全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ｍａｙ ２０１６ꎬ ３６(５):５７４－５８１
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４０９０５７
杨柳ꎬ 唐云仙ꎬ 廖芬ꎬ 等. 甘蔗茎尖离体培养褐变影响因素及细胞区室结构分析[Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(５):５７４－５８１
ＹＡＮＧ Ｌꎬ ＴＡＮＧ ＹＸꎬ ＬＩＡＯ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐｓ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ[Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６
(５):５７４－５８１
甘蔗茎尖离体培养褐变影响因素及细胞区室结构分析
杨　 柳２ꎬ唐云仙１ꎬ廖　 芬１ꎬ汪　 淼２ꎬ梁永检１ꎬ杨丽涛１∗ꎬ黄东亮２ꎬ李杨瑞１ꎬ ２
( １. 广西大学 农学院ꎬ 南宁 ５３０００４ꎻ ２. 广西农业科学院 甘蔗研究所 /中国农科院甘蔗研究中心 /
农业部甘蔗遗传改良生物技术重点实验室 /广西甘蔗遗传改良重点实验室ꎬ 南宁 ５３０００７ )
摘　 要: 该研究通过综合分析对甘蔗(ＲＯＣ ２２)茎尖离体培养褐变不同条件因素的影响以及褐变细胞区室结
构的变化ꎬ探讨了甘蔗茎尖离体培养褐变的机理机制ꎮ 结果表明:不同芽位茎尖诱导成活率具有明显差异ꎬ随
着芽位的增加ꎬ诱导成活率不断降低ꎻ不同季节取芽对外植体茎尖总酚类物质含量无明显影响ꎻ但不同芽位及
不同催芽天数ꎬ外植体芽的总多酚含量明显不同ꎬ随着催芽天数的增加ꎬ不同芽位的多酚含量呈现由低升高的
趋势ꎻ蔗芽在培养 ４周时多酚含量较低ꎬ适宜进行采芽接种培养ꎻ从褐变甘蔗茎尖的解剖结构变化分析ꎬ褐变
甘蔗茎尖细胞离体培养初期细胞核结构出现变形ꎬ线粒体有肿胀拉长ꎬ部分液泡膜开始分解ꎻ中后期质壁分离
更为严重ꎬ胞质中出现大量溶酶体ꎬ线粒体等细胞器全分解ꎬ细胞膜、液泡膜、核膜、线粒体膜的双层膜结构出
现破损和缺口ꎻ而正常发育的茎尖细胞ꎬ能基本保持细胞核的形态结构ꎬ只有少量的溶酶体出现ꎮ 因此ꎬ可以
推测细胞核和线粒体结构变形以及膜系统的大量破损是甘蔗茎尖培养褐变死亡的原因ꎮ
关键词: 褐变ꎬ 茎尖ꎬ 甘蔗ꎬ 多酚类物质
中图分类号: Ｑ９４２.５ꎬ Ｓ５６６.１　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０５￣０５７４￣０８
Ｃｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｎ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐｓ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＹＡＮＧ Ｌｉｕ２ꎬ ＴＡＮＧ Ｙｕｎ￣Ｘｉａｎ１ꎬ ＬＩＡＯ Ｆｅｎ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｍｉａｏ２ꎬ ＬＩＡＮＧ Ｙｏｎｇ￣Ｊｉａｎ１ꎬ
ＹＡＮＧ Ｌｉ￣Ｔａｏ１∗ꎬ ＨＵＡＮＧ Ｄｏｎｇ￣Ｌｉａｎｇ２ꎬ ＬＩ Ｙａｎｇ￣Ｒｕｉ１ꎬ２
( １. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ / Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ / Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ / Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００７ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｗａｓ ｍａｉｎｌｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｈｉｃｈ ｒｅｌａｔｅ ｔｏ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔ￣
ｍｅｎｔｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｂｒｏｗｎｉｎｇ. Ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｖａｒｉｅｔｙ ＲＯＣ ２２ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ￣
ｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
收稿日期: ２０１４￣１１￣２９　 　 修回日期: ２０１５￣０６￣０１
基金项目: 广西自然科学基金 (２０１２ｊｊＢＡ３０００８ꎬ ２０１３ＧＸＮＳＦＢＡ０１９０６４)ꎻ 广西农科院基本业务费专项(桂农科 ２０１２ＹＺ１４ꎬ 桂农科 ２０１３ＹＱ０９)ꎻ
