全 文 ：广 西 植 物 Guihaja 29(1)：59～ 6l 2oO9年 1月
一 种适于提取荔枝花与幼果组织总 RNA的方法
榻维言1 ，郑学勤
(1．中国热带农业科学院 热带作物生物技术研究所，海 口571107；2．广西大学 农学院 ，南宁 53OO05)
摘 要：介绍了一种从荔枝花与幼果组织中提取高质量和较高产量的总 RNA的方法，该方法提取的总RNA
可以满足构建 cDNA文库、开展RT—PcR、Northern杂交分析、基因表达差示分析等方面研究的要求。
关键词：RNA提取；CTAB；荔枝
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1。OO一3142(2OO9)O卜O059一O3
A practical meth0d f0r extracting t0tal RNA
fr0m fl0wer and fruit 0f Litchi
XUAN Wei—Yan1一，ZHENG Xue—Qin1
t 1，lns￡ 钯oj o瞰 az C rof)Bio ㈨{ogy，C}iI}l Amd㈣ of，rropicnl A cuztuml scim㈣ ，H ou
5711O1，China；2．( PgP。_厂Agr站“ ￡“me，G““”g 坶 ，Nanning 53O0O5，China)
Abstract：A practical meth()d for extracting}1igh—quaIity and pr0ductive total RNA from flower and fruit of seedless 1i—
tchi was intmduced． These RNA samples thus prepared meet the needs of many molecular biOlogical researches such
as consLructing cDNA 1．hrary，RT—PCR，N0rthern blot and stu dies on difference analysis of gene expression．
KeV woTds：RNA isolation；CTAB；litc
从植物组织中提取高质量的总 RNA是构建
cDNA文库 、开展 RT—PCR、Northern杂交分析、基
因表达差示分析等方面研究的必要前提。已有不少
报道用不同的方法从不同植物组织中成功提取
RNA的研究 (冯斗等 ，2OO4；王玉 成等 ，2OO6；刘洋
等，2OO6；蔡文伟等，2006；Liu等，2 O()6；张容等，
2。O6)，但由于不同植物组织其组成成分差异较大，
有些植物组织多酚类物质含量比较多，如荔枝、橡胶
等，多酚类物质在 RNA 的提取过程中容易被氧化
而产生褐变，难以取得高质量的 RNA，张以顺等
(2∞4)报道用改良的 Tris一硼酸法和 3S柱式细胞及
组织总 RNA抽提试剂盒 V2．O能从荔枝胚 中成功
提取总 RNA。一些提取方法和试剂盒虽能提取到
较好的RNA，但一次性处理的组织材料较少，难以
获得足量的总 RNA来满足一些需要量较大的实
验 ，如 SSH。而本文采用 CTAB、异硫氰酸胍、{3～巯
基乙醇与 N一十二烷基肌氨酸钠联合使用提取法进
行，结果表明该方法能从较多的荔枝花与幼果组织
中提取较大量的、质量较高的总RNA。
1 材料和试剂
1．1材料
荔枝花与幼果取白海南陆桥无核荔枝农场，为
5～7年生正常挂果果树，品种为海南无核荔枝，于
盛花期和结果初期分别取即将开放的花蕾和 o．s～
O．6 cm大的幼果置于液氮中带回实验室，置于一8O
℃的冰箱 中保存备用。DEPC((diethyl pyrocar—
bonate，焦碳酸二乙酯)为 Sigma公司产品，VP、ED—
TA、KAc、LiCl和 l3一巯 基 乙醇 为 Amresco公 司产
收稿 日期：2。O7—05—25 修回日期：2∞8一O5—2O
基金项目：国家“863’计划项目(AAD。138O)[supported by Nati0na1 High Techn0logy Research and Deve1opment Pr0gram。f China(AA。C138。]
作者简介：翻维言(1963一)，女，广‘西玉林人，副教授，博士 ，主要从事作物逆境生理及植物基因工程研究，(E—maiI)xuanweiyanj@163．c0m。
通讯作者(Author for c0resp。ndence，E—mail：zhe gxxxqin@126．c。m)
6O 广 西 植 物 29卷
品，Taq酶和反转录酶(AMV—xL)为大连宝生物公
司产品，其余试剂为国产分析纯。
1．2试剂与器皿的处理
CTAB抽 提液 (pH8．O)内含 2％CTAB、10O
mmol／L Tris．Cl，pH8．O、2O mmol／LEDTA，
pH8．O、1．4 mol／L NaCl，用 DEPC水配制 ，用浓盐
