学学院 ,山东青岛　265200)
摘　要:以 6 种葫芦科(Cucurbitaceae)瓜类蔬菜为试验材料 , 优化基因组 DNA 提取条件 , 用 RAPD 技术分析
不同瓜类蔬菜基因组 DNA 的遗传多样性。结果表明:改良 SDS 法和改良 CTAB法均能成功提取 DNA , 后者
提取的 DNA 产量高 ,纯度较好 , 适合遗传多样性研究。用 60 条随机引物进行扩增筛选 ,有 8 条引物扩增条
带清晰 ,呈现多态性 , 共扩增出 94 个条带 , 大小为 200～ 3 000 bp。 RAPD104 软件显示:苦瓜与丝瓜 、黄瓜 、茭
瓜 、南瓜和佛手瓜的成对遗传距离指数分别为 0.4393 , 0.4583 , 0.6000 , 0.5735 , 0.7306。 NTSYS- PC 程序的
UPGM A 聚类分析表明:同属的南瓜和茭瓜亲缘关系最近 ,其次是苦瓜与丝瓜;苦瓜与黄瓜亲缘关系较近 , 与
南瓜和茭瓜较远 ,与佛手瓜亲缘关系最远。
关键词:葫芦科瓜类;基因组 DNA;RAPD;亲缘关系
中图分类号:Q789;S642　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2008)02-0142-05
Study on the Genetic Relationship of 6 Gourd
Vegetables in Cucurbitaceae by RAPD
FU Ying-ying , GE Wei and ZH U Xin-chan＊
(C ollege of Li fe S ciences , Qingdao Agricul tu re University , Qingdao Shandong　265200 , C hina)
Abstract:To tal DNA was ex tracted f rom 6 kinds o f g ourd vegetable in Cucurbitaceae and the different
e xt ract ion methods were compared , which tried to f ind out the optimum me thod of thei r genomic total
DNA ex traction;Random amplified po lymo rphic DNA (RAPD)technique w as used in analyzing the
biolo gical gene tic dive rsity of these gourd vegetable s.T he result indicated that the improved SDS
method and the improved CTAB method could successfully ex t ract DNA , then regardless of the quali-
ty and the quantity o f DN A , the improved CTAB method surpassed the improved SDS method , which
quali ty o f DNA was sui table for RA PD analy sis.8 clearly expanded bands we re go t by DNA amplifica-
tion using 60 arbi trary primers.94 DNA bands w ere amplified.The molecular size of the f ragments
ranged from 200bp to 3000bp.A nalyse o f the RAPD104 show ed that:the Pairw ise genetic distance
between Momordica charant ia L and Lu f f a cy lindrical Roemer w as 0.4393;Momord ica charantia L
and Cucum is sativus L w as 0.4583;Momordica charantia L and C.pepo.L w as 0.6000;Momord ica
charantia.L and C.moschat was 0.5735;Momordica charant ia.L and S.edule was 0.7306.The N T-
SYS-PC(Version2.10e)showed that the C.moschat and S.edule that belonged to Cucurbita linn was
the most related , while the M.charant ia.L and Lu f f a cy l indrical Roemer w as the least.M.charan-
tia L.was mo re related wi th C.staivus than C.moschat and S.edule.