广西科学研究与技术开发计划项目 (桂科攻 １２２２００９￣１Ｂ)ꎻ 广西“八桂学者”团队项目ꎻ广西甘蔗遗传改良重点实验室开放项目[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ (２０１２ｊｊＢＡ３０００８ꎬ２０１３ＧＸＮＳＦＢＡ０１９０６４)ꎻ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
(２０１２ＹＺ１４ꎬ２０１３ＹＱ０９)ꎻ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｌａｎ(１２２２００９￣１Ｂ)ꎻ Ｔｅａｍ Ｆｕｎｄ ｆｏｒ “Ｂａｇｕｉ” Ｓｃｈｏｌａｒｓ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉꎻ Ｏｐｅｎ Ｆｕｎｄ ｆｏｒ Ｇｕａｎｇｘｉ
Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ]ꎮ
作者简介: 杨柳( １９８３￣)ꎬ男ꎬ安徽宿州市人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物组织培养和甘蔗氮素生理研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙａｎｇｌｉｕｔｉｂｓ＠ １２６.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 杨丽涛ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事甘蔗育种及生理生化研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｉｔａｏ６１＠ ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍꎮ
ａｘｉｌｌａｒｙ ｂｕｄｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅｓꎬ ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｆｒｅｓｈ ｂｕｄｓ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｈｉｇｈ ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｒａｔｅꎬ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｕｄ ｇｏｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅꎬ ｔｈａｔ ｉｓ ｔｏ ｍｅａｎ ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｆｒｅｓｈ ｂｕｄ ｇｅｔ ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅꎻ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｗａｓ ｎｏｔ ｅｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｓｅａｓｏｎｓꎻ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ４
ｗｅｅｋｓ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅꎬ ａｎｄ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｕｄｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍ￣
ｐｏｕｎｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ｔｈｅ ｌｏｎｇｅｒ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｃｅｌｌｓꎬ
ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ２ ｗｅｅｋｓ ａｎｄ ３ ｗｅｅｋｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｃｅｌｌｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｓｉ￣
ｔｉｏｎ ｂｕｄｓꎬ ｗｈｉｌｅ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ４ ｗｅｅｋｓ ａｎｄ ５ ｗｅｅｋｓ ｇｏｔ ｌｏｗ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ ｓｕｇａｒ￣
ｃａｎｅ ａｘｉｌｌａｒｙ ｂｕｄ ｗａｓ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｆｏｒ ４ ｗｅｅｋｓ ｉｓ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｐｅｒｉｏｄ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅꎻ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ
ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｎｏｔ ｅｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｓｅａｓｏｎꎻｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ ｃｈａｎｇｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｘｉｌｌａｒｙ ｂｕｄｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓꎬ ｌｏｗｅｒ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ
１－６ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｕｄｓ ｗｉｔｈ ２ ｗｅｅｋｓ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ３－６ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｕｄｓ ｗｉｔｈ ４ ｗｅｅｋｓ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔ￣
ｍｅｎｔꎻ ｗｈｉｌｅ ｈｉｇｈｅｒ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ １－３ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｕｄｓ ｗｉｔｈ ３ ｗｅｅｋｓ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔ￣
ｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ４－６ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｕｄｓ ｗｉｔｈ ５ ｗｅｅｋｓ ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｓｔｅｍ ｔｉｐｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｅ￣
ｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅꎬ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｆｏｒｍｅｄꎬ ｓｗｏｌｌｅｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｓｔｒｅｔｃｈｅｄꎬ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ
ｖａｃｕｏｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔａｒｔｅｄ ｔｏ ｂｒｅａｋ ｄｏｗｎ ａｔ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｓｔａｇｅꎻ ｍｏｒｅ ｓｅｒｉｏｕｓ ｐｌａｓｍｏｌｙｓｉｓ ａｐｐｅａｒｅｄꎬ ａ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍꎬ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｄｅｃｏｍｐｏｓｅｄꎬ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅꎬ ｖａｃｕｏｌｅ
ｍｅｍｂｒａｎｅꎬ ｎｕｃｌｅａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｒｏｋｅ ｄｏｗｎꎬ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄꎬ ｖａｃｕｏｌｅｓ ｍｉｔｏ￣
ｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｄｅｃｏｍｐｏｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｌａｔｅｒ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｓｔａｇｅ. Ｔｈｉｓ ｆｉｎｄｉｎｇ ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｔｈａｔ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｒｅａｋ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｒｅａｓｏｎｓ ｆｏｒ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｂｒｏｗｎ￣
ｉｎｇ ｔｏ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｂｒｏｗｎｉｎｇꎬ ｓｔｅｍ ｔｉｐｓꎬ ｓｕｇａｒｃａｎｅꎬ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
