全 文 ：基因组学与应用生物学，2011年，第 30卷，第 5期，第 577-582页
Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.5, 577-582
研究报告
A Letter
十字花科黑腐病菌 hrpG基因原核表达
冯国芳 1,2 袁夏莹 1,2 陆光涛 1,2*
1广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530005
*通讯作者, lugt@gxu.edu.cn
摘 要 在十字花科黑腐病菌(Xcc)中，hrp基因对寄主的致病性和非寄主的超敏反应中起核心作用，而 hrpG
对整个 hrp基因簇起调控作用。HrpG为 OmpR家族的双组分系统感受调控蛋白，含有两个结构域，分别是 N
端 Response_reg和 C端 Trans reg_C。本研究利用表达载体 pQE-30 Xa，成功构建了 HrpG的表达重组子，在
E. coli M15 [pREP4]中进行诱导表达。通过调节诱导温度、IPTG浓度和诱导时间最终确定在温度为 20℃，
IPTG浓度为 0.8 mmol/L，诱导表达 4 h。hrpG基因在宿主细胞 E. coli M15获得高效可溶性表达。目前尚未有
可溶性 HrpG蛋白获得成功表达的报导，本研究中获得 HrpG蛋白在大肠杆菌获得大量可溶性的表达，将为
in vitro研究 HrpG的生理活性，特异的结合位点和调控功能研究打下良好基础。
关键词 十字花科黑腐病菌, HrpG,结构特性,原核表达
Pro karyotic Expression of hrpG Gene from Xanthomonas campestris pv.
campestris
Feng Guofang 1,2 Yuan Xiaying 1,2 Lu Guangtao 1,2*
1 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropi-
cal Agro-bioresources, Nanning, 530005
* Corresponding author, lugt@gxu.edu.cn
DOI: 10.3969/gab.030.000577
Abstract hrp cluster is regulated by hrpG, which plays an important core role in invasion and non-host hypersen-
sitive response to pathogesis host. HrpG is one member of the OmpR family response regulator with two conserved
domains, which are the_reg at N terminal and the Trans reg_C at C terminal, respectively. Architecture character-
istic analysis shows that these two domains are quite different from each other. In this study, we succeed to con-
struct the recombinant plasmid to express the gene of hrpG in E. coli M15 [pREP4], when the sequence of hrpG
gene was inserted into the expression vector of pQE-30Xa. Up to now, there is no report about the expression of
soluble HrpG protein. In order to get the soluble HrpG protein with a higher yield, the reaction of expression of the
hrpG protein was optimized by adjusting the tempreture and the concentration of IPTG and the time for induction
respectively. The result show the best optimum condition for of the soluble HrpG production in supernatant of cell
disrution is induced at 20℃ for 4 h with IPTG concentration 0.8 mmol/L. In summation, we have gotten the solu-
ble expression production of hrpG gene in of E. coli M15 cells, which would provide a groundwork for the studies
of the physiological activity and the specific binding site and the function regulation of HrpG protein.
Keywords Xanthomonas campestris pv. campestris, HrpG, Architecture characteristic, Prokaryotic expression
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30771177)资助
病原菌在进化过程中已经形成过一种复杂机制
来抑制宿主应答和侵染宿主。比较重要的革兰氏阴
性植物病原性细菌有欧文氏菌(Erwinia)、假单胞菌属
致病菌(Pseudomonas syringae)、茄科雷尔氏菌(Ralsto-
nia solanacearum)和黄单胞菌(Xanthomonas)等，它们
的治病机理依赖于一种由 hrp (hypersensitive reaction
and pathogenicity,过敏反应与致病性)基因簇编码的
Ⅲ型分泌系统( typeⅢ protein secretion system, TTSS)
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
(Hueck et al., 1998)。hrp基因簇对于细菌侵染易感染
宿主、在非宿主引发超敏反应(hypersensitive reaction,
HR)起主导作用(Ortiz-Martín et al., 2010)。hrp基因表
达约 20个相关蛋白，9个高度保守 hrp操纵子在上
述菌属和许多人类病原菌如耶尔森菌(Yersinia spp.)、
大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏志贺氏菌 (Shigella
flexneri)和沙门氏菌(Salmonella spp.)等中存在(Cor-
nelis and van Gijsegem, 2000)。对茄科雷尔氏菌 R.
