全 文 ：研究报告
Research Report
十字花科黑腐病菌中一个与趋化性相关基因的突变分析
丘献娟 1 吴柳 1 陈正培 1 陆光涛 1,2*
1广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 2广西大学亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室,南宁, 530005
*通讯作者, lugt@gxu.cn
摘 要 十字花科作物黑腐病，又称为野油菜黄单胞菌野油菜变种(Xanthomonas campestris pv. campestris,
简称 Xcc)，该细菌是引起十字花科作物等植物发生黑腐病的病原菌，同时该细菌也是人们研究寄主与病原
微生物相互作用的具体分子机理的模式菌之一。在 Xcc 8004菌株基因组中，XC_2304编码的产物为一个
趋化性蛋白。由于细菌的趋化性在病原学方面的意义是非常重要的，为评估 XC_2304的功能，本研究利用
pK18mobSacB对 XC_2304进行缺失突变，获得缺失突变体 DM2304。植株试验发现，突变体 DM2304对寄
主植物的致病力下降约 30%，其互补菌株 CDM2304的致病力基本恢复至野生型水平，这表明 XC_2304与
Xcc致病力有关。利用毛细管法检测 DM2304对 18种物质的趋化性，结果表明突变体对木糖、苯丙氨酸、
精氨酸、蔗糖以及核糖的趋化性比野生型弱。运动性分析发现，DM2304在含有 0.3%、0.6%琼脂的 NYGA
板的游动性稍微降低，表明 XC_2304与游动性有关。而 DM2304的胞外纤维素酶、胞外蛋白酶、胞外淀粉
酶、EPS产量、HR与野生型菌株相比均没有明显差异。本研究为十字花科黑腐病菌中其它与趋化性相关基
因提供实验思路，对病原菌如何趋利避害的机制的研究具有一定的意义。
关键词 十字花科黑腐病菌,趋化性,致病性, XC_2304
Mutation Analysis of a Gene Involved in Chemotaxis in Xanthomonas
campestris pv. Campestris
Qiu Xianjuan 1 Wu Liu 1 Chen Zhengpei 1 Lu Guangtao 1,2*
1 College of life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Sub-
tropical Agro-bioresources, Guangxi University, Nanning, 530005
* Corresponding author, lugt@gxu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.034.001225
Abstract Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) is the causal agent of the black rot disease of cruciferous
crops, and Xcc is a model strain for studying the molecular mechanisms of plant-microbe interactions. According
to the annotation of Xcc 8004 genome, XC_2304 was predicted to encode chemotaxis protein. As the significant of
bacterial chemotaxis in ecology and etiology have been approved, to assess the function of XC_2304 in this work,
XC_2304 was deleted by pK18mobSacB, and the deletion mutant was named as DM2304. Plant test found that the
pathogenicity virulence of DM2304 to the host plants reduce about 30%, and the Complementary strain can restore
its virulence to the wild type level, this result demonstrated that that XC_2304 is related to pathogenicity virulence
of Xcc 8004. The capillary tube method was applied on the chemotaxis analysis, we found that XC_2304 is involved
in the chemotaxis of xylose, phenylalanine, arginine, sucrose and ribose. Motility analysis found that the mutations
of DM2304 results in reducing motility in 0.3% and 0.6% agarose swimming medium, it was showed that XC_2304
is involved in motility. When the mutation of DM2304 compared with the wild-type strain, the extracellular protease,
extracellular cellulase, extracellular amylase, EPS production, HR, biofilm formation and heavy metal resistance,
have no significant difference. This work provide ideas for the study of other genes related with chemotaxis in Xcc
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31160453)资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 6期，第 1225-1231页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.6, 1225-1231
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
and the mechanism of how pathogens avoid disadvantages.