　 　 近年来ꎬ甘蔗茎尖脱毒健康种苗技术健康技术
得到不断的发展和完善ꎬ已经在世界上主要的甘蔗
种植国家得到普遍的应用( Ｌｅｅ ＆ Ｂｒｅｓｓａｎꎬ ２００５ꎻ
Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌꎬ ２０１０ꎻ 杨柳等ꎬ ２０１１)ꎮ 我国自 ２０ 世纪
８０年代初从巴西引进该项技术ꎬ逐步建立起包括病
原菌的去除(李文凤等ꎬ ２００９)、组织培养快繁(陈
彪等ꎬ ２００１)、病原检测(沈万宽等ꎬ ２００７)、田间扩
繁与栽培(邓展云等ꎬ ２０１０ꎻ 李松等ꎬ ２０１０)为一体
的甘蔗茎尖脱毒健康种苗技术体系ꎬ并成功地推广
应用于我国主要的甘蔗种植区域ꎮ
褐变(又称酚污染或酚害) 也是植物组织培养
过程中致使诱导率较低、生长缓慢的主要因素
(Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌꎬ ２００８)ꎬ严重时会导致培养细胞、组
织、外植体的死亡ꎬ且褐变的严重程度与外植体组织
的基因型、取材部位及生长状态具有重要的关系
(Ｕｃｈｅｎｄｕ ｅｔ ａｌꎬ ２０１１)ꎬ褐变现象产生的主要原因是
因为外植体组织细胞中的 ＰＰＯ(多酚氧化酶)与天
然底物酚产生醌引起的酶促褐变ꎮ 多酚类物质是普
遍存在于正常植物的细胞内ꎬ当组织细胞受到胁迫
时会作为防御物质大量积累ꎻ而在植物组织培养的
过程中剪切外植体是必不可少的步骤ꎬ因此ꎬ在酚类
物质会因为外界伤害胁迫而大量积累ꎬ当多酚氧化
酶被激活ꎬ酚类物质被氧化ꎬ产生醌类物质ꎬ使植物
组织变褐并产生毒害作用ꎮ 由于植物组织培养过程
中褐变普遍存在ꎬ有关褐变的控制方法也有大量的
报道ꎬ主要的控制方法总体可以分为两种:培养基中
添加抗氧化剂物质(抗坏血酸、抗褪黑素、柠檬酸
等)来减少酚类物质的氧化ꎻ培养基中添加强吸附
剂(活性炭、聚乙烯比咯烷酮 ＰＶＰ、高分子吸附树脂
等)(Ｐｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌꎬ １９９８)ꎮ 在这两种方法基础上增加
转接继代的频率也是有效控制褐变的重要措施ꎮ 也
有报道指出培养基中添加苯丙氨酸解氨酶(ＰＡＬ)抑
制剂 ２￣氨基茚磷酸(ＡＩＰ)可以有效地降低培养组织
中多酚类物质的合成ꎬ从而降低外植体培养的褐变
程度(Ａｎｄｒｅｗ ＆ Ｐｒａｖｅｅｎꎬ ２０１３)ꎮ
褐变也是甘蔗组织培养过程中的重要限制因
素ꎬ特别是在甘蔗茎尖离体诱导培养阶段ꎬ褐变会导
致茎尖诱导出苗率降低ꎬ或者直接导致组织死亡ꎮ
褐变死亡是导致甘蔗茎尖离体培养的诱导成活率较
低的主要原因ꎮ 目前针对甘蔗茎尖离体培养茎尖褐
变ꎬ主要是通过培养基中添加强吸附剂、抗氧化物
质、增加转接继代频率等措施来降低褐变危害ꎬ并取
５７５５期　 　 　 　 　 　 　 　 杨柳等: 甘蔗茎尖离体培养褐变影响因素及细胞区室结构分析
得了一定的效果ꎮ 防止褐变最常用的就是添加吸附
剂或褐变抑制剂ꎮ 如黄诚梅等(２００４)的研究表明ꎬ
甘蔗茎尖组织预先在无菌水中浸泡 ３０ ｍｉｎ ꎬ再接种
到 ６￣ＢＡ ２.０ ｍｇ􀅰Ｌ￣１、ＮＡＡ ０.１ ｍｇ􀅰Ｌ￣１ ＭＳ 培养基
中ꎬ可减轻外植体的褐变ꎻ茎尖诱导培养基中直接附
加适量的活性炭(ＡＣꎬ以 ０.０２％为宜ꎬ最高不超过
０.０５％)ꎬ减轻茎尖组织酚害的效果最理想ꎮ 另外ꎬ
在培养基中附加抗氧化剂 (如聚乙烯吡咯烷酮ꎬ
ＰＶＰ)ꎬ或根据外植体的褐变情况及时转移到新鲜的
培养基中ꎬ均能减轻甘蔗茎尖组织的酚害ꎮ 贤武等
(２０００)认为液体滤纸桥震动培养效果最好ꎬ褐变最
轻ꎬ茎尖存活数多ꎬ丛芽诱导率高ꎮ 这是因为液体培
养有利于外植体周围的有害物质扩散ꎬ减少了对外
植体的毒害ꎮ 另外在防止褐变中多次转接也可以减
轻褐变ꎬ但此方法需要耗费大量的物力和人力ꎮ 但
有关茎尖褐变的影响因素分析以及褐变机理的研究
较少ꎬ因此ꎬ本研究主要是通过对茎尖离体培养褐变
不同条件因素的影响以及褐变细胞区室结构的变化
观察的综合分析分析ꎬ探讨甘蔗茎尖离体培养褐变
的机理ꎬ以期为提高甘蔗茎尖离体培养诱导成活率
提供理论支持ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 材料
甘蔗品种为 ＲＯＣ ２２ꎬ试供材料均来源于广西农
科院甘蔗研究所试验基地ꎮ 试验材料主要用于进行
恒温催芽和茎尖离体培养试验ꎮ
１.２ 方法
取单芽时期为春季(３月)、夏季(６月)、秋季(９
月)、冬季(１２月)ꎻ以＋１叶芽位为 １ 位芽ꎬ依次往基
部方向取 ３、５、７ 位芽ꎬ单芽蔗茎长度为 ５ ｃｍꎬ进行
恒温 ３８ ℃培养ꎻ恒温培养催芽时间分别设为 ２周、３
周、４周、５周四个处理ꎬ因此本试验设计为三因素四
水平试验(表 １)ꎬ试验设计参照正交表 Ｌ１６(４＾３)ꎬ
共计 １６个处理组合ꎬ每个处理 １００个芽ꎬ３次重复ꎮ
１.２.１ 诱导成活率的统计　 在不同催芽时间处理结
束后ꎬ取出甘蔗单芽苗ꎬ在超净台剥去甘蔗茎尖ꎬ进
行液体滤纸桥离体培养ꎬ培养基为 ＭＳ ＋ ２ꎬ４￣Ｄ ２.５
ｍｇ􀅰Ｌ￣１ ＋ ＮＡＡ ０.１ ｍｇ􀅰Ｌ￣１＋ 糖 ３０ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ每个处
理 ４０个茎尖ꎬ培养 ３０ ｄ后ꎬ统计诱导成活率ꎮ
１.２.２ ＰＰＯ活性测定　 在不同催芽时间处理结束后ꎬ
取出甘蔗单芽苗 ３０株ꎬ取甘蔗茎尖样品 ０.２ ｇꎬ加入
表 １　 试验处理因素及水平设计