Key words:Gourd vegetable in cucurbitaceae;Genome DNA;RAPD;Genetic relationships
　　植物界中的葫芦科(Cucurbitaceae)约有 126 属 ,900多种 ,多数分布于亚热带和热带地区 ,少
＊收稿日期:2007-08-20　　修回日期:2007-10-29
作者简介:付颖颖(1983-),女 ,山东济南人 ,硕士研究生 ,主要从事苦瓜生物活性方面研究。 E-m ail:xianbing83920@126.com
＊通讯作者:朱新产。 xczhu321@t om.com or x czhu321@126.com
数分布于温带。我国有 32属 、约 160种 ,主要分
布于秦岭 、长江以南 ,少数种散布到黄河以北地
区。葫芦科是世界上最重要的食用植物科之一 ,
除主要作为蔬菜或水果之外 ,许多种类还具有重
要的经济或药用价值 ,如雪盒子草 、木鳖子等 。其
中苦瓜是葫芦科中一种比较特殊的瓜类蔬菜 ,除
具有丰富而全面的营养价值外[ 1] ,还具有较高的
药用价值 , 《本草纲目》中记载 ,苦瓜“味苦 、甘 、无
毒 ,能除邪热 ,解劳乏 ,清心明目 ,益气壮阳” ,因其
亦食亦药的特性 ,深受人们的喜爱。作为一种历
史悠久的药食两用的蔬菜 ,长期以来苦瓜在中医
药领域有着广泛的用途。
20世纪 90年代发展起来的 RAPD , RFLP 等
技术已经普遍应用在植物遗传资源的评价 、物种
识别 、进化关系的确立 、种间遗传分化和全局生态
学研究中[ 2] 。我国葫芦科瓜类品种资源丰富 ,因
各地消费习惯不同 ,其品种间形状差异也较大。
目前 ,对它们的分类主要是从形态学上进行的 ,有
关利用分子标记技术对葫芦科瓜类进行分类的报
道很少 ,尚未见到关于利用 RAPD技术对苦瓜进
行分类的国内报道[ 3] 。本试验旨在应用分子标记
技术进行 6种葫芦科瓜类蔬菜种质资源鉴定和亲
缘关系分析 ,以期为葫芦科种质资源研究提供相
关的遗传背景资料和科学理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
挑选生长整齐一致 、健壮新鲜的苦瓜 ,黄瓜 ,
丝瓜 ,茭瓜 ,南瓜和佛手瓜 ,采集幼嫩组织 ,液氮速
冻 ,备用提取基因组 DNA 。
1.2　方法
1.2.1　DNA 的提取　改良 CTAB法:参照张菊
平 ,张长远 ,张树珍[ 4] 所述方法 。改良 SDS 法:冷
冻保存的嫩种组织匀浆 ,转入 1.5 mL 离心管 ,加
入 600 μL DNA 提取液(Tris 0.2 mo l/L , NaCl
0.25 mol/ L , EDTA 0.025 mo l/L , SDS 0.5%,
pH8.3), 充分混匀 3 ～ 5 min 后 , 加入 300 μL
60℃的热饱和酚 ,混匀后 12 000 r/min 离心 15
min。取上清液加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)
抽提液抽提 , 离心 。上清液加等体积的醋酸钠
(0.05 mol/ L , pH 5.2)和 1/2 体积的异戊醇沉
淀 ,倒置混匀 ,离心 。沉淀用 70%的乙醇洗涤 2
次 ,95%乙醇洗涤 1次后 ,冷冻保存 。
1.2.2　样品检测　提取的DNA用 TE Buffer适
度稀释 ,经 GenQuant pro DNA/RNA Calculato r
(amersham phamacia)仪检测 ,估算 DNA 的质量
和纯度 ,取 10μL 加入 5 μL Loading buffer进行
琼脂糖凝胶电泳检测[ 5] 。
1.2.3　RAPD扩增　采用美国 M J RESEA RCH
公司生产 PTC-200 PCR仪进行 RAPD 扩增 ,筛
选优化的扩增体系为:10 ×buffer (Mg2+)2.0
μL , dN TPs 1.5μL , 引物0.5μL , 模板 0.5 μL ,
Taq DNA聚合酶 0.5μL ,dd H2O 10μL ,总体积
15 μL。扩增循环程序:94℃预变性 5 min ,转入