solanacearum GMI1000的研究发现，当其感受宿主信
号后，一个 LuxR/UhpA家族转录激活因子 PrhJ专一
性的参与该菌 hrp 基因簇的表达，该激活途径为
PrhA-PrhR/PrhI-PrhJ-HrpG-HrpB，最终启动 hrp基因
簇的表达(Yoshimochi et al., 2009)；而在水稻白叶枯
病菌 X. oryzae pv. oryzae中 hrpG的表达受 PhoPQ和
RaxRH两个双组份信号转导系统(two-component sig
nal transduction systems, TCSTS)的调控 (Lee et al.,
2008)，在其亲缘很近的水稻条斑病菌 X. oryzae pv.
oryzicola中，hrcC、hrpE和 hpa 3个 hrp基因不受hrpG
和 hrpX的调控(姜佳等, 2009)。cDNA-AFLP技术分
析显示，在辣椒斑点病菌 X. campestris pv. vesicato-
ria中，至少有 30个基因受 hrpG诱导，5个受 hrpG
的抑制(No觕l et al., 2001)。这些研究表明，在不同菌株
中 hrpG的调控存在差异性和复杂多样性。
HrpG属于 TCSTS的 OmpR家族感受调控蛋白
(response regulator, RR)，在水稻条斑病菌 X. oryzae
pv. oryzicola 中，HrpG 首先激活 hrpX 的表达，HrpX
是一个 AraC类型转录激活因子控制操纵子，被激活
后进一步调控 hpaB-hrpF 和无毒基因 (avirulence
gene) avrBs3的表达(Zou et al., 2006)。当然这种调控
模式也存在例外，在十字花科黑腐病菌 Xcc 8004中，
细菌 Zur直接通过 hrpX而不是 hrpG来影响 hrp基
因簇的表达，Zur是调节锌平衡的关键调控因子，与
致病性相关，参与 HR反应(Huang et al., 2009)。
Xcc 8004中 hrp基因簇约为 25 kb，包含 7个操
纵子及位于基因簇之外的 hrpG和 hrpX (Jiang et al.,
2009)。HrpG和 HrpX通过调控一个 marR家族转录
调控蛋白 HpaR (hrp associated regulator)来影响细菌
的致病性、HR 反应及胞外多糖的合成(Zhu et al.,
2000)。而 hrpG点突变以后，会导致辣椒斑点病菌 X.
campestris pv. vesicatoria中 hrp基因簇的组成型表达
(Wengelnik et al., 1999)。多年来，研究人员一直认为，
在接受相应信号之后，hrp 基因簇主要表达和调控
TTSS；但也有研究发现，水稻白叶枯病菌 X. oryzae
pv. oryzae中，HrpG参与Ⅱ型分泌系统的调控(Furu-
tani et al., 2004)，这对于 hrp基因簇的调控机能的研
究提供了一个新的方向。
尽管对于 hrpG的研究已有很多报导，但主要是
关于 hrpG 在 DNA 和转录水平的调控机能，对于
HrpG的蛋白表达和理化性质研究不多，有人对 Xcc
P20H中的 hrpG在 E. coli中进行表达，得到的 HrpG
蛋白为无活性的包涵体，在去除 C端无序区域后，才
表达了 HrpG的可溶蛋白(林宏玮, 1999)。因此，HrpG
研究的瓶颈可能在于 hrpG基因的可溶性表达。Xcc
8004中 hrpG的基因编号为 XC_3077，全长 789 bp。
本文中构建了 hrpG全长基因的表达重组子，在 E.