Keywords Xanthomonas campestris pv. Campestris, Chemotaxis, Virulence, XC_2304
十字花科黑腐病菌(Xcc)是一种革兰氏阴性菌，
该细菌能够侵染数百种植物，其中包括许多重要的
经济农作物(Ryan et al., 2011)，造成严重的经济损失。
面对病原菌的威胁，植物也不断的加强自身的防御
机制，从而在寄主防御和病原菌毒力之间形成了微
妙的平衡，最后导致病原菌和寄主植物共同进化。众
所周知，Xcc能够侵染很多十字花科的植物，并导致
植物产生典型的病症，因此该细菌是研究植物与微
生物相互作用的重要模式菌种。随着人们对与 Xcc
相关的科学研究的不断进行，人们对 Xcc导致植物
致病的具体分子机理有了更深层次的理解，为帮助
人们更好地控制植物病害并降低农业经济损失提供
了理论依据。
目前，细菌的趋化性在生态学和病原学等方面
的意义已被人们高度重视，趋化性与细菌的致病性
有着很大的关系。趋化性(chemotaxis)是微生物适应
环境变化的一种基本属性，它具有可以使微生物具
有寻找食源和逃避毒害环境的能力，因而在生存上
具有优势。细菌趋化性使得细菌能够感受营养物质
的浓度梯度以及其它环境刺激(Sourjik, 2012)。细菌
趋化性的研究对于如何有效的控制病原菌对机体的
侵染、如何利用细菌趋利避害的特点治理污染的环
境等方面都具有非常重要的意义。
根据 Xcc 8004 基因组注释，一个编码与趋化
性相关的基因 XC_2304，其开放阅读框位于基因组
2 776 407 bp至 2 778 671 bp的区域，全长 2 265 pb，具
有 HAMP以及 MCPsignal结构域，HAMP结构域对
定位于细胞膜和周质中的感受器甲基化和磷酸化有
重要作用；MCPsignal结构域是甲基受体趋化性感应
蛋白结构域，为了更全面了解 XC_2304的功能，本工
作利用 pK18mobSacB载体，通过同源双交换的方法
构建 XC_2304的突变体，对突变体的表型进行分析，
并对有变化的表型进行功能互补。实验证实了
XC_2304与 Xcc 的致病性相关；XC_2304 与 Xcc 对
一些物质的趋化性相关。
1结果与分析
1.1 XC_2304突变降低 Xcc对寄主的致病
为准确了解 XC_2304的功能，我们构建 XC_2304
的缺失突变体。本工作利用 pK18mobsacB质粒，通过
同源双交换的方法构建无标记的缺失突变体。
pK18mobsacB含 Km抗性基因和 SacB基因。SacB基
因编码蔗糖果聚糖酶，该基因在 Xcc中表达将导致
菌株不能在含 10%蔗糖的培养基中生存，利用蔗糖
培养基筛选出缺失 XC_2304的突变体。本实验通过
PCR 扩增出 XC_2304 基因的上游的大小为 524 bp
同源片段以及其下游的大小为 493 bp的同源片段，
将通过 PCR得到的 DNA片段进行纯化以及酶切后
克隆到 pK18mobsacB自杀质粒的多克隆位点区域相
应的 EcoRⅠ/HindⅢ位点上，获得重组质粒，经过菌
落 PCR以及双酶切验证正确后送去测序。再通过同
源双交换法将 Xcc 8004基因组中的 XC_2304 基因
置换掉，构建出缺失 XC_2304的缺失突变体，PCR
验证正确的突变体记为 DM2304。同样通过 PCR技
术扩增出含有完整 XC_2304基因的同源片段，将获
得的 DNA片段酶切纯化后克隆 pK18mobsacB多克
隆位点区域相应的 BamHⅠ/HindⅢ位点上，从而获
得相应的重组质粒，进行 PCR以及双酶切验证重组
质粒并通过三亲本结合实验将验证正确的重组质粒
导入缺失突变体 DM2304，得到缺失突变体的功能
互补菌，记为 CDM2304。
为了了解 XC_2304是否与 Xcc 8004的致病性相
关，我们进行了致病性实验。本实验进行致病性检测
的植株为满身红萝卜(Raphanus sativus L.Var. radic-
ulus Pers.)。接种的方法分别有压渗法、针刺法、剪叶
法和喷雾法，本试验采取的主要方法是剪叶法。将得
到的野生型菌株 Xcc 8004，缺失突变体 XC_2304，互
补菌株 CDM2304 过夜培养 16 h 后，测量其 OD600
值，用水将菌液稀释至 OD600值为 0.001，用灭菌的剪
刀在距离叶尖顶端约 1 cm处垂直于中轴叶脉慢慢
剪去叶尖。放置于 28℃无光保湿 1 d，然后置于模拟
的自然环境中培养 10 d。
致病性检测结果如图 1所示：对 DM2304和野
生型菌株的两组病斑长度的平均数进行差异显著性