酸调 PH8．O，置于棕色瓶 中室温下保存 ，CBs缓冲
液内含 42 mmol／L柠檬酸钠和 O．83 (w／V)十二
烷基肌氨酸钠，4 mo1／L异硫氰酸胍变性液，用 cBS
缓冲液做溶剂配制。其余试剂有 8 mol／L I icl、3
mo1／LNaAc(pH5．2)、2 mol／L NaAc(pH4．O)、酚
：氯仿 ：异戊醇(25：24：1)、氯仿 ：异戊醇(24：
1)、75 乙醇。CBS缓冲液、8 mo1／L LiCl、3 mol／L
NaAc(pH5．2)、2 mol／L NaAc(pH4．O)等使用前均
用 O．1 (体积分数)的 DEPC 37℃处理 l2 h以灭
活RNase，然后高压灭菌。研钵、玻璃器皿在使用之
前 18O℃烘8 h以上，离心管、枪头等塑料器材使用
前用 0．1 (体积分数)的DEPc 37℃处理 l2 h以
灭活 RNase，然后高压灭菌 ，8O℃烘干备用。
2 方法
2．1荔枝花蕾与幼果总RNA的提取步骤
(1)分别取 l5 mLCTAB提取缓冲液加人两个
RNase—free的无菌 5O mL离心管中，再分别加入 1
mL一巯基乙醇(临用前加入)，65℃下预热。(2)分
别称取花蕾和幼果3～5 g，液氮中碾磨成细粉末，等
份转入上述 5O mL预热 的离 心管中，迅速涡旋散
开，65℃水浴裂解 3O～40 min。(3)每管加入 l5
mL氯仿 ：异戊醇(24：1)，涡旋混匀，冰浴 lO min，
4℃，12 OOO rpm离心 1O min。(4)取上清，加人 1／
3体积 8 mol／L LiCl和 l mL巯基乙醇，2O℃下沉
淀过夜。(5)4℃，l2 O0O rpm离心 4O min。(6)沉
淀用 4 mL异硫氰酸胍变性液溶解，加人 12O L一巯
基乙醇和 88O L 2 mo1／L NaAc(pH4．O)，混匀后
加入 5 mL酚 ：氯仿 ：异戊醇(25：24：1)，涡旋混
匀，冰浴 1O min。(7)4℃，12[)()O rpm离心 15 min。
(8)取上清，加入等体积酚 ：氯仿 ：异戊醇(25：24
：1)，涡旋混匀，冰浴 lO min。(9)4℃，12。0O rpm
离心 15 min。(10)取上清，加入等体积氯仿 ：异戊
醇(24：1)，涡旋混匀，4℃，12∞0 rpm离心 lO
min。(11)上清，加入等体积氯仿 ：异戊醇(24：
1)，涡旋混匀，4℃，12 OOO rpm离心 l0 min。(12)
取上清，加人 1／3体积的 3 mol／LNaAc(pH5．2)和
2倍体积的无水乙醇，一20℃下放置 2 h。(13)4℃，
12 OO0 rpm离心 3O min，沉淀用预冷的75 乙醇漂
洗 3次 ，每次漂洗 5 min。(14)超净工作台中，冰上
空气干燥 RNA 沉 淀 10 min。(15)加入 3O0 L
DEPC水溶解沉淀。取 1 L进行 RNA电泳，检测
rRNA的完整性 ，取 3～5 L稀释后用紫外分光光
度计测230、260、28O nm处的ABS值。其余样品加
入 3倍体积的无水乙醇于一8O℃下保存备用。
2．2 RT—PCR
用所提取的荔 枝花总 RNA，根据多种植物的
MADS ox及其 C一端保守的氨基酸序列设计一对
简并 性 引 物 Pl 5 ATGGGNMGNGGNAARAT—
MGAYAT，P2 5 一RTTNGGM TGYATYGGNTG—
MAc，进行 RT—PcR反应，PCR反应体系为25 L，
反应条件为：94℃，3 min；94℃，3O s；55℃ 35 s；72
℃，1 min 10 s；35cycles。回收 目的片段，并对 目的
片段进行克隆、测序及序列分析，然后采用 3，_
RACE法扩增 目的基因的 3 末端。
3 结果与分析
3．1总 RNA纯度、产量和完整性检测
利用 CTAB等多种试剂联合从荔枝花与幼果
组织中能成功的提取总 RNA，用紫外分光光度法检
测 26o、28O nm 与 23O nm处的 ABS值，结果为
A。。／A 。。比值在 1．75～2．O之间；A 。／A2∞比值均
在 2．O以上(表 1)。
表 1 样品总 RNA紫外分光光度计检测结果
Table l Ultraviolet spectrophotometer anaIysis of t。tal
RNA iso】ated from f1ower and frl】it of seed1ess 1itchi
样品 ABs比值 Rati0 0f ABs
s pl。 A26。， A28。 6。／A23o浓度／ g． I 产率／ g． Fw
从图 l中可知，28S rRNA、18S rRNA分带明显
清晰，而且 28S rRNA 的量是 18S rRNA 的 1．5～2
倍，说明所提的RNA样品基本没有发生降解。由纯
度和完整性检测的结果表明，所提取的总RNA样品
的纯度与质量符合实验要求，可作为后续实验应用。
3．2 RT_PCR与 3 一RACE的结果
RT PCR的结果如(图 2)，能扩增 出多个条带，
