全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2015)01 － 0120 － 07 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2015． 01． 022
收稿日期:2014 － 11 － 26
基金项目:国家自然科学基金项目(31260443);广西自然科学
基金项目(2013GXNSFAA019097);广西大学科研基金项目
(XJZ130364)
作者简介:岑卫健(1982 －)，女，广西北海人，主要从事微生物
功能基因组学蛋白质组学研究，* 为通讯作者。
利用双向电泳构建十字花科黑腐病菌 HrcV
控制的分泌蛋白质图谱
岑卫健1，刘 娇2，付秋霞2，杨丽超2，朱平川1，姜伯乐1，2*
(1．亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁 530005;2．广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁 530005)
摘 要:以十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv． campestris，Xcc)8004 菌株为研究材料，采用双向电泳 －质谱技术鉴定
HrcV控制的分泌蛋白质组。结果表明，野生型和突变体菌株均获得分辨率高且具有可重复性的双向电泳银染图谱，经过图像软件
分析找出差异点 61 个，以野生型菌株为对照，22 个蛋白点上调，39 个蛋白点下调。挖取下调蛋白质点 39 个做质谱分析，质谱成功
鉴定出 25 蛋白质，主要包括各种酶类、转运蛋白、延伸因子、DnaK 蛋白、分子伴侣及假定蛋白。推测这些蛋白质可能在 Xcc 8004
的致病性中起到重要作用，为进一步研究 Xcc的致病机理奠定基础。
关键词:十字花科黑腐病菌;HrcV;双向电泳;质谱
中图分类号:S436． 412． 1 文献标识码:A
Identification of Secreted Proteins Controlled by HrcV
in Xanthomonas campestris pv． campestris
CEN Wei-jian1，LIU Jiao2，FU Qiu-xia2，YANG Li-chao2，ZHU Ping-chuan1，JIANG Bo-le1，2*
(1． State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Jiangsu Nanning 530004，China;2． College of
Life Science and Technology，Guangxi University，Jiangsu Nanning 530004，China)
Abstract:In the present study，two-dimensional electrophoresis (2-DE)and mass were employed to analyze the secreted proteins controlled
by HrcV of Xanthomonas campestris pv． campestris (Xcc 8004)． The results showed that the high quality and repetitive of 2-DE maps were
obtained． Analysis through image analysis system indicated that there were 61 differentially expressed proteins between wild-type 8004 and
hrcV mutants，including 22 up-regulated and 39 down-regulated proteins． The 39 down-regulated spots were collected and analyzed by MAL-
DI-TOF-MS and Mascot software． As a result，25 spots were successfully identified，mainly including energy metabolism proteins，transport-
ers，elongation factor，DnaK protein，chaperonin and hypothetical proteins． It is speculated that these genes might play important roles in
virulence of Xcc 8004． The further analysis of these secreted proteins should make benefit for study on Xcc pathogenesis．
Key words:Xanthomonas campestris pv． campestris;HrcV;Two-dimensional electrophoresis (2-DE);Mass