冰浴 ,加入 Taq酶 ,进行 PCR循环:94℃1 min※
37℃1 min※72℃2 min , 30 个循环 , 72℃延伸 8
min , 0 ～ 4℃保存。
1.2.4　琼脂糖凝胶电泳　取 10 μL 扩增产物 ,加
入 10 μL loading buf fer , 用 1%的琼脂糖凝胶 ,
TAE Buffer ,5 mA/cm 电泳 1 ～ 2 h , EB染色 ,凝
胶成像拍照记录。
1.3　数据分析
根据 DNA 片段在电场中的迁移率(d)与分
子质量(M)的对数成正比 ,d=klogM ,所以 ,以标
准分子量(M)DL2000作为标记 ,估算扩增片段相
对分子质量大小[ 6] 。用“1”“0”表示扩增片段的有
无 ,编制原始数据矩阵 ,运用 RAPD104软件程序
分析成对遗传距离指数 , NTSYS-PC(Version
2.10e)程序包进行 UPGMA聚类分析。
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA提取方法的比较优选
改良 CTAB法和改良 SDS 法提取的基因组
DNA 均具有典型的天然 DNA 紫外吸收光谱(表
1)。采用改良 SDS 法提取的样品基因组 DNA ,
其 A 260/A 280比值在 2.0 ～ 2.2 之间 , A 260/A 230比
值在 2.0 ～ 2.3 之间 ,表明存在较多的 RNA 杂
质 ,此外 ,改良 SDS法所提取 DNA 的多糖去除不
彻底 ,产品与一团胶状物包埋在一起 ,虽仍然能基
本满足 RAPD的要求 ,但低浓度的 DNA 模板将
导致 RAPD的重复性和稳定性较低 ,有一定的局
限性。改良 CTA B 法所提取的样品基因组
DNA ,A 260/A 280比值在 1.8 ～ 2.0 之间 ,而 A 260/
A 230比值在 1.9 ～ 2.1之间 ,表明改良 CTAB法提
取的 DNA仅含有微量 RNA ,样品较纯 ,可以满
足 RAPD的要求 ,并且在产量方面 ,改良 CTAB
法提取的 DNA 产量较高。
·143·2 期　　　　　　　　　　付颖颖等:6 种葫芦科瓜类蔬菜亲缘关系的 RAPD分析
表 1　两种方法提取的基因组 DNA结果对比
Table 1　Comparison of the genomic DNA extracted using two methods
方法 Method 品种 Species OD230 OD260 OD280 OD260/ 280 OD260/ 230 提取率/(μg/ g)
改良 CTAB C2 0.178 0.362 0.199 1.823 2.033 12.816
Im proved C3 0.463 0.962 0.505 1.904 2.078 10.302
C TAB C4 0.512 1.030 0.527 1.956 2.012 16.768
V5 0.458 0.906 0.477 1.901 1.978 8.742
V6 0.618 1.258 0.685 1.835 2.035 12.450
V7 0.368 0.749 0.401 1.869 2.036 15.412
改良 SDS C2 0.062 0.127 0.060 2.048 2.117 5.618
Im proved C3 0.052 0.104 0.049 2.112 2.000 3.316
SDS C4 0.106 0.236 0.114 2.045 2.215 7.302
V5 0.078 0.161 0.074 2.176 2.064 3.238
V6 0.118 0.245 0.119 2.059 2.076 7.706
V7 0.069 0.143 0.071 2.014 2.072 5.461
注(Note):C2.苦瓜 M.charan tia L;C 3.丝瓜 L.cyl in dr ica l;C4.黄瓜 C.sat ivus;V5.茭瓜 C.pepo L;V6.南瓜 C.moschat;V7.佛
手瓜 S.ed ule;表 3 、图 8同此。T he same as Fig.8 and T ab le 3.