回收约6OO bp的目标条带，命名为 LA5，建立克隆，
1期 榻维言等：一种适于提取荔枝花与幼果组织总 RNA的方法 6l
28S一
1 8S一
图 l 荔枝花总 RNA，幼果总 RNA
Fig．1 IOtal RNA of litchi flower and fruit
经测序后得到 639 bp的目标序列 。
． 二= 075K——
0．5K ——
28S
1 8S
图 2 无核荔枝 MADS_hox基因的 RT—PCR
Fig．2 RT—PCR 0f litchi MADS_hox gene
1．DNA Ladder Marker；2．RT—PCR产物 。
根据 RT—PCR扩增 的 目标序列设计基因特异
引物，采用 3 一RACE法扩增其 3末端，得到约 4O0
bp的条带(图 3)，测序后得到了 目的基因的 3 末端
序列，经拼接后得到了长 867 bp的具有完整的开放
读码框和3，_UTR的 MADs_box基因，该基因编码
含218个氨基酸残基的蛋白质，经 Northern blot检
测结果表明，该基因在开花结实期只在雌花与雄花
中表达，而在叶片与幼果中不表达。
上述结果表明，获得的 RNA可 以应用于 RT—
PCR等以 RNA为基础的分析研究 ，而且能达到预
期的目的。
4 本方法的特点
荔枝为含多酚类物质较多的植物，本方法采用
了强还原剂 8一巯基乙醇来防止多酚类物质氧化，而
且可以打断多酚氧化酶的二硫键使之失活，从而阻
止酚类物质被氧化，有效地防止其与 RNA结合。
1．Okb——
0．4kb——
图 3 DNA Ladder Marker
Fig．3 Product of 3 一RACE
1．DNA Ladder Marker；2．RAcE产物。
而异硫氰酸胍既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中
解离出来，对 RNA酶也有强烈的变性作用而使其
失活，同时利用了高浓度的 N一十二烷基肌氨酸钠对
Rnase变性作用来抑制 Rnase。实验结果表明，联
合使用 CTAB、异硫氰酸胍、 一巯基乙醇与 N一十二
烷基肌氨酸钠等提取荔枝花与幼果组织总 RNA的
方法，不但可以获得较高质量的 RNA，而且产量也
比较高。
参考文献 ：
Cai ww(蔡文伟)，Yang BP(杨本鹏)，zhang sz(张树珍)， ．
2OO6． Experimental study on the technique in extracting the t。tal
RNA from Dmm n Vand，ex L(龙血树总 RNA提取方法的研
究)[J]． M 户 d(中国热带医学)，6(2)：242—243
Feng D(冯斗)，Zhang CF(张春 发)，Zhang Y(张颖)．2OO4．A
suit8ble method f0r isoIating cotal RNA from banana pulp(一种
适用于提取香蕉果肉 RNA的方法)[J]．J G ng Ag f Bi—
o￡S (广西农业生物科学)，23(3)：249～251
Liu Y(刘洋)，He XR(何 心尧)，Ma HB(马红波)， “ ．2O06．
Extraction of total RNA from cotton(GDs “优 ^ “f“m)tis—
sues with C AB—PVP method(用 CTAB—PVP法提取棉花各组
织总RNA的研究)[J]．．，C^ 锄n Agr U 抽(中国农业大学学
报)，11(1)：53—56
Liu YZ，Liu Q，1 o NG， c￡．2OO6．Eficient isolation of RNA
from fruit peeI and puIp 0f ripening Navel 0range(C赴r“ —
)[J]．J H“n 0 g Agr ，25(3)：3OO～304
Wang YC(王玉成)．Zhang GD(张国栋)，Jiang J(姜静)．2。O6．A
Widely appIied total RNA eXtrdction method(一种适用范围广的
总RNA提取方法)[J]．B“ B。￡R (植物研究)，26(1)：84—87
zhang R(张容)，zheng YF(郑彦峰)，wu Y(吴瑶)， Ⅱ ．2oo6．
A simple and eficient meth0d for preparation 0f plant RNAs(一
种简单有效的植物 RNA提取方法)[J]．H r ￡口 (遗传)，28
(5)：583— 586
Zhang YS(张 以顺)，Xiang X(向旭)，Fu JR(傅 家 瑞)，以ⅡZ．
2OO4．A method for extractjon of total RNA fr。m ljtchj embryo
(一种提取荔枝胚中总 RNA的方法)[J]．P￡“n P^ C[一一
m“n(植物生理学通讯)，4O(2)：226—228