coli中进行表达，通过优化条件获得非变性的、可溶
性的 HrpG蛋白，这为 in vitro研究 HrpG的生理活
性，特定的结合和调节功能打下良好基础。
1结果与分析
1.1 HrpG蛋白的结构域分析及理化性质预测
hrpG基因的 ORF全长 789 bp，其编码的蛋白由
262氨基酸组成。ProtParam预测显示 HrpG分子量
为 29 kD，平均等电点 pI为 8.1，亲水性为-0.1，为疏
水性蛋白。SMART分析表明，HrpG蛋白含有两个结
构域，分别是 Response-reg和 Trans reg_C结构域。
前者用于接收同源组氨酸激酶的磷酸基团，导致自
身保守 Asp残基磷酸化，引发构象改变启动 C端的
Trans reg_C结合于特定的 DNA序列上而激活转录
(图 1)。进一步分析显示，HrpG的两个结构域的理化
性质差异很大，Response-reg结构域 pI为 5.3，呈酸
性，亲水性为-0.2；而 Trans reg_C结构域的 pI为
10.2，呈碱性，亲水性为-0.1。HrpG这种特殊的理化
性质可能需要独特的结构以保持自身的稳定性，
Scratch Protein Predict 预测显示，HrpG 的 10 个 Cys
残基至少可以形成 4个二硫键，分别为 Cys49-Cys55、
Cys78-Cys94、Cys181-Cys185和 Cys217-Cys262。
1.2 HrpG蛋白表达载体的构建
为获取 hrpG基因的序列，以 XCC8004基因组总
DNA为模板，引物 HrpG-F/HrpG-R进行 PCR扩增。
扩增产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳分析为 804bp (图2)。
图 1 HrpG蛋白的功能结构域分析结果
Figure 1 The conserved functional domains of HrpG
578
纯化 PCR产物和质粒 pQE-30 Xa分别用 BamHⅠ和
HindⅢ进行完成消化，随后利用 T4连接酶将两者连
接重组，将重组质粒转化入 E. coli DH5α感受态细
胞，并通过单菌落 PCR、酶切和测序验证重组子。测
序正确的重组质粒转入 E. coli M15，继而进行 HrpG
蛋白表达。
1.3 HrpG蛋白表达条件优化
1.3.1不同诱导温度对 HrpG的表达的影响
为了优化 HrpG的表达条件，分别设置诱导温度
为 12℃、20℃和 28℃，IPTG诱导浓度为 1 mmol/L，
诱导时间为 5 h，对 HrpG蛋白进行诱导，取细胞破碎
液总蛋白和上清可溶性蛋白进行 SDS-PAGE分析，
结果显示随温度的升高在相同时间内，HrpG的总表
达量持续增加，而上清中 HrpG的含量则先升高后下
降。研究中也发现，当诱导温度<10℃时，HrpG的总
表达量非常微弱，而当温度>37℃时，HrpG的总表达
量下降(图 3)。
温度对细菌的生长影响很大，过低会导致胞内
酶的活性受到抑制，不利于重组蛋白的表达；随着温
度的升高，菌体逐渐恢复生长活性，在适宜的范围
内，HrpG的表达量逐渐增加，在未达到细菌最适生
长温度之前，宿主内 HrpG的表达速率低于最大值，
所以有一部分可以充分正确折叠，形成可溶性蛋白。
温度>37℃时，超过了菌体的适宜生长温度，结果导
致菌体部分酶活受抑制或变性，严重制约了 HrpG的
表达和正确构象的形成，所以 HrpG的表达量无论是
总量还是可溶性蛋白均呈下降趋势。
1.3.2不同 IPTG浓度对 HrpG蛋白表达的影响
为探讨 IPTG溶度对HrpG蛋白表达的影响，分别设
置 IPTG浓度为 0.4mmol/L、0.8mmol/L和 1.2 mmol/L。
诱导温度为 20℃，诱导时间为 5 h，结果表明随着
图 2 hrpG的 PCR扩增
注: M: 100 bp plus DNA Ladder Marker; 1: hrpG扩增产物
Figure 2 PCR amplification of hrpG