检验可知 DM2304的致病力下降了 30%左右，互补
菌致病性基本恢复至野生型菌株的水平，表明
XC_2304与 Xcc 8004的致病性相关。
1.2 XC_2304突变降低 Xcc细胞的趋化性
细菌的趋化性影响其致病性，因为趋化性的研
究具有重要的意义。本实验运用毛细管法(具体方法请
查阅材料与方法) 事先检测了野生型菌株 Xcc 8004
对一些糖类、氨基酸、盐离子等物质的趋化性，结果
发现野生型菌株对 18种物质(氯化钙,氯化镁,蔗糖,
麦芽糖,乳糖,核糖,果糖,半乳糖,木糖,葡萄糖,甘
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图 1野生型,突变体及互补菌株在的致病性检测
Figure 1 The pathogenicity activates of the wild- type, mutant and
complementary strain
露醇,半胱氨酸,苯丙氨酸,谷氨酰胺,丝氨酸,异亮
氨酸,亮氨酸,脯氨酸)具有比较明显的趋化性。为了
探索 XC_2304对细菌的趋化性有何影响，将得到的
野生型菌株 Xcc 8004，缺失突变体 XC_2304，互补菌
株 CDM2304过夜培养 16 h后，测量其 OD600值，调
菌液的 OD600值为一致后进行趋化性检测。结果显示
XC_2304突变体对木糖、核糖、蔗糖、苯丙氨酸以及
精氨酸的趋化性与野生菌菌株对这些物质的趋化大
幅度降低，其互补菌株能恢复至接近野生型菌株的
水平。而 XC_2304的缺失不影响病原菌对其它 13种
物质的趋化性。实验表明 XC_2304与木糖、苯丙氨酸、
精氨酸、蔗糖的趋化性相关。实验结果如图 2所示。
1.3 XC_2304突变降低细胞的运动性
致病菌的运动性会影响其致病能力。大多数细
菌在液体环境下的运动主要受端生鞭毛的影响，而
在固体或者半固体表面等粘性比较大的环境的运动
比较复杂，需要侧生鞭毛或者周生鞭毛的参与。本实
验通过调整培养基中的琼脂浓度，改变细菌接触的
环境的粘度，检测细菌的在不同条件下的运动方式，
图 2野生型,突变体及互补菌株在的趋化性检测
Figure 2 The chemotaxis activates of the wild-type, mutant and
complementary strain
本实验用含有 0.3%、0.6%和 1%琼脂的 NYGA平板
分别检测细菌的游动性、泳动性以及蠕动性。将得到
的野生型菌株 Xcc 8004，缺失突变体 XC_2304，互补
菌株 CDM2304过夜培养 16 h后，测量其 OD600值，
调菌液的 OD600值为一致后，吸取 2 μL菌液分别接
种到含有 0.3%、0.6%和 1%琼脂的 NYGA 平板上，
28℃静置培养 3 d后，比较菌落直径大小。实验结果
如图 3所示 DM2304在含有 0.3%和 0.6%琼脂糖的
NYGA平板上的菌落直径较野生型小一些，而其互
补菌株能恢复至接近野生型菌株的水平，实验结果
表明 XC_2304影响 Xcc 8004的游动性以及泳动性。
DM2304在含有 1%琼脂糖的 NYGA平板的游动性
与野生型菌株基本一致，说明 XC_2304不影响 Xcc
8004的蠕动性(图 3)。
1.4 XC_2304突变体减缓细胞的生长
为了了解 XC_2304是否影响细胞的生长，本实
验用基本培养基 MMX在体外模拟细菌在植物体内
的环境，检测 XC_2304突变体是否影响细胞在寄主
植物体内的生长繁殖。本实验检测了野生型菌株
Xcc 8004，缺失突变体 XC_2304，互补菌株CDM2304
在基本培养基MMX以及丰富培养基 NYGA的生长
情况进行了检测。将待测过夜培养 16 h后，测量其
OD600值，调菌液的 OD600值为一致后，用移液器吸取
图 3野生型,突变体及互补菌株在的游动性检测
注: A:野生型菌株 Xcc 8004, DM2304, CDM2304分别接种在
含 0.3%琼脂的游动板上; B:野生型菌株 Xcc 8004, DM2304,
CDM2304分别接种在含 0.6%琼脂的游动板上; C:野生型菌
株 Xcc 8004, DM2304, CDM2304分别接种在含 1%琼脂的游
动板上
Figure 3 The motility activates of the wild type, mutant and com-
plementary strain
Note:A:Thewild type strain, DM2304, CDM2304was respectively