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv．
campestris，Xcc)能够引起几乎所有的十字花科植物
黑腐病，是研究微生物 －植物相互作用的模式菌株
之一［1］。Xcc通过 III 型分泌系统将 III 型毒性蛋白
分泌并转运进入植物体内，与寄主植物发生分子互
作，从而引起寄主植物致病或过敏反应［2］。III 型效
应物是黄单胞菌属里相当重要的致病因子，对于疾
病的病理研究和抗生素开发等具有重要意义。但它
们必须依靠 III型分泌系统直接注入到宿主细胞内
的蛋白质，若该系统失效，可以导致病原菌致病力完
全丧失［2 ～ 3］。研究认为，T3SS 的核心装置主要是由
hrc 基因编码的蛋白组成，hrcT (hrpB8)、hrcＲ
(hrpD2)、hrcS (hrpD3)、hrcU (hrpC1)、hrcV (hrpC2)
等基因编码的蛋白结合于细菌内 、外膜之间，构成
分泌通道［4］。Büttner 研究表明，黄单胞菌 III 型效
应物的分泌依赖于关键装置蛋白 －内膜蛋白 HrcV，
转运依赖于易位子 HrpF［5］。
双向电泳 －质谱技术(two-dimensional electro-
phoresis (2-DE)and mass)是当前蛋白质组学研究
中的核心技术，广泛应用于病原微生物致病机制的
研究。通过比较蛋白质组学的研究，有助于发现与
021
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2015 年 28 卷 1 期
Vol. 28 No. 1
表 1 供试菌株和质粒
Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study
菌株和质粒 特征 来源
十字花科黑腐病菌 (Xcc)
8004 野生型菌株;Ｒifr ［12］
8004△gumB 8004 的 gumB非极性整合突变体;Ｒifr，Gmr 本实验室
8004△hrcV 8004 的 hrcV非极性整合突变体;Ｒifr，Kmr 本实验室
8004△gumBhrcV 8004 的 gumB和 hrcV双突变体;Ｒifr，Kmr，Gmr 本研究
质粒 (Plasmids)
pG18mob pK18mob的卡那抗性基因置换成庆大霉素抗性基因;Gmr 本实验室
pG1658 将 XC1658 的内源片段克隆至 pG18mob;Gmr 本研究
其致病性有关的基因。2005 年 Watt 等［6］采用双向
电泳 －质谱方法对 Xcc 的分泌蛋白进行分析，发现
了 11 个降解酶如纤维素酶、超氧化物歧化酶、内切
半乳糖苷酶等涉及病原菌侵染寄主植物过程中的关
键因子。2007 年 Chung 等［7］采用双向电泳 －质谱
方法分析了 Xcc17 菌株的分泌蛋白质全谱，鉴定了
281 个蛋白质，以 Xcc17 菌株为对照，通过比较
Xcc17 和 Xcc11 的分泌蛋白质组，得到 22 个表达上
调的蛋白质，其中包括降解酶 EngXCA、HtrA 和 Pe-
pA，这些酶在其它细菌中都是与致病相关的。
本研究拟通过构建 hrcV 突变体，采用双向电泳
－质谱技术鉴定野生型菌株和 hrcV 突变体菌株的
差异蛋白，为进一步鉴定 III 型效应物鉴定基础，这
将有助于揭示植物病原细菌的致病机制、寄主范围
和进化。
1 材料与方法
1． 1 菌株、质粒及培养条件
本研究所使用的菌株及质粒(表 1)。大肠杆菌
(Escherichia coli)的培养温度是 37 ℃，用 LB (Ly-
sogeny Broth)培养基培养［8］，Xcc培养温度是 28 ℃，
用 NYG (Nutrient Yeast Glycerol)［9］和 XCM1［10］培养
基培养。抗菌素四环素(Tetracycline，Tc)、利福平
(Ｒifampicin，Ｒif)、卡那霉素(Kanamycin，Km)、氨
苄青霉素(Ampicillin，Amp)的使用参见文献［11］。
1． 2 引物和试剂
化学试剂及一般性耗材等购自上海生工，PCＲ
反应所用 DNA聚合酶、dNTP购自 CasArray公司;限
制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自美国 Promega 公
司;质粒抽提试剂盒、PCＲ 产物纯化试剂盒和胶回
收试剂盒购自美国 Watson公司，双向电泳相关试剂
购自美国 GE公司。引物均由生工生物工程(上海)
股份有限公司合成，见表 2。
1． 3 整合突变体的构建及验证
通过 PCＲ扩增目标基因的内部片段(约 150 ～
300 bp)，然 后 连 接 到 自 杀 质 粒 pK18mob 或
pG18mob上，通过三亲本接合导入 Xcc 8004 中，得
到接合子。由于接合子质粒上的外源片段与目标基
因同源，使得二者间发生同源单交换，从而质粒整合
到目标基因上，最终目标基因被突变。
可以通过 PCＲ 验证基因组上目标基因是否已
发生突变。由于自杀质粒整合到目标基因上，使得
基因组上有两个目标基因的不完全拷贝，所以可以