Note: M: 100 bp plus DNA Ladder Marker; 1: Amplified prod-
ucts of hrpG
IPTG浓度的升高，HrpG的总表达量增加，而上清中
HrpG含量先升高后下降(图 4)。 IPTG为乳糖类似物，
通过与 lac启动子调节区域的阻遏蛋白结合，导致其
构像改变，解除阻遏作用，启动重组基因的表达。
IPTG浓度过低时，只能部分解除阻遏蛋白的抑制作
用，HrpG的表达受到抑制。随 IPTG浓度的升高，阻
遏蛋白的抑制作用被完全解除，重组蛋白的表达量
升高，但过快的表达速率会影响蛋白的正确折叠，且
IPTG对细胞有毒害作用，浓度过高会抑制细胞生
长。研究中发现，IPTG浓度<0.3 mmol/L时，HrpG几
乎不表达；而 IPTG浓度>1.8 mmol/L时，重组 E. coli
图 3不同诱导温度 HrpG的表达
注 : M: Protein mol/Lecular Weight Marker; A, B, C 分别是
12℃, 20℃, 28℃; 1, 3, 5为细胞破碎总蛋白; 2, 4, 6为上清液
Figure 3 HrpG expression at different tempretures
Note: M: Protein mol/Lecular Weight Marker; A, B, C represents
12℃ , 20℃ , 28℃ respectively; 1, 3, 5 represents total cell pro-
tein; 2, 4, 6 represents the supernant
图 4不同 IPTG浓度 HrpG的表达
注 : M: Protein mol/Lecular Weight Marker; A, B, C 分别是
0.4 mmol/L, 0.8 mmol/L, 1.2 mmol/L; 1, 3, 5 为细胞破碎总蛋
白; 2, 4, 6为上清液
Figure 4 HrpG expression at different IPTG concentrations
Note: M: Protein mol/Lecular Weight Marker; A, B, C represents
0.4 mmol/L, 0.8 mmol/L, 1.2 mmol/L respectively; 1, 3, 5 repre-
sents total cell protein; 2, 4, 6 represents the supernant
十字花科黑腐病菌 hrpG基因原核表达
Prokaryotic Expression of hrpG Gene from X. campestris pv. campestris 579
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
的菌体浓度值 OD600在 6 h内小于 0.7，即菌体生长
受到抑制。
1.3.3不同诱导时间对 HrpG蛋白表达的影响
诱导时间也是影响蛋白表达的一个重要的因
素，分别设置诱导时间为 1 h、4 h和 8 h。诱导温度为
20℃，IPTG浓度为 0.8 mmol/L。SDS-PAGE分析结
果为，随着诱导时间的延长，HrpG的含量逐渐升高，
而延伸至 8 h时，HrpG的含量开始下降。并且随着时
间的延长，至 8 h时上清中 HrpG的含量下降(图 5)。
诱导时间主要和菌体生长环境中营养状况相关。营
养状况丰富是有利于 HrpG的合成，随着时间的延
长，环境中的营养逐渐匮乏，菌体为维持生存将消耗
胞内的重组蛋白；另一方面，经 ProtParam预测表明，
HrpG蛋白降解的半衰期为 3 h，诱导时间过长会导
致合成的 HrpG蛋白的降解，所以，适当的控制诱导
时间对 HrpG的表达是有利的。
图 5不同诱导时间 HrpG的表达
注: M: Protein mol/Lecular Weight Marker; A, B, C 分别是 1 h,
4 h, 8 h; 1, 3, 5为细胞破碎总蛋白; 2, 4, 6为上清液
