全 文 ：植物病理学报
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一个用于鉴定十字花科黑腐病菌 型效应物
分泌与转运的报告质粒的构建
成春燕、 杨 威、 甘永亮 、 蒋国风 ’ ， 杨丽超、 阳丽艳、 姜伯 乐
广西大学生命科学与技术学院 ， 南宁 亚热带农业生物资源保护与
利用国家重点实验室 ， 南宁 广西大学林学 院 ， 南宁
摘要 ：通过免疫检测的方法鉴定十字花科黑腐病菌 型效应物的分泌和转运 ， 将 基因克隆至带有 的
载体上 构建带有 和 基因 的报告质粒 并用 已鉴定为 型效应物的 启动子区信号区验
证该报告质粒。 将 三亲导入 和 然后通过 免疫检测 的分泌 结
果在 的胞外蛋 白 中检测到 了 的分泌 而在 ‘ 的胞外蛋 白 中没有检测到
的分泌 。 通过免疫反应定量检测 和 侵染后植物体内 的 含量 结
果发现 侵染后植物体内 的 含量比 ‘ 侵染后植物体内 的 含量高 倍 。
结果表明 报告质粒 能够应用于鉴定十字花科黑腐病菌的 型效应物 。
关键词 ：十字花科黑腐病菌 ； 型效应物 ； ；
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中图分类号 ： 文献标识码 ： 文章编号 ：
收稿 曰期 ： 修回 日期 ：
基金项 目 ： 国家 自然科学基金资助项 目 （ 广西 自 然科学基金资助项 目 （
通讯作者 ： 姜伯乐 ，研究员 ，主要从事植物病原物分子相互作用研究 ； ：
第一作者 ： 成春燕 女 广西南宁人 硕士研究生 主要从事植物病原物分子相互作用研究 ； ： 。
3 期 成春燕 ，等 ：一个用于鉴定十字花科黑腐病菌 型效应物分泌与转运的报告质粒的构建
十字花科黑腐病菌 （ 决 泌和转运 的报道 。 由于 只能用于检测效
’简称 是一种重要的植物病原 应物分泌 只能用于检测效应物转运 ， 因此
菌 ， 能在全 球 范 围 内 侵染 所有 的 十字 花科 植 需稱合这 种方法鉴定 型效应物分泌和转运 。
物 ’ 。 作为 致病因子之一 ， 型效应物通过 本文将 基因克隆至带有 标签的报
直接注人到寄主细胞 内 ， 通过干扰或调节寄 告质粒 上 构建了一个可用于体内体外鉴定
主的正常生理活动 从而弓 起寄主局部或系统抗性 型效应物转运的报告质粒 ，用已确定为 型效应
反应 ’ 。 物的 的启动子信号 区验证该报告质粒 ，
效应物的检测方法分为体 内 （ 和体外 确认其工作正常 可用于体 内体外鉴定
种 。 体内检测是利 用病原菌在非寄主 的 型效应物 。
或抗性寄主的植物组织上诱发过敏反应 （ 反
应 ）或者是利用免疫化学标记方法鉴定效应物的
转运。 据报道 ，无毒蛋白结构域 在含 菌株 、质粒及培养条件
有抗性基因如 上 引起特异 、快 所用難 、质粒见表 大肠杆菌 —速的 反应、到 目前为止 ’ 在 中利用
， 培 养温 度
—作通告蛋白 ， 总共盤了 抓 十字紐黑赫 ■基腦 （效应 它 们 的 基 因为 —
， 培养温度 ， 。 抗生素利福
、 、 、 — 平 （ 肪 ） ， 氨节青霉素 （
、 、 、 、 、 ：疗主 ⋯ 、一
「 ， ， 四环素 （以及 。 通过 反应并不能 ：
，卡那霉素 （定量检测 型效应物 并且无法确定控制的序列定
位 胞内和胞外 ） 在哪里 。 另一种体 内检测 型效 ’
应物的方法是利用百 日 咳博德特氏菌 （ 引物和试剂条件
依赖于钙调素的腺苷酸环化酶 （ 聚合酶购 自 公司 （ 中 国大
结构域作为报告信号 ， 这种体内检测手段更方 连 ） ， 连接酶 、限制性内切酶购 自