innocated in 0.3% agar swimming medium; B: The wild type strain,
DM2304, CDM2304 was respectively innocated in 0.6% agar
swimming medium; C: The wild-type strain, DM2304, CDM2304
was respectively innocated in 1% agar swimming medium
十字花科黑腐病菌中一个与趋化性相关基因的突变分析
Mutation Analysis of a Gene Involved in Chemotaxis in Xanthomonas campestris pv. Campestris 1227
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
2 μL菌液分别接种至不含任何抗生素的MMX板以
及 NYGA板上，放置于 28℃倒置培养 2 d。实验结果
如图 4所示，在相同的时间里 DM2304在 NYGA平
板上的生长情况与野生型菌株 Xcc 8004 的生长情
况没有明显的差异；DM2304在MMX平板上的生长
比野生型菌株缓慢，其互补菌株 CDM2304能恢复至
接近野生型菌株的水平，表明 XC_2304突变后影响
细胞的正常生长繁殖，XC_2304突变体减缓细胞的
生长，XC_2304突变体不是营养缺陷型突变体。
XC_2304突变体 MMX培养基在的生长比野生
型菌株缓慢，为了了解 XC_2304突变体MMX培养
图 4野生型,突变体及互补菌株在 NYGA和 MMX固体培养
基中的生长
注: A:野生型菌株 Xcc 8004, DM2304分别接种在 NYGA平
板上,培养 3 d; B:野生型菌株 Xcc 8004, DM2304, CDM2304
分别接种在MMX平板上,培养 3 d
Figure 4 Growth of tthe wild type, mutant and complementary
strain in NYGA and MMX solid medium
Note: A: The wild type strain, DM2304 was respectively innocated
in NYGA medium and obseved three days later; B: The wild type
strain, DM2304, CDM2304 was respectively innocated in MMX
medium and obseved three days later
液在的生长是否也比野生型菌株缓慢。本实验对菌
株的在MMX培养液以及 NYGB培养液的生长情况
进行了检测。将得到的野生型菌株 Xcc 8004，缺失突
变体 XC_2304，互补菌株 CDM2304过夜培养 16h后，
测量其 OD600值，调菌液的 OD600值为一致后，将 Xcc
8004、DM2304、CDM2304 按 1%的接种量接种于
NYGB培养液中，而MMX培养液按 10%的接种量，
接种结束后培养一段时间，细菌的培养结束后以时
间为横坐标，以 OD600为纵坐标作图。实验结果如
图 5 所示，DM2304 在丰富培养液的生长情况与野
生型菌株 Xcc 8004 基本一致而 DM2304 在基本培
养液的生长曲线在适应期时间比野生型菌株长，即
DM2304的生长比野生型菌株缓慢，而互补菌株能基
本恢复至野生型水平。XC_2304突变体在 MMX固
体培养基和 MMX液体培养基的生长都比野生型菌
株缓慢，表明 XC_2304的缺失减缓细胞生长，降低细
菌的生长繁殖能力。
2讨论
2.1 DM2304突变体降低致病性的分析
在本工作中，当 XC_2304基因缺失后，突变体的
致病力下降约 30%。其致病性降低的原因可能有：第一，
XC_2304与细菌的生长繁殖相关。突变体在 MMX
培养基中生长缓慢，而 MMX是体外模拟植物内环
境，因菌落生长数量低导致了致病力低；第二，
图 5野生型,突变体及互补菌株在 NYGB和MMX液体培养基中的生长
注: A:野生型菌株 Xcc 8004, DM2304按 1%的接种量分别接种在 NYGB液体培养基里; B:野生型菌株 Xcc 8004, DM2304,
CDM2304按 10%的接种量分别接种在MMX液体培养基里
Figure 5 Growth of tthe wild type, mutant and complementary strains in NYGB and MMX liquid medium.