用自杀质粒的公引加上上游或下游基因的一个引物
来验证是有预期的目标带。也可以同时进行表型验
证加以确定。
1． 4 蛋白质的提取、纯化及定量
作为出发菌株的黄单胞菌在 NYGB培养基中
表 2 本研究所用引物
Table 2 Primes used in this study
引物 序列 用途
XC1658-F GGGGAATTC GACCCGCTGGCAATGTCCACG gumB整合突变构建
XC1658-Ｒ GGGGGATCC GCCAGCGCGATACCGATCGGC gumB整合突变构建
XC1659-Ｒ(BJ) CGCGAGTTGAGGATTGGCTC gumB整合突变验证
XC3013-F GGGGAATTCACACCGGTGAAGTGGCGATCGC hrcV整合突变构建
XC3013-Ｒ GGGGGATCCCCAGATTGCCGCCCACCACCAG hrcV整合突变构建
XC2911-Ｒ(N) AAGCGAAGCGATAGCTGGTCTGGCG hrcV整合突变验证
pG18mobCon GCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTG 整合突变验证公共引物
1211 期 岑卫健等:利用双向电泳构建十字花科黑腐病菌 HrcV控制的分泌蛋白质图谱
培养 18 h后，按 5 %转接到 XCM1 (pH 7． 0)培养基
培养约 20 h，再调 OD600 = 1． 0 后按 1 % ～2 % 转接
XCM1 (pH 6． 6)培养基培养约 22 h，此培养物用于
胞外蛋白提取。将 300 mL 培养物加入终浓度 1
mmol /L PMSF 或广谱蛋白酶抑制混合物，移至 50
mL离心管(预冷)中，4 ℃，4600 r /min 离心 15 min
2 次，将上清液通过 0． 22 μm的细菌过滤器，再将得
到的无细胞上清通过 Millipore 的离心超滤管(10
kDa)浓缩到约 500 μl，即得到蛋白质粗提物。所有
操作尽量在冰上进行。每个菌株各提 3 批样品用于
重复实验。
蛋白质粗提液中 3 倍体积的预冷丙酮，－ 20 ℃
的条件下沉淀至少 2 h，在 13 000 r /min，4 ℃条件下
离心 30 min;冷冻干燥去除残留的丙酮，用 500 μl
的水化液 (7 mol /L 尿素，2 mol /L 硫脲，4 %
CHAPS，40 mmol /L DTT)溶解;采用 GE Healthcare
公司的 2D clean-up 试剂盒纯化，按照 2D clean-up
试剂盒步骤 B 进行。使用 Amersham 公司的 2D-
QUANT定量试剂盒对提取的蛋白样品进行定量。
步骤按照说明书进行操作。
1． 5 双向电泳分离
每根 24 cm pH 4 ～7 IPG 胶条的蛋白质样品量
为 300 μg，加水化液、IPG缓冲液 5 % (V /V)至 450
μl混匀后加入上样槽，IPG 胶条胶面朝下轻轻盖住
样品混合液，不能产生气泡以免影响样品聚焦，最后
加入覆盖油避免样品挥发。按照如下程序进行等电
聚焦:30 V 6 h、60 V 6 h、500 V 1 h、1000 V 1 h、8000
V 12 h。一向电泳结束后转至第二向 SDS-PAGE 胶
进行电泳，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部，终止电
泳。银染程序参考文献［13］提供的方法进行。凝胶
图像用 Image master scanner 进行扫描后，用软件
ImageMaster 2-DE Platinum 6 进行图像的处理。
1． 6 质谱鉴定
将差异的银染蛋白质点切割下来，置于 EP 管
中，用 100 μl 的 ddH2O 水冲洗 2 遍后，加 50 μl 的
30 mmol /L K3Fe(CN)6 与 100 mmol /L NaS2O3 等体
积混合的脱色液，待颜色完全脱去后马上吸出液体，
无菌去离子水清洗两次，胶粒在 (NH4)2CO3(200
mmol /L)中平衡 10 min，无菌去离子水清洗两次，然
后用乙腈脱水。100 %乙腈 50 μl脱水胶块，至胶块
变为白色后，置于真空干燥仪中冷冻干燥。每管各
加 0． 02 μg /μl的蛋白质组学级胰蛋白酶(Promega)
5 μl 酶解过夜，酶解后上清液转移至另一新的 EP
管中，加 50 μl 萃取液(67 %乙腈，含 5 % TFA)于
剩下的胶块中萃取，提取后用 Zip-tip 脱盐后，直接
点样于 MALDI板上，用基质辅助激光解吸 /电离飞
行时间串联质谱(MALDI-TOF MS /MS)(4800 Pro-
teomics Analyzer，Applied Biosystems)进行肽质量指
纹谱分析。使用 Mascot软件对一级、二级质谱数据
进行综合分析。
2 结果与分析
2． 1 8004△gumB 和 8004△gumBhrcV 非极性整合
突变体的构建及验证
本实验室已有构建好的 8004△hrcV 菌株，但由
于胞外多糖在蛋白提取和双向电泳的过程中造成很
图 1 8004△gumB和 8004△gumBhrcV整合突变体的构建策略