便 、灵敏 、且能定量检测 年 公司 （ 中国上海 ） ， 产物纯化 、质粒纯化试剂盒
等 在黄单胞菌 中首次利用该蛋 白成功 和 片段凝胶回收试剂盒均购 自华舜公司 （ 中
鉴定出新的 型效应物 。 随后 ，这个报告系统广泛 国上海 ） ， 、 一 抗辣根过氧化物酶标记
应用于研究植物病原菌的 型效应物的转运与分 山羊抗小鼠 和 均购 自
泌 。 目 前在 兄 、 公司 （ 中国 上海 ） 。 根据 上提供的
和 中 ， 百 日 咳杆菌腺苷酸环化酶基因的核苷酸序列 ，按照
利用这个报告系统已经鉴定出一批效应物 — 。 实验需要设计出引物 和 ，加人酶切
体外检测方法鉴定 型效应物分泌 ’ 就是将 位点 （ 下划线 ） 及保护碱基 ， 引 物序列 ： ：
选效应物基因克隆到表达载体上 ，表达的蛋 白为融 ‘
； ：
合蛋白 带有一个很小的标签 比如 ‘ ‘
在离体培养的条件下 ，利用
检测培养物中 目标蛋白 的存在 。 大多数 型效应
物的体外分泌量很低 ， 利用 体 标准的分子与遗传操作方法按照文献 进行。
外检测 型效应物可 以减少受这种信号检测的限 以质粒 为模板 ， 以 和
制 。 对比以上 种效应物检测方法的特点 ，更快 为引 物对 ， 反应扩增 出 基 因片段 （ 对应
捷 、灵敏度更高的是以 和 作为报告 基因片段 ） ，经 和 双酶切 ，
蛋白 的检测方法 。 迄今为止 ，未见同时利用 克隆至测 序 载体 上 ， 获 得重组 质粒
和 作为报告蛋 白检测 型效应物分 ，送华大基因公司测 序 。 测序无误后 ， 将
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基因片段经 和 双酶切 ，胶 回收 按照 的
后克隆至带有 标签的 上 ，获得报告 使用说明书检测标准样品和待
质粒 。 测样品中 的含量 绘制标准曲线 并按照标
用 和 双酶切 ， 获得 准曲线算出腺苷酸环化酶的活性 。
— 启 动子信号 区片段 ， 胶 回 收后克隆至 检测蛋 白分泌
的 ￡ 和 位点上 ，获得重组质粒
。
细菌胞外蛋白提取方法参见文献 。 细菌
‘
收宙二 妒 、 —本协 从 丨 丨 曰 总蛋白 的提取过程 取少量提取胞外蛋白时离心下将重组质粒 通过二亲接合 ，分别导
苗肚 六士含 立绝 ： 来的菌体 ， 重悬于 中 ， 使用细胞破碎人 和 菌株 在丰富培养基 仅破胞 血 ， 注意冰上操作 并设置 仃 间上分别 以 和 筛选获得二
念 了 歇 ， 以保证蛋 白质的活性 。 破胞结束后离心吸取上清液待用 。 将细菌胞外蛋白 和总
腺苷酸环化酶活性的检测 蛋白进行 凝胶电泳 ，电泳后电转至
样品的制备 使用培养 的甘蓝京丰 膜上 ，用含有 脱脂奶粉的 缓冲液室
号 蛋 白样 品的制备过程 ： 把需要检测 的菌株用 温下封闭 。 吸净封闭液 ， 洗膜 次 ， 每次
在 摇瓶培养 ，使 大于 把 。 加人 ： 稀释的 —抗 孵
稀释菌液到 用去掉针头的注射器压渗 育过夜。 洗膜 次 ， 每巧 成 再加人
约 的菌液到叶片 中 ； 压渗后 收集 稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠
旳叶片 ，置于液氮中赚 等液氣挥发完后 ，加 （ ，室販应 。 次 ，每次 。
人 的 继续研磨 ； 等叶片 加人 的工作液 行显色反应 。
彻底磨碎后 离心 取上清 结果与分析
加入 离心
取上清 用真空冷冻抽干机干燥 ，干燥 报告质粒的构
后置于 保存备用 。 以质粒 为模板 ，以 和
样品 的检测 将样品蛋 白浓度调成一致 ， 为引物对 ， 反应扩增 出 基因 ， 产物预期