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ
水平
Ｌｅｖｅｌ
因素 Ｆａｃｔｏｒｓ
取芽季节
Ｅｘｐｌａｎｔ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ
ｓｅａｓｏｎ
催芽时间
Ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ
芽位
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｕｄｓ
１ 春季 (３月)
Ｓｐｒｉｎｇ (Ｍａｒｃｈ)
２周 １
２ 夏季 (６月)
Ｓｕｍｍｅｒ (Ｊｕｎｅ)
３周 ３
３ 秋季 (９月)
Ｆａｌｌ (Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ)
４周 ５
４ 冬季 (１２月)
Ｗｉｎｔｅｒ (Ｄｅｃｅｍｂｅｒ)
５周 ７
５ ｍＬ ｐＨ ６.０的磷酸缓冲液ꎬ冰浴研磨ꎬ４ ℃条件下
１２ ０００ ｒ􀅰ｍｉｎ￣１离心 １５ ｍｉｎꎬ上清液为粗酶液ꎮ ＰＰＯ
测定参照何思莲等(２００９)的方法ꎮ
１.２.３ 总酚含量的测定　 多酚提取采用甲醇水溶液
浸提法(Ｇｏｒｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌꎬ ２００４)ꎮ 在不同催芽时间处
理结束后ꎬ取出甘蔗单芽苗 ３０ 株ꎬ取甘蔗茎尖样品
０.２ ｇ研磨ꎬ加入 ２ ｍＬ ４０％的甲醇浸提液ꎬ５５ ℃水浴
浸提 ３０ ｍｉｎꎮ 浸提完毕后ꎬ３ ０００ ｒ􀅰ｍｉｎ￣１离心 １０
ｍｉｎꎬ得多酚粗提液ꎮ 多酚含量测定采用 Ｆｏｌｉｎ￣Ｃｉｏ￣
ｃａｌｔｅａｕ法(Ｐａｓｔｒａｎａ￣ｂｏｎｉｌｌａ ｅｔ ａｌꎬ ２００４)ꎬ以没食子酸
为标准物ꎬ建立标准曲线ꎮ
１.２.４ 超微结构观察　 在立体显微镜下ꎬ剥取出甘蔗
茎尖原生分生组织进行滤纸桥液体离体培养ꎬ对不
同培养天数的逐渐褐变的茎尖材料进行电镜组织观
察ꎬ 连续观察 ３０ ｄꎮ 电镜检测方法如下:将离体培
养茎尖投入 ２.５％ 戊二醛及 ４％甲醛混合固定液固
定１~２ ｈ后用 ２％锇酸作后固定ꎬ ０ ~ ４ ℃下固定过
夜ꎮ 按常规梯度丙酮脱水、环氧树脂包埋、超薄切
片、电镜观察拍照ꎮ
１.３ 数据分析
数据处理用 ＳＰＳＳ １９.０ 统计软件 Ｄｕｎｃａｎ 新复
极差法进行多因素方差分析ꎬ使用 Ｅｘｃｅｌ 软件进行
作图比较ꎮ
２　 结果与分析
２.１ 甘蔗茎尖离体培养褐变影响因素分析
表 ２ 结果显示ꎬ取芽季节对甘蔗茎尖离体培养
诱导成活率(Ｓｉｇ. ＝ ０.１３５>０.０５)、总酚类物质含量
(Ｓｉｇ. ＝ ０.１６２>０.０５)没有显著影响ꎬ取芽季节对多酚
氧化酶活性在 Ｓｉｇ. ＝ ０.０１<０.０５水平上影响显著ꎬ但
６７５ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
表 ２　 甘蔗茎尖离体培养褐变影响因素的总体效应分析
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｐｈｅｎｏｌ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｏｆ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
源
Ｒｅｓｏｕｒｓｅ
因变量
Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ
ＩＩＩ型平方和
Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｓｕｍ ｄｆ
均方
Ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ Ｆ Ｓｉｇ.
校正模型
Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ
诱导成活率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
１ ９１０.３６０ ９ ２１２.２６２ ２４.５３３ ０.０００
多酚氧化酶活性
Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ
１０ ４３９.８３３ ９ １ １５９.９８１ １６.５２９ ０.０００
总酚类物质含量
Ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
７６６ ８２８.１８８ ９ ８５ ２０３.１３２ ９.１３９ ０.０００
截距
Ｉｎｔｅｒｃｒｅｐｔ
诱导成活率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
５８ ６３９.１１０ １ ５８ ６３９.１１０ ６ ７７７.４４７ ０.０００
多酚氧化酶活性
Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ
５５１ ２６５.３３３ １ ５５１ ２６５.３３３ ７ ８５５.０４０ ０.０００
总酚类物质含量
Ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
９ ６２０ ３５６.６８８ １ ９ ６２０ ３５６.６８８ １ ０３１.８８９ ０.０００
取芽季节
Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｓｅａｓｏｎ
诱导成活率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
５１.１５２ ３ １７.０５１ １.９７１ ０.１３５
多酚氧化酶活性
Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ
１ ３１９.５００ ３ ４３９.８３３ ６.２６７ ０.００１
总酚类物质含量
Ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
５０ ５５５.２２９ ３ １６ ８５１.７４３ １.８０８ ０.１６２
催芽时间
Ｐｒｅ￣ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
诱导成活率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
３７８.３２９ ３ １２６.１１０ １４.５７６ ０.０００
多酚氧化酶活性
Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ
７ ３２９.１６７ ３ ２ ４４３.０５６ ３４.８１１ ０.０００
总酚类物质含量
Ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
４３９ ７０３.７２９ ３ １４６ ５６７.９１０ １５.７２１ ０.０００
芽位
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｕｄｓ
诱导成活率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
１ ４８０.８７９ ３ ４９３.６２６ ５７.０５３ ０.０００
多酚氧化酶活性
Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ
１ ７９１.１６７ ３ ５９７.０５６ ８.５０８ ０.０００
总酚类物质含量
Ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
２７６ ５６９.２２９ ３ ９２ １８９.７４３ ９.８８８ ０.０００
表 ３　 甘蔗茎尖诱导成活率影响因素的相关性分析
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
项目 Ｉｔｅｍ 相关性分析Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
诱导成活率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
总酚类物质含量
Ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ
ｃｏｍｐｏｕｎｄ
多酚氧化酶活性
Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ
ａｃｉｔｉｖｉｔｙ
诱导成活率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
Ｐｅａｒｓｏｎ相关性
Ｐｅａｒｓｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ
１ ０.８１８ ０.０２７
显著性(双侧)
Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ (ｂｏｔｈ ｓｉｄｅｓ)
— ０.００１ ０.８５７
在 Ｓｉｇ.<０.０１水平上没有显著影响ꎻ但催芽时间和不
同芽位对甘蔗茎尖离体培养诱导成活率、茎尖多酚
氧化酶活性及总酚类物质含量都有显著的影响ꎮ 茎
尖离体培养诱导成活率影响因素相关分析表明ꎬ总
酚类物质含量与诱导成活率呈显著负相关ꎬＰｅａｒｓｏｎ
相关性系数为 ０.８１８ꎬ显著性 Ｓｉｇ. ＝ ０.０１ꎻ而茎尖诱导
成活率与多酚氧化酶活性也呈负相关ꎬ但相关性不
显著(表 ３)ꎮ
以不同季节采收甘蔗 ＲＯＣ ２２ 为材料ꎬ从叶稍
部下＋１叶的第 １个芽位起ꎬ共选用 ４ 个芽作为外植
体ꎬ即 １ꎬ ３ꎬ ５ꎬ ７ 位芽ꎬ在大棚中催芽ꎬ分别在催芽
１４、２１、２８、３５和 ４２ ｄ 后采集材料ꎬ同时测定茎尖多
酚含量及多酚氧化酶活性ꎬ无菌条件下茎尖离体滤
纸桥接种培养ꎬ３０ ｄ 后统计茎尖离体培养诱导成活
７７５５期　 　 　 　 　 　 　 　 杨柳等: 甘蔗茎尖离体培养褐变影响因素及细胞区室结构分析
率(表 ３)ꎮ
图 １ 结果显示ꎬ不同芽位茎尖诱导成活率具有
明显差异ꎬ随着芽位的增加ꎬ诱导成活率不断降低ꎬ１
位芽诱导成活率最高ꎬ这说明单芽外植体材料组织
越越鲜嫩诱导成活率越高ꎻ在不同季节进行外植体
材料取样对茎尖诱导成活率影响差异不大ꎻ外植体
单芽催芽 ４周后剥取茎尖进行滤纸桥离体培养诱导
成活率较高ꎬ与其他催芽时间相比较差异显著ꎮ
不同芽位在不同催芽培养时间的多酚氧化酶活
性表现不同ꎮ 催芽 １４ ｄ的芽位(１~６)中酶活最低ꎬ
在 ３~６位芽中ꎬ催芽 ２８ ｄ 的酶活也较低ꎻ在第 １ ~ ３
位芽中ꎬ２１ ｄ催芽的酶活最高ꎬ但在第 ４~６ 位芽中ꎬ
则以 ３５ ｄ催芽的酶活最高(图 ２)ꎮ
图 １　 不同条件对甘蔗茎尖离体培养诱导成活率的影响