Note: A: The wild type strain, DM2304 was respectively innocated in NYGB liquid medium (1% inoculum amount); B: The wild type
strain, DM2304, CDM2304 was respectively innocated in MMX liquid medium (10% inoculum amount)
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XC_2304的突变影响了细菌的运动性。而细菌的运
动能力影响菌落的扩展最终影响其致病性；第三，
XC_2304的突变影响了细菌对木糖、核糖、蔗糖、苯
丙氨酸和精氨酸的趋化性。植物体内都含有以上几
种物质，而突变体对几种营养物质的趋化性低，最终
可能影响细菌繁殖能力。可能因以上三点原因，最终
导致了突变体的致病性降低。
2.2 DM2304 突变体降低细菌对某些物质的趋化性
的分析
科学研究表明，有些物种的趋化性的模式和大
肠杆菌的模式是非常相似的，其中对大肠杆菌的趋
化性研究得最透彻，在大肠杆菌中受体复合体由连
接蛋白 CheW、甲基趋化性受体(MCP)以及组氨酸激
酶 CheA三种蛋白组成。目前已知在大肠杆菌中存
在 5种不同类型的受体即 Tsr、Trg、Tar、Aer以及 Tap，
不同类型受体负责感受不同化学物的浓度变化，Tsr
受体调节细菌对丝氨酸等氨基酸的感应；Trg受体调
节细菌对核糖和半乳糖的感应；Tar受体调节细菌对
天冬氨酸、谷氨酸和一些糖类等物质的感应；Aer调
节细菌对氧的感应；Tap调节细菌对多肽的感应。李
茹等(2011)根据 KEGG基因组注释，XC_2304与 Tsr
受体相关，而 Tsr受体调节细胞对丝氨酸等氨基酸的
反应。通过实验得知，DM2304降低细菌对木糖、核
糖、蔗糖、苯丙氨酸和精氨酸的趋化性，XC_2304与
木糖、核糖、蔗糖、苯丙氨酸和精氨酸的趋化相关。
DM2304与细菌对苯丙氨酸和精氨酸的趋化相关的
结果与预测的结果是相吻合的，而 DM2304还对木
糖、核糖、蔗糖的趋化相关。分析其原因，可能是
XC_2304不但与 Tsr相关还与 Trg相关，因为 Trg调
节细胞对一些糖类的趋化。而在 8004基因组注释中
与 Trg相关的蛋白还没有，XC_2304 编码产物可能
是一个与其有关蛋白。XC_2304是否还与 Trg相关，
还需进一步的研究。
3材料与方法
3.1菌株和质粒
本研究所用的菌株及质粒见表 1，本研究所用的
引物见表 2。
3.2试剂
质粒提取试剂盒购自 BioFlux。用于本实验 PCR
扩增的 Pfu高保真酶、用于本实验 DNA片段酶切的
来源
Sources
Gibco BRL
company
Daniels et al.,
1984
本研究
This work
Leong et al.,
1982
本实验室
Laboratory
collection
本实验室
Laboratory
collection
本实验室
Laboratory
collection
表 1本研究所用的菌株及质粒
Table 1 The Strains and plasmids used in this work
菌株及质粒
Strains and plasmids
Escherichia coli
DH5α
Xcc 8004
DM2304
质粒
Plasmids
pRK2073
pLAFR3
pK18mobSacB
pK18mob
特征
Characteristics
fhuA2, Δ(argF-lacZ)
U169, phoA, glnV44,
Φ80, Δ(lacZ)M15,
gyrA96, relA1, endA1,
thi-1, hsdR17
野油菜黄单胞菌野
生型, Rifr
Xanthomonas campestris
pv. campestris, Rifr
与 8004一样,但
XC_2304被缺失, Rifr
As 8004, but XC_2304
was deleted, Rifr
三亲本结合试验
的帮助质粒, Tra+,
Mob+, ColE1, Spcr.