Figure 5 HrpG expression at different inducing time
Note: M: Protein mol/Lecular Weight Marker; A, B, C represents
1 h, 4 h, 8 h, respectively; 1, 3, 5 represents total cell protein; 2,
4, 6 represents the supernant
图 6 HrpG纯化蛋白
Figure 6 HrpG purification
前对 hrpG的研究主要集中在 DNA和转录水平。而
对于 HrpG的的调控作用方式鲜见报导。究其原因可
能是 HrpG的理化性质的特殊性影响了其重组表达
的可溶性，对 Xcc 8004中的 HrpG进行理化性质预测
表明，其 N端 Response-reg结构域呈酸性(pI=5.3)，C
端 Trans reg_C结构域呈碱性(pI=10.2)，pI相差近 5，
这意味着其酸碱性相差近 5个数量级，这种特殊的
理化性质对于 HrpG的结构稳定性而言，需要特殊的
作用力(如二硫键)来维持。这种结构的特殊性导致了
HrpG在宿主细胞内的可溶性表达存在困难(林宏玮,
1999)。此外这种重组蛋白在宿主内的存在状态与
Xcc 8004中的实际存在状态差异很大。以 E. coli中
的同样是 TCSTS应答调节蛋白 OmpR为例，细胞内
OmpR的分子数量约为 3 500 (Cai and Inouye, 2002)。
因此，HrpG重组蛋白的过量表达可能会导致其以形
成不溶的包涵体。
在实验中，本文作者曾经使用过 pET-30a (+)、
pET-32a (+)和 pGEX-4T-1等表达质粒进行 hrpG的
表达验证，结果发现几乎在任何可能条件下均很难
得到可溶性的 HrpG，究其原因可能是，pET-30a (+)/
pET-32a (+)质粒使用的是 T7启动子，T7启动子是
E. coli表达系统中最强的启动子，T7 RNA聚合酶合
成 mRNA的速率比 E. coli RNA 聚合酶快 5 倍，所
以对于细胞而言，几乎所有的资源都用于表达重组
蛋白，这对于许多重组蛋白的短时大量表达时非常
有利的。但对于 HrpG而言，快速表达该蛋白可能导
致其无法形成正确的结构折叠和二硫键，形成不溶
性的包涵体，这对获得可溶活性蛋白是不利的；pGEX-
4T-1 使用的是 tac 启动子，tac 启动子是一组由 lac
和 trp启动子人工构建的杂合启动子，启动能力比
lac和 trp启动子都强，表达效率非常高，这对 HrpG
表达的影响与 pET-30a (+)/pET-32a (+)质粒相似。而
pQE-30 Xa使用的是 T5启动子，相对而言 T5启动
子的启动效率要弱于 T7 和 tac 启动子，hrpG 的
pQE-30 Xa重组载体表达 HrpG的速率要相对缓慢，
根据以上实验结果，最终确定 HrpG诱导的优化
条件为：诱导温度 20℃、IPTG浓度 0.8 mmol/L、诱导
时间为 4 h。在上述条件下，获得了最大量的可溶性
的 HrpG蛋白，使用 TaKaRa的 His6-Tag蛋白质纯
化试剂盒纯化上清中的 HrpG，进行 SDS-PAGE分析
表明上清液中可溶性 HrpG的表达量很高(图 6)。
2讨论
hrpG基因在整个 hrp基因簇的表达和调控中起
着核心作用，对于 hrpG及相关基因的了解有助于我
们从本质上理解病原菌的致病机理和侵染途径。目
580
这对于 HrpG正确构象的形成和二硫键的配对比较
有利。所以对于重组蛋白而言，尽管使用强启动子能
够促进重组蛋白表达量的增加，但目的蛋白的活性
而言，适当的减缓生成速率有利于其具有活性的构
象的折叠。
本文从诱导温度、IPTG浓度和诱导时间 3个方
面优化了 HrpG的表达。结果表明对于具体的蛋白的
表达，要根据其理化性质选择合适的表达载体，合理
的调整相应条件，才可能获得较好的表达效果。对于