3 期 成春燕 ，等 ：一个用于鉴定十字花科黑腐病菌 型效应物分泌与转运的报告质粒的构建
大小为 结果如 图 的泳道 。 将扩增 启动子信号区片段 ，产物预期大小为
出的 基因克隆至 上 获得重组质粒 酶切图谱如图 的泳道 。 胶 回收
酶切验证图谱如 图 的泳道 。 将 启动子区片段 ，将其克隆至报告质粒 上 ， 获
送华大基因公司 测序 测序结果 完全正确 得重组质粒 用 ￡ 和 双酶
结果未显示 ） 。 实验室已构建了带有 的 切 ，产物预期大小为 酶切图谱如图
载体 ’ 胶 回 收 片 段 ’ 克 隆至 的泳道 。 将重组质粒 通过三亲接合 ，的 幼 点上 ’ 获得 重组质粒 分别导人 和 ，在丰 富培养基上
，酶切图谱如 的泳道 ， 。 分别以 和 蹄选三亲接合
报告质粒的验证 子 ，三亲接合子的 验证和酶切验证图谱如 图
用 ￡ 和 双酶切 ，获得 的泳道 。
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腺苷酸环化酶活性检测 显影后 结果如 图 所示 。 的总
标准 曲 线的绘制 参照 蛋白 和胞外蛋 白都能检测 到分泌 号 ’ 而 负 对照
试剂 盒说 明 书 ， 检
‘ 只在 总 蛋 白 中检测 到 分
测 标准品的 吸雑 （表 ，按得到的 泌 ，胞外蛋 白 中未检测到分泌 ，证明报告质粒
数据绘制 标准曲线 （ 图 。
腺苷 酸环化酶活性检测 检测各样 品相应
的 含量 （表 。 结果发现
压渗后 植 物 体 内 含 量 是 °
压渗后植物体 内 含量的 倍 。
证明 报告系统中的 报告蛋 白是可以正
“
常工作的 。 ±
±
±
使用 法定量后 ，各取 蛋 白质样 ±
品上样 ， 电泳后 转膜过夜 ，杂交 —
—
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働
讨论
年 到 年 ， 前人利 用 能 引 起辣 椒
反应的 为报告蛋 白 ， 鉴定 出
了十字花科黑腐病菌中的 个 型效应物 。 近
； 年没有发现关于通过 检测 型效应物的报道 ，
！ 原 因有可能是 型效应物 的分泌量低 〖 以 此方
；
法的灵敏度 ，不足以鉴定出新的 型效应物 。 本文
； 以 和 作为报告基因 ， 可用
， 于检测候选效应物的分泌 可用于检测候选
效应物的转运 ， 通过 和免疫检测
含量的方法体外体 内鉴定 瓜 型效应物 ，
这 种方法灵敏度极高 ， 可 以少受信号弱 、难检测
的 限制 ，使新的 型效应物鉴定成为可能 。
全基醜筛选鉴定 型效应物的研究 ，对于揭
3 期 成春燕 ，等 ： 一个用于鉴定十字花科黑腐病菌 型效应物分泌 与转运 的报告质粒的构建
示植物病原菌的致病机理具有重要意义 。 由于效 ：
应物具有分泌量低 、在基因组中多数冗余 、保守性
不强等特点 ’在基因组时代前期鉴定效应物具有一
定的难度 。 而进入基因组时代后 ， 越来越多的
植物病原菌被全基因组测序 使全基因组鉴定 型 ：
效应物成为可 能 。 目 前 众 的 个菌株 、
和 都相继被测序 ’ 使全基
因组蹄选鉴定迫在眉睫 。 本文构建的报告质粒
为进一步全基 因组蹄选鉴定 的
型效应物提供了有效的工具 。 目前本实验室已
经利用该质粒进行 的 皿型效应物 的全基 咖 ， ：
因组鉴定 ，期望找出更多新的 型效应物 。
参老立献贫 ， 八
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基 因 组学 与 应 用生 物学 ） ，
狂 ：
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责任编辑 ： 于金枝