2.2　两种方法提取苦瓜 DNA的电泳检测
提取的样品 DNA 琼脂糖凝胶电泳图 1 显
示 ,用改良 SDS 法提取的 DNA 电泳条带较弱 ,而
用改良 CTA B 法提取的 DNA 电泳主带明亮清
晰 ,无降解 。两种方法提取的 DNA 片段大小在
23 kb 以上。结果表明改良的 CTAB法提取方法
简单 ,提取的 DNA 质量好 ,产量高 ,多糖去除的
更为彻底 ,更适合作为 RAPD扩增的模板 。
　　M .Marker;1 、3.改良 SDS法;2 、4.改良 CTAB法
M .Marker;1 、 3.Imp roved SDS method;2 、 4.Imp roved
C TAB meth od
图 1　两种方法提取的苦瓜 DNA电泳图
Fig.1　The electrophoretogram of M.charantia L
templates extracted using twoways
2.3　筛选引物的 RAPD扩增
用 60条随机引物对 6 种葫芦科瓜类蔬菜进
行 RAPD 扩增 , 筛选出 8 条随机引物 S1064 、
S1069 、 S1070 、 S1072 、 S1077 、 S2005 、 S2008 、
S2009 ,可扩增出稳定清晰的多态性片段(图 2 ～
7)。共产生94条扩增带 ,片段大小在 200 ～ 3 000
bp之间 ,多态性带有 84条 ,如果以每条 DNA 扩
增带作一位点计 ,则多态位点占总位点的比例为
89.36%(表 2)。
图 2　8个引物对苦瓜 DNA模板的 RAPD扩增
Fig.2　The RAPD of M.charantia L DNA by 8 primers
图 3　8个引物对丝瓜 DNA模板的 RAPD扩增
Fig.3　The RAPD of L.cylindrical
Roemer DNA by 8 primers
2.4　遗传多样性与聚类分析
对葫芦科的 6种瓜类蔬菜进行个体间和属间
的遗传多样性分析 ,由表 3可见 ,茭瓜和南瓜的遗
传距离最近 ,与苦瓜遗传距离最近的是丝瓜 ,遗传
距离最远的是佛手瓜 。
·144· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
图 4　8个引物对黄瓜 DNA模板的 RAPD扩增
Fig.4　The RAPD of Cucumis sativus L.DNA by 8 primers
图 5　8个引物对茭瓜 DNA模板的 RAPD扩增
Fig.5　The RAPD of C.pepo.L DNA by 8 primers
　　M :Mark , S1:S1064 , S2:S1069 , S3:S1070 , S4:S1072 ,
S5:S1077 , S6:S2005 , S7:S2008 , S8:S2009
图 6　8个引物对南瓜 DNA模板的 RAPD扩增
Fig.6　The RAPD of C.moschat DNA by 8 primers
图 7　8 个引物对佛手瓜 DNA模板的 RAPD扩增
Fig.7　The RAPD of S.edule DNA by 8 primers
表 2　RAPD扩增的引物及扩增结果
Table 2　RAPD primers and amplification results
引物名称
Primer
引物序列
S equence
扩增条袋数
Band
多态带数
Polym orphic band
多态率
Polymo rp hic rate
S1064 AGGGTCGGTC 11 11 100.00
S1069 AGGT CGGCGT 10 9 90.00
S1070 CAAGCGTCAC 12 11 91.67
S1072 AGTGT AGCCC 12 12 100.00
S1077 CAGCGG TCAC 13 10 76.92
S2005 TGCGTT CCAC 14 12 85.71
S2008 CCACAGCCGA 11 9 81.82
S2009 GGAACTCCAC 11 10 90.91
总数 T otal 94 84
平均 Mean 11 10 89.36