疏水性较强或 pI过酸或过碱的蛋白而言，较弱启动
子的表达载体，较低的诱导温度和 IPTG浓度有利于
可溶的活性蛋白的表达。诱导时间的长短要结合重
组蛋白的半衰期、营养消耗和蛋白毒性等条件进行
合理调整，以期得到最佳的表达条件。
3材料与方法
3.1菌株和质粒
菌株 Xcc 8004，E. coli DH5α、M15 [pREP4]为本
实验室保存；质粒 pQE-30 Xa由中科院微生物研究
所提供。Xcc 8004用 NYGB培养基，E. coli用 LB培
养基，固体培养基加入 1.5%的琼脂。
3.2酶和试剂
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq及 pfu DNA
聚合酶购自 Promega公司；质粒提取试剂盒、胶回收
试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；His6-Tag
蛋白质纯化试剂盒由 TaKaRa公司提供；引物合成及
PCR产物测序由深圳华大基因有限公司完成；氨苄
青霉素(Amp)、IPTG购自 Invitrogen 公司，其它试剂
均为进口或国产分析纯。
3.3蛋白结构分析
XC_3077(hrpG)的 ORF 序列取自 KEGG，蛋白
序列取自 P2CS (prokaryotic 2-component systems)数
据库(http://www.p2cs.org/)。利用 ProtParam和Scratch
Protein Predict 在线工具分析 HrpG 的结构特性；利
用 SMART分析保守结构域。
3.4 PCR扩增
hrpG全长 789 bp，含有一个 NcoⅠ酶切位点，起
始和终止密码子分别是 GTG和 TGA，这种情况在
Xcc 8004基因中比较常见。为便于在 E. coli中进行
表达，在设计 hrpG扩增引物时，去掉起始密码子，并
将终止密码子更换为强终止型的 TAA。以 Xcc 8004
总 DNA为模板，PCR扩增基因序列。所需引物分别
为 F：5-ATAGGATCCATGGACGCCGCTGCGAAT
G-3；R：5-GCGAAGCTTTTAGCAAGCTGCGGTGC
G-3。为了方便进行亚克隆，正向和反向引物 5端分
别引入 BamHⅠ和 HindⅢ酶切位点。PCR扩增条件
为 95℃变性 10 min后，按下列参数进行 30个循环：
95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s。PCR产物用 1.2%琼
脂糖凝胶电泳验证。
3.5表达载体构建
BamHⅠ、HindⅢ双酶切纯化后的 PCR 产物和
pQE-30 Xa质粒 37℃ 4 h，分别纯化后，T4 连接酶
16℃连接过夜；连接产物导入 E. coli DH5α感受态
细胞，涂布 Ampr平板，37℃培养 18 h，挑取单菌落
PCR裂解及酶切验证后，测序其正确性。
3.6重组蛋白表达与纯化
将测序正确的重组质粒转入 E. coliM15 [pREP4]，
于 Ampr的 LB培养基中过夜培养，按 1%接种量接
种至新鲜抗性 LB培养基中培养至 OD600约 0.5时，
加入 IPTG，在一定温度下进行诱导；诱导结束后 4℃，
4 500 r/min离心 10 min收集菌体，用 PBS清洗 3次，
超声波破碎 (程序设置为:震荡 1 s,中止 1 s, 60次循
环)，使用 TaKaRa的 His6-Tag蛋白质纯化试剂盒并
参照其操作说明纯化蛋白，纯化蛋白跑 SDS-PAGE，
考马斯亮蓝染色。
作者贡献
冯国芳构建表达菌株，并进行蛋白表达，查阅资
料并撰写文章；袁夏莹构建表达菌株，并进行蛋白表
达，并帮助修改本文；陆光涛负责课题的选题与实验
过程的全程指导，论文的审核与修改。
致谢
本研究在实验构思方面承蒙广西大学生命科学
与技术学院苏辉昭博士、李瑞芳博士和张文飞博士
的悉心指导，特致感谢！
参考文献
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