Fig． 1 Strategy for construction of 8004△gumB and 8004△gumBhrcV
221 西 南 农 业 学 报 28 卷
3000 bp
2000 bp
1000 bp
500 bp
3000 bp
2000 bp
1000 bp
500 bp
3000 bp
2000 bp
1000 bp
500 bp
M 1 M 1 M 1 2
A B C D
8004 8004△gumB 8004△gumBhrcV
A． PCＲ验证重组质粒 pG1658;B． 酶切验证重组质粒 pG1658;C． PCＲ 验证 8004△gumB 和 8004△gumBhrcV;D． 8004△gumB 和 8004
△gumBhrcV的胞外多糖检测
A． PCＲ verification of recombinant plasmid pG1658;B． Digest verification of recombinant plasmid pG1658;C． PCＲ verification of 8004△gumB and
8004△gumBhrcV;D． Examination of extracellular polysaccharide of 8004△gumB and 8004△gumBhrcV
图 2 整合突变体的验证
Fig． 2 Verification of integration mutant
大的影响，所以构建 gumB 的非极性整合突变体，以
解除胞外多糖的影响。gumB 基因在 Xcc 8004 基因
组上对应的基因号为 XC1658，构建策略如图 1。重
组质粒 pG1658，PCＲ验证(图 2-A)，并且以 EcoＲ I /
BamH I进行酶切验证(图 2-B)。在丰富培养基上
分别以 Ｒifr + Gmr 和 Ｒifr + Gmr + Kmr 筛选三亲接合
子 8004△gumB和 8004△gumBhrcV。对三亲接合子
进行 PCＲ验证，产物长度为 1250 bp (图 2-C)。并
且在补加 2 %的葡萄糖板上进行表型验证，菌落干
燥(图 2-D)。
2． 2 双向电泳鉴定差异分泌蛋白
分别提取 8004△gumB 和 8004△gumBhrcV 对
数生长后期的胞外蛋白，纯化定量，取约 300 μg 蛋
白上样量，经双向电泳分离，实验重复 3 次，结果如
图 3。以 8004△gumB 为对照，用 ImageMaster 2D
Platinum软件对 6 张凝胶图谱分析匹配，共筛选出
光密度值差异倍数在 2 倍及以上的差异表达蛋白点
61 个，其中上调的蛋白有 22 个，下调的蛋白有 39
个。
将 39 个下调的蛋白质点切取后进行胶内酶解，
酶解后用于质谱鉴定。成功获得 25 个差异蛋白质
的肽质量指纹图(图 3)，部分差异点的局部放大图
如图 4。搜索 NCBInr数据库，查找与肽指纹图相匹
配的蛋白质。当 Socer≥65，CI≥95 %时认为鉴定
成功，鉴定结果如表 3，包括各种酶类如 3-羟酰 CoA
脱氢酶等 11 种，转运蛋白 3 个，DnaK 蛋白，延伸因
子 P和 60 kDa分子伴侣。
图 3 分泌蛋白质双向电泳图谱
Fig． 3 The 2-DE gel of the extracellular proteins
3211 期 岑卫健等:利用双向电泳构建十字花科黑腐病菌 HrcV控制的分泌蛋白质图谱
1 2 3 4 5
1． 3-羟酰-CoA脱氢酶;2． 磷酸丙糖异构酶;3． 精氨酸脱羧酶;4． 谷氨酰胺合成酶;5． DnaK蛋白
1． 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase;2． triosephosphate isomerase;3． biosynthetic arginine decarboxylase (ADC);4． glutamine synthetase;5．
DnaK protein
图 4 部分差异点的局部放大图
Fig． 4 Partial enlarged difference points
表 3 差异蛋白质谱鉴定结果
Table 3 MS identification results of differential expression proteins
NCBI蛋白质序列号 蛋白质名称
gi |21231427 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase 3-羟酰-CoA脱氢酶
gi |21232774 NADP-dependent malic enzyme NADP +依赖型苹果酸酶
gi |48474871 biosynthetic arginine decarboxylase (ADC)生物合成的精氨酸脱羧酶
gi |21233502 polyvinylalcohol dehydrogenase 聚乙烯降解酶
gi |21229663 glutamine synthetase 谷氨酰胺合成酶
gi |21230941 dihydrolipoamide S-succinyltransferase 二氢硫辛酰胺 S-琥珀酰转移酶