Ｆｉｇ. １　 Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｅｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ
图 ２　 甘蔗茎尖不同条件下的多酚氧化酶活性变化
Ｆｉｇ. ２　 Ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｈａｎｇｅｓ
ｅｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ
不同季节取芽对外植体茎尖总酚类物质含量没
有明显影响ꎻ但不同芽位及不同催芽天数ꎬ外植体芽
的总多酚含量明显不同ꎬ随着催芽天数的增加ꎬ不同
图 ３　 甘蔗茎尖不同条件下的总酚类物质含量变化
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔ
ｃｈａｎｇｅｓ ｅｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ
芽位的多酚含量呈现由高降低的趋势ꎻ催芽 ２ 周和
３周的芽体所含多酚含量较高ꎻ而催芽 ４ ~ ５ 周的芽
体所含多酚含量则较低ꎬ尤以 ４ 周的芽体最低ꎮ 因
此ꎬ在蔗芽在培养 ４周时期多酚含量较低ꎬ适宜进行
采芽接种培养ꎮ
２.２ 茎尖培养过程细胞组织的形态变化
茎尖培养后按接种后 １ ~ １４ ｄ 分别取样固定材
料ꎬ做电镜切片观察ꎮ 以新鲜外植体材料作正常细
胞对照ꎮ 观察到ꎬ在 １ ~ ４ ｄ 时ꎬ外观看未发现明显
褐变的情况发生ꎮ 从细胞超微结构看ꎬ培养 １ ｄ 内ꎬ
细胞的结构未发现在有明显的变形ꎬ细胞壁的框架
结构仍存在ꎮ 培养 ２ ｄ时ꎬ细胞核结构仍保持完整ꎬ
线粒体结构并未发现变形ꎮ 细胞膜ꎬ液泡膜ꎬ核膜ꎬ
线粒体膜的双层膜结构仍保持完整ꎮ 但从第 ２天开
始ꎬ可以观察到质壁开始分离ꎮ 培养第 ４天后ꎬ细胞
核结构出现变形ꎬ线粒体有肿胀拉长ꎬ部分液泡膜开
始分解ꎮ 培养第 １０ ~ １４ 天后ꎬ茎尖细胞明显褐变ꎬ
细胞核出现变形ꎬ质壁分离更为严重ꎬ胞质中出现大
量溶酶体ꎬ液泡也吞噬一些物质ꎬ空腔的线粒体增
多ꎮ 细胞膜ꎬ液泡膜ꎬ核膜ꎬ线粒体膜的双层膜结构
出现破损ꎬ缺口ꎮ 而正常发育的茎尖的细胞ꎬ还能基
本保持细胞核的形态结构ꎬ只有少量的溶酶体出现ꎮ
培养 ２０ ｄ后ꎬ完全褐化变黑的茎尖细胞ꎬ胞质完全
溶解ꎬ整个细胞只剩下框架ꎬ液泡ꎬ线粒体等细胞器
全分解(图 ４)ꎮ
３　 讨论与结论
甘蔗茎尖离体培养褐变与外植体采集时间、采
集部位、培养基成分及继代转接频率等有重要关系ꎮ
８７５ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
图 ４　 甘蔗 (ＲＯＣ２２) 茎尖培养过程细胞组织结构的变化　 Ａ. 正常细胞ꎻ Ｂ. 培养 １ ｄ细胞ꎻ ＣꎬＤ. 培养 ２ ｄ细胞ꎻ ＥꎬＦ. 培养 ４ ｄ
细胞ꎻ Ｇ. １０ ｄ正常细胞ꎻ ＨꎬＩ. 培养 １０ ｄ褐变细胞ꎻ Ｊ. １４ ｄ正常细胞ꎻ Ｋ. 培养 １４ ｄ褐变细胞ꎻ Ｌ. 培养 ２０ ｄ褐变细胞ꎮ ＣＷ. 细胞壁ꎻ Ｎ. 细
胞核ꎻ ＭＩＴ. 线粒体ꎻ ＭＢ. 溶酶体ꎻ ＭＷ. 液炮ꎻ ＣＹＴ. 高尔基体ꎮ
Ｆｉｇ. ４　 Ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍ ｔｉｐ ｃｅｌｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ　 Ａ. Ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌꎻ Ｂ. Ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ １ ｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎻ
Ｃꎬ Ｄ. Ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ ２ ｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎻ Ｅꎬ Ｆ. Ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ ４ ｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎻ Ｇ. Ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ １０ ｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎻ Ｈꎬ Ｉ. Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ １０ ｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎻ Ｊ.
Ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ １４ ｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎻ Ｋ. Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ １４ ｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎻ Ｌ. Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ ２０ ｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. ＣＷ. Ｃｅｌｌ ｗａｌｌꎻ Ｎ. Ｎｕｃｌｅｕｓꎻ ＭＩＴ.
Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａꎻ ＭＢ. Ｌｙｓｏｓｏｍｅꎻ ＭＷ. Ｖａｃｕｏｌｅꎻ ＣＹＴ. Ｄｉｃｔｙｏｓｏｍｅ.
本研究发现甘蔗外植体的采集时间对甘蔗茎尖离体
培养诱导成活率的具有一定影响ꎬ其中与其他季节
相比夏季采芽茎尖离体培养诱导成活率较高ꎬ但差
异不显著ꎮ 卢文祥等(２００２)研究发现甘蔗外植体
的最佳采集时期是每年 ６－８ 月ꎬ认为此时甘蔗生长
处于拔节期ꎬ而冬季采集的外植体容易褐变且诱导
９７５５期　 　 　 　 　 　 　 　 杨柳等: 甘蔗茎尖离体培养褐变影响因素及细胞区室结构分析
期长ꎮ 本研究发现位于顶部芽位的单芽经催芽后茎
尖离体培养成活率较高ꎬ且受酚害影响较小ꎬ其主要
原因是顶部芽位的多酚氧化酶活性较低ꎬ总酚含量
也较低ꎬ所以受褐变影响较小ꎮ 黄诚梅等(２００４)研
究发现甘蔗外植体的部位在甘蔗组织培养中ꎬ由于
在生长点附近的酚类物质、酶比较多ꎬ所以甘蔗的芽
繁培养的褐变程度远远大于嫩叶的组织培养ꎬ但该
研究并未对不同甘蔗单芽离体培养的褐变影响进行
分析ꎮ 甘蔗腋芽催芽时间对茎尖离体培养诱导成活
率具有重要的影响ꎬ本研究发现催芽 ３ ~ ４ 周后ꎬ进
行茎尖离体培养ꎬ诱导成活率较高ꎮ 以甘蔗腋芽催
芽 ２周后即可进行离体取茎尖进行培养(秦延豪ꎬ
１９９７ꎻ 卢文祥等ꎬ ２００２ꎻ 黄诚梅等ꎬ ２００４)ꎬ但未对
不同催芽时间进行筛选方面的研究ꎮ
本研究发现甘蔗茎尖离体培养诱导成活率与多
酚氧化酶活性也呈负相关ꎬ但相关性不显著ꎬ这可能
与多酚氧化酶在酶促褐变的过程中受到多种因素的
影响有关ꎬ如培养基 ｐＨ 值、光照强度、培养基成分
等ꎬ邻位多酚类物质是甘蔗 ＰＰＯ 的最适反应底物ꎬ
多酚氧化酶活性与 ｐＨ 值之间有很重要的关系ꎬ最
适合反应为 ６.２ꎬ低于 ５.８ 或者高于 ７.０ 时则较稳定
(Ｍａｈｍｕｄ ｅｔ ａｌꎬ ２０１４)ꎻ甘蔗茎尖离体培养条件对其
体内的多酚氧化酶活性也有重要的影响ꎬ如温度过
高、光照过强都会增加 ＰＰＯ 的活性ꎬ从而加速培养
组织褐变ꎬ甘蔗胚性细胞在光照 ２ ５００ ｌｘ 以上时细
胞团表面会出现褐变ꎬ在弱光下易出现绿色芽点
(Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌꎬ ２０１２)ꎻ秦延豪(１９９７)研究表明外源
激素会增加植物组织培养过程中酚害现象的产生ꎬ
这是因为激素有刺激多酚氧化酶活性提高的作用ꎬ
不同激素水平与不同组合产生的褐变程度也不一
样ꎬ褐变最严重的激素组合为 ＢＡ ＋ ＫＴＴꎬ最轻的为
ＢＡ和 ＢＡ＋ＮＡＡꎬ且浓度越低褐变越轻ꎮ
Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ(２０１０)采用固相微萃取技术与硅烷
衍生化法结合气相色谱与质谱联用联用来分析甘蔗
茎尖多酚类物质的种类ꎬ共得到 ６种多酚类物质ꎬ分
别为间丙烯酸苯酚ꎻ３￣(２￣含氧甲基苯酚)￣２ꎬ４￣二甲
基戊醇ꎻ２￣含氧甲基苯酚ꎻ２ꎬ６￣二异丁基￣４￣甲基苯
酚ꎻ４￣４￣亚甲基(２ꎬ３ꎬ６￣三甲基苯酚)ꎻ４ꎬ４￣亚甲基联
苯酚ꎮ 本研究中发现甘蔗茎尖组织中多酚类物质含
量与茎尖离体培养诱导成活率呈显著负相关ꎬ说明
甘蔗茎尖分类物质含量与茎尖褐变具有重要的影
响ꎻ黄诚梅等(２００４)研究发现甘蔗组织培养过程中
外植体中的多酚类物质含量与甘蔗组织培养褐变有
重要的关系ꎬ且发现甘蔗组织培养的外界温度一般
为 ２６~２８ ℃ꎬ多酚类物质含量较低ꎬ可减轻褐变ꎻ印
芳等(２００６)对酚类物质与蝴蝶兰褐变关系的研究
表明ꎬ绿原酸、邻苯二酚、儿茶酚、咖啡酸及没食子
酸、对羟基苯甲酸、香豆酸可能与蝴蝶兰褐变相关ꎬ
苯甲酸对蝴蝶兰褐变影响很小ꎻ 在褐变过程中ꎬ 总
酚含量越高ꎬ 褐变程度越严重ꎮ 许传俊等(２００５)也
认为外植体总酚含量和 ＰＡＬ 活性随褐变程度加重
逐渐增加ꎬ 两者呈现显著正相关ꎮ
从解剖电镜观察结果发现ꎬ甘蔗茎尖离体培养
褐变细胞初期细胞核结构出现变形ꎬ线粒体有肿胀
拉长ꎬ部分液泡膜开始分解ꎻ中后期细胞核出现变
形ꎬ质壁分离更为严重ꎬ胞质中出现大量溶酶体ꎬ液
泡也吞噬一些物质ꎬ空腔的线粒体增多ꎬ细胞膜ꎬ液
泡膜ꎬ核膜ꎬ线粒体膜的双层膜结构出现破损ꎬ缺口ꎮ
而正常发育的茎尖的细胞ꎬ还能基本保持细胞核的
形态结构ꎬ仅少量的溶酶体出现ꎮ 因此ꎬ从解剖的甘
蔗褐变茎尖细胞电镜检测结果ꎬ推测甘蔗茎尖培养
褐变死亡的原因可能与其细胞核和线粒体结构变形
有关ꎬ膜系统的大量破损也是重要原因之一ꎮ
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( 上接第 ５９４页 Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｆｒｏｍ ｐａｇｅ ５９４ )
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１８５５期　 　 　 　 　 　 　 　 杨柳等: 甘蔗茎尖离体培养褐变影响因素及细胞区室结构分析