表 3　6 种葫芦科间的相似系数(对角线以上)和遗传距离(对角线以下)
Table 3　Interpopulation genetic similarities(the up right of matrix)and distance
(the down-left of matrix)in the six species of Cucurbitaceae
供试材料 Material C2 C3 C4 V5 V6 V7
C2 0.5607 0.5417 0.4000 0.4265 0.2694
C3 0.4393 0.6087 0.5000 0.4868 0.2955
C4 0.4583 0.3913 0.5162 0.4868 0.3182
V5 0.6000 0.5000 0.4838 0.6936 0.3641
V6 0.5735 0.5132 0.5132 0.3064 0.3488
V7 0.7306 0.7045 0.6818 0.6359 0.6512
　　运用 N TSYS-PC(Version2.10e)程序包进行
UPGMA聚类分析。从聚类分析图(图 8)可见 ,
在相似系数为 0.59时 ,6种葫芦科瓜类植物可分
为两大类:苦瓜 、丝瓜 、黄瓜 、茭瓜和南瓜这 5种材
料为第一类 ,佛手瓜单独为另一类。在相似系数
为 0.73 时 ,第一类的物种植物材料又分为两大
类:苦瓜 、丝瓜和黄瓜为第一类 ,茭瓜和南瓜为第
二类 。由此可见 ,茭瓜和南瓜属于同一个属 ,表现
为它们的亲缘关系最近 ,最先聚到一起 。苦瓜 、丝
瓜 、黄瓜和佛手瓜属于不同属 ,苦瓜和丝瓜具有较
·145·2 期　　　　　　　　　　付颖颖等:6 种葫芦科瓜类蔬菜亲缘关系的 RAPD分析
近的亲缘关系 ,仅次于茭瓜和南瓜 ,这与形态学分
类结果基本一致 。
图 8　6 种葫芦科植物的 UPGMA聚类图
Fig.8　Dendrogram of six species of
Cucurbitaceae using UPGMA
3　讨论
SDS法和CTAB法是提取 DNA的两种主要
方法 。CTAB 法是较为经典的方法 ,对含糖量较
高的材料尤为有效;SDS 法是最基本常用的方
法。本研究改进传统的 CTAB法和SDS 法 ,与改
良 SDS法相比 ,改良 CTAB法操作简单 ,操作时
间短 ,且提取的 DNA 产品含量高 ,纯度也高 ,多
糖类物质去除的比较彻底 ,更适于作为 RAPD扩
增的模板 ,因此改良的CTAB较 SDS法更具实用
性。
基因组DNA 的提取是 RA PD扩增能否成功
的关键 ,尽管 RA PD扩增对 DNA 模板的要求不
是很高。实际上 ,影响 DNA 扩增的因素往往不
是去除不彻底的蛋白质和 RNA ,而是多糖和酚类
物质[ 7] 。由于本试验所选的植物材料均含糖量较
高因此应优先使用 CTAB 法。
RAPD 标记被广泛用于物种间亲缘关系研
究 ,是因为 RAPD 分析中供选用的随机引物较
多 ,可对基因组进行地毯式多态性分析 ,能够充分
展示个体间的细微差异 ,可以有效区分近缘物
种[ 8] 。本研究对与苦瓜亲缘关系较近的另外 5种
葫芦科瓜类蔬菜进行 RAPD分析。从 60条随机
引物中选取了 8 条随机引物 ,检测出 94条带 ,多
态性条带 84条。聚类结果表明苦瓜和丝瓜的亲
缘关系最近 ,其次是黄瓜 ,而与佛手瓜关系最远。
另外 ,同属的茭瓜和南瓜亲缘关系最近 ,与苦瓜较
远。这与形态学分类结果是一致的 。苦瓜 、黄瓜 、
丝瓜均属南瓜组葫芦亚族 ,茭瓜和南瓜属于南瓜
族南瓜亚族南瓜属 ,而佛手瓜属于佛手瓜族佛手
瓜属 。
近年来 ,我国葫芦科瓜类品种生产发展迅速 ,
栽培面积逐年扩大 ,已成为很有发展前途的瓜类
蔬菜 。我国的葫芦科瓜类品种资源丰富 ,但目前
对其分类研究仅仅局限在分类学中[ 9] 。本研究从
DNA 水平上进一步验证了我国葫芦科瓜类种质
资源丰富的遗传多样性 ,为今后在分子水平进行
葫芦科瓜类品种鉴定 、种质资源的育种及亲缘关
系分析等深入研究提供了实用的科学依据。
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