gi |21229596 2-keto-3-deoxygluconate kinase 2-酮-3-脱氧葡糖酸激酶
gi |21231962 triosephosphate isomerase 磷酸丙糖异构酶
gi |21232743 inorganic pyrophosphatase 无机焦磷酸酶
gi |25090402 GTP cyclohydrolase I GTP环水解酶 I
gi |21230396 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase 肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶
gi |58582394 polar amino acid transporter 极性氨基酰转运蛋白
gi |21232797 glutaredoxin-like protein 谷氧还蛋白
gi |21231188 bacterioferritin comigratory protein 细菌铁蛋白共转运蛋白
gi |21107700 DnaK protein DnaK蛋白
gi |21231710 elongation factor P 延伸因子 P
gi |21229998 60kDa chaperonin 60kDa分子伴侣
gi |27375155 hypothetical protein 假定蛋白
gi |21232511 hypothetical protein 假定蛋白
gi |21230620 hypothetical protein 假定蛋白
gi |21229593 hypothetical protein 假定蛋白
gi |21231000 hypothetical protein 假定蛋白
gi |21232457 hypothetical protein 假定蛋白
gi |21232457 hypothetical protein 假定蛋白
gi |21231946 hypothetical protein 假定蛋白
gi |21232934 hypothetical protein 假定蛋白
gi |21233061 hypothetical protein 假定蛋白
421 西 南 农 业 学 报 28 卷
3 讨 论
随着生物技术的飞速发展，蛋白质组学研究成
为各个研究领域的热点。通过双向电泳技术进行蛋
白质组和比较蛋白质组学研究已经成为非常普遍的
研究手段，在植物病原菌的研究中也有了不少报道。
在关于 Xcc 主要有:Karsten Niehaus 等人通过双向
电泳和考染鉴定了 Xcc B100 的 87 个胞外蛋白，总
蛋白中高丰度的 30 个蛋白，56 个周质空间蛋白［14］;
Chao-Hsiung Lin等鉴定了 Xcc 17 鉴定了 381 个可溶
性蛋白，其中有 282 个与已经测序的基因同源，另外
通过该菌株与一个非致病的菌株蛋白组比较分析鉴
定了 22 个上调的蛋白［15］。本研究所鉴定的差异蛋
白质，与已经报道的各种植物病原菌胞外蛋白有一
些同类功能蛋白，包括延伸因子、伴侣蛋白、膜转运
蛋白和各种与代谢有关的酶类等。
分子伴侣是一类重要蛋白，可以帮助新生蛋白
的正确折叠或者帮助其它蛋白质顺利进入寄主植物
体内，另外应激反应也是分子伴侣介导的生命活动
中重要部分［16］。热休克蛋白 DnaK 蛋白也是一类
重要的分子伴侣蛋白，对机体起到非特异性保护作
用。当机体细胞受到外界的各种应激(如高热、氧
化等有害应激)时，其可增强细胞对损害的耐受程
度，维持细胞正常的功能代谢，提高细胞的生存能
力［17］。1988 年 Clarke 等［18］发现 在大肠杆菌中表
达的外源真核蛋白可以与 DnaK结合;Phillips等［19］
在 1990 年又发现过量表达的 DnaK 蛋白有助于
LacZ杂合蛋白穿过细胞内膜运往胞外。这说明
DnaK在调节蛋白与蛋白之间的相互作用方面起到
重要作用。DnaK在 Xcc 8004 中可能是致病相关的
蛋白质，需要进一步研究。
在质谱鉴定的结果中，还发现了与代谢相关的
蛋白质。如磷酸丙糖异构酶与能量代谢有关，参与
磷酸丙糖代谢，磷酸丙糖代谢可以将糖酵解、磷酸戊
糖途径、糖异生以及脂质代谢等联系在一起，参与机
体稳态的维持。精氨酸脱羧酶(arginine decarboxy-
lase，ADC)与氨基酸生物合成和代谢相关，是多数
植物体内催化游离态多胺合成的关键酶［20］。3-羟
酰 CoA脱氢酶与脂肪酸和磷脂酸代谢相关。
本研究通过双向电泳-质谱技术分析了受 HrcV
控制的分泌蛋白质，研究结果为进一步了解十字花
科黑腐病菌的致病机理奠定了基础。但是，要了解
分泌蛋白质通过 III 分泌系统与寄主植物的互作机
制。则需要对差异蛋白质进行深入研究。下一步的
研究首先要鉴定这些差异蛋白质是否为 III 分泌的
效应物蛋白，并对这些蛋白质是否直接影响 Xcc
8004 的致病性做进一步的研究。
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(责任编辑 温国泉)
621 西 南 农 业 学 报 28 卷