Assist conjugation
plasmid, Tra+, Mob+,
ColE1, Spcr
带有启动子的广谱
克隆载体, Tra-, mob+,
Tcr IncP复制子
A broad spectrum
of cloning vector with
promoter, Tra-, mob+,
Tcr IncP replicon
含有 sacB基因的
pK18mob衍生质粒,
Kanr pK18mob derived
plasmid with sacB
gene, Kanr
注: Kmr为卡那霉素抗性; Spcr为壮观霉素抗性; Rifr为利福平
抗性; Tcr为四环素抗性
Note: Kmr is Kanamycin resistance; Spcr is Spectinomycin resis-
tance; Rifr is Rifampicin resistance; Tcr is Tetracycline resistance
限制性内切酶、用于本实验 DNA片段和质粒连接的
T4连接酶和用于本实验相关验证的 Taq酶以及这些
酶对应的 Buffer购自 Promega公司。进行 DNA纯化
回收实验的试剂盒购自天根公司。
十字花科黑腐病菌中一个与趋化性相关基因的突变分析
Mutation Analysis of a Gene Involved in Chemotaxis in Xanthomonas campestris pv. Campestris 1229
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
表 2本研究所用的引物
Table 2 The primers used in this work
引物名称
Name of primers
D2304L-F
D2304L-R
D2304R-F
D2304R-R
C2304F
C2304R
引物序列(5-3)
Primers sequence (5-3)
ACAGTTGAATTC TAG
ATCCTGGCCCTTTGT
ACAGTTTCTAGA GCA
TTTGGTTGAGCAGCG
ACAGTTTCTAGA GCA
CAAAGCCCGCATCTA
ACAGTTAAGCTT TTG
TCCAGCAACACCGAT
ACAGTTGGATCC AAG
ACGCTTCAGAATTT
ACAGTTAAGCTTATA
GCAAAACGCCCCGAC
扩增产物(bp)
Length of amplified
fragment (bp)
524
493
2 450
注:下划线的碱基为引物前的酶切位点序列
Note: The bases of underline are sequence of restriction enzyme
cutting site
3.3引物
本研究所用的全部引物(表 2)全部由北京华大
基因公司进行合成。
3.4菌株及培养条件
本研究使用丰富培养基 NYGB (NYGB每升含酵
母提取粉 3.0 g,甘油 20.0 g,蛋白胨 5.0 g, pH 7.0)对
Xcc进行液体培养。本研究使用NYGA (NYGB+1%琼
脂粉)固体培养基对 Xcc进行固体培养。Xcc的基本
培养基是MMX(MMX每 1L含硫酸铵 2.0 g,柠檬酸三
钠 1.0 g,磷酸二氢钾 6.0 g,葡萄糖 5.0 g,磷酸氢二钾
4.0 g,硫酸镁 0.2 g, pH 7.0)。大肠杆菌的液体培养基
是 LB培养基(LB培养基每 1 L含胰蛋白酶 10.0 g,
NaCl 10.0 g,酵母提取粉 5.0 g, pH7.0)。大肠杆菌的固体
培养基是 LA培养基(LB+1%琼脂粉)。培养基配方参考
文献(杨国奎等, 2014)本实验所用菌株的具体培养条
件及其所用的抗生素请参考文献(谭旖宁等, 2007)。
3.5基因操作
质粒的小量提取技术、限制性内切酶的酶切技
术、DNA的连接、细菌总 DNA的小量快速提取技术
全部按照生产厂家提供的具体方法进行。本实验涉
及的基因测序全部由北京华大基因公司完成。
3.6 DM2304缺失突变体的构建
采用自杀质粒 pK18mobSacB 构建 XC_2304 基
因突变体，具体方法参考谭旖宁等的方法。首先构建
用于同源双交换的中间体。用 Vcetoer NTI 9.0设计
左右臂引物(引物请看表 2)，Xcc 8004总DNA为模板，
进行 PCR扩增。扩增得到的 DNA片段，进行酶切纯
化后，接到 pK18mobSacB。将获得的重组质粒在帮助
菌的作用下导入 Xcc 8004，用含 Rif，Km的 NYGA
平板筛选三亲本接合子，将三亲本接合子培养稀释
后涂板在含 Rif和 10%蔗糖平板上，Km敏感的菌株
即为发生同源双交换的缺失突变体，采用 PCR对所
获得的接合子进行验证，将验证正确的突变体命名
为 DM2304。
3.7 CDM2304互补体的构建
用 Vcetoer NTI 9.0设计互补引物，以 C2304F、
C2304R为引物扩增段包含基因编码区上游和下游
的 DNA片段，酶切纯化后，连接至小载体 pK18mob
上，经蓝白筛并测序正确后，将外源片段进行双酶
切，胶回收后，连接到 pLAFR3质粒上，获得重组质
粒。经蓝白筛并酶切验证正确后，即是互补的中间体
pLATC2304。将 pLATC2304通过三亲本结合导入突
变体 DM2304 内。筛选得到三亲子，将其命名为
CDM2304。
3.8致病性试验
本研究的植株试验为满身红萝卜(Raphanus sativus
L. Var. radiculus Pers.)。本试验采取的主要方法是剪
叶法。待试验的菌株培养过夜后，将待测菌株用
NYGB 丰富培养基过夜摇床培养 16 h 后，测量其
OD600的值。用无菌水将接种菌液稀释至OD600=0.001，
用事先已灭菌的剪刀蘸取用无菌去离子水稀释一千
倍的的菌液，在生长状况几乎一致的健康植株的距
离叶尖约 1 cm处垂直于中轴叶脉的方向剪去叶尖
(约 5 s)。放置于 28℃环境下避光保湿 1 d，然后置于模
拟的自然环境中培养 10 d (保持泥土湿度并将光照时
间设置为 12 h/d)后观察并测量病斑的长度。实验重复
3次，最后用统计学方法进行统计，计算致病力。
3.9趋化性检测
细菌的趋化性通常影响其致病性，本实验运用
毛细管法检测细菌的趋化性，毛细管法的具体操作：
将过夜培养的菌液用 NYGB调节到 OD600值一致，
在毛细管一端吸入趋化物，另一端用封口膜封住，将
含有菌液的注射器插入到毛细管中，28℃培养箱中
水平静置孵育 2 h，将毛细管用灭菌水冲洗一次，折断
并将其中的内含物吹入无菌的 EP管中，稀释 104、105，
1230
取 100 μL涂布于 R 抗性的 NYGA平板，28℃培养
箱中倒置培养 3 d，统计平板上的菌落数。
3.10运动能力的检测
细菌的运动能力影响其致病性。本实验用含有
0.3%、0.6%以及 1%琼脂的 NYGA平板分别检测细
菌的游动性、泳动性以及蠕动性。将过夜培养的菌液
用 NYGB调节为 OD600值一致或，吸取 2 μL菌液分
别接种至含 0.3%、0.6%、1%琼脂糖的 NYGA 平板
上，静置培养 3~5 d观察，照相并记录结果。
3.11突变体营养缺陷型检测
MMX平板与 NYGA平板上的生长检测：将过
夜培养的菌液用 NYGB调节到 OD600值一致。使用
微量移液器吸取 2 μL事先准备好的待测菌液，小心
接种于不含任何抗生素的MMX平板以及 NYGA平
板上，静止数分钟后 28℃倒置培养 2~3 d。以野生型
菌株的生长情况为对照，观察并判断突变体的生长
情况与野生型菌株相比是否存在差异。MMX培养基
上生长曲线的测定：将过夜培养的菌液用 NYGB调
节到 OD600值一致，离心收集菌体，用 MMX培养基
洗一遍菌体，离心收集菌体，再加入等体积的 MMX
培养液吹打混匀菌体。按 10%的接菌量分别接种于
300 μL MMX培养液中，置于生长曲线测定仪器中。
设置每 4 h测定其 OD600值。在生长曲线稳定的时
候，停止读数，并绘制生长曲线。NY培养基上生长曲
线的测定：将过夜培养的菌液用 NYGB调节到 OD600
值一致，按 1%的接菌量分别接种 300 μLNY液体培
养基中，置于生长曲线测定仪器中。设置每 4 h测定
其 OD600值，OD600的大小与菌体的浓度成正比。在生
长曲线稳定的时候，停止读数，并绘制生长曲线。
3.12相关的生物信息学分析
KEGG (http://www.genome.jp/dbget-bin/)、NCBI
(http://www.nibi.nlm.gov/)、SMART (http://smart.embl-
heidelherg.de/)等免费预测基因的生物信息学网站为
人们进行基因的序列比对以及相关结构域分析提供
了新的方法。
作者贡献
本研究在陆光涛教授提供相关的实验设计以及
指导下，主要由丘献娟完成相关实验操作和论文初
稿；吴柳参与部分实验的操作和相关数据的分析；陈
正培对实验提出一些独特的见解并并对论文初稿进
行了修改；陆光涛教授提出宝贵的修改意见并参与
本论文的最终定稿。本研究的全体作者都阅读并同
意最终的论文定稿。
致谢
本研究是在国家自然科学基金项目(31371263)
的支持下完成，衷心感谢参与本研究所有同学，借助
你们的大力支持本研究才得以顺利完成。
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十字花科黑腐病菌中一个与趋化性相关基因的突变分析
Mutation Analysis of a Gene Involved in Chemotaxis in Xanthomonas campestris pv. Campestris 1231