全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(3)：422— 425 2010年 5月
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同 效液相色谱法分析猪屎 口 ‘
种子胶多糖中的单糖组成
郭守军，杨永利，佘建保，冯心乐，洪佩琼，张洁枚
(韩山师范学院生物系，广东 潮州 521041)
摘 要：建立了一种采用 SUGAR SP—G 0810(Pb型)糖分析色谱柱 ，以纯水为流动相，利用示差折光检测器的
高效液相色谱外标法直接分离分析半乳甘露聚糖胶中单糖组成的方法。木糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖的分
离在 20 min内完成，检出限分别达到 2．0 g，20 gg，1．0 gg和 2O g，线性范围为 2～10 mg／mL。该方法简
便、快速、重现性好，用于猪屎豆种子胶多糖中单糖组分的测定，并进行回收率试验，结果 5次测定的半乳糖和
甘露糖的回收率分别为 95．83 和 103．68 ，RSD分别为 1．53 和 i．50％。
关键词：高效液相色谱法；半乳甘露聚糖；猪屎豆；种子胶；多糖分类号
中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(201O)03—0422—04
Determination of carbohydrates in seed gum
of Crotalaria mucronata by HPLC
GUO Shou-Jun，YANG Yong-Li，SHE Jian-Bao，FENG Xin-Le，
HONG Pei-Qiong，ZHANG Jie-Mei
(Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，China)
Abstract：A new approach by which the free monosaccharides of galactomannan were separated directly and deter—
mined by means of high performance liquid chromatography(HPLC)of external standard method on a SUGAR SP-G
O8 10 colunm with a differentail refract-meter detector and a mobile phase of pure water．The separation time for xy—
lose(xy1)，glucose(glc)，galactose(ga1)and mannose(man)was within 2O min；and the detection limits were 2．0 g，2O
g，1．0 g and 20 g，respectively，while the linear dynamics varied within the range of 2～10 mg／mL．Tlhe method
is rapid，simple and reproducible and can be used tO the determinations of the monosaecharides in seed gum galacto—
mannans of Crotalaria mucronata．Moreover，the recovery experiment was also conducted．The results showed that
the relative standard deviations(RSD)of six—time determinations tO Gal and Man were 1．53 and 1．5O and the re—
eoveries were 95．83 and 103．68 ，respectively．
Key words：HPLc；galactomannans；Crotalaria mucronata；seed gum；polysaccharide
猪屎豆(Crotalaria mucronata)为蝶形花科猪
屎豆属半灌木状草本，别名三圆叶猪屎豆、狗屎豆
等，广泛分布于广东、广西、云南和福建等地。猪屎
豆种子是我国南方地区十分常见的一种传统中药，
有清热祛湿，解毒散结，消积，补肝肾，明目，固精等
功效(吴修仁，l997，1989)。猪屎豆种子胶是从猪屎
豆种子中提取出的一种多糖胶，主要成分是半乳甘
露聚糖，近年来的研究表明，半乳甘露聚糖胶具有降
血糖、降血脂、减肥、抗凝、抗溃疡、抗病毒、免疫调节
等作用 (Bin-Hafeez等，2003；Pandian等，2002)。
收稿日期 ；2008—12—08 修回日期 ：2009—03—24
基金项目：广东省自然科学基金(06028879)ESupported by Natural Science Foundation of Guangdong Province(06028879)]
作者简介：郭守军(1965-)，男，甘肃天水人，博士，副研究员，主要研究领域为天然产物化学，(E—mail)sjguo2006@yahoo．tom．co。
3期 郭守军等：高效液相色谱法分析猪屎豆种子胶多糖中的单糖组成 423
并且不同来源的半乳甘露聚糖胶其活性也不同，而
这些影响主要与半乳甘露聚糖胶的半乳糖和甘露糖
的摩尔 比及精细结构不同有关 。
半乳甘露聚糖胶中单糖组分的研究 ，多采用气
相色谱法和薄层色谱法(马文秀等 ，1999；杨永利等 ，
1995，2006)。由于气相色谱法分析需要对单糖组分
进行衍生化，实验中该方法较为繁琐和费时，而高效
液相色谱法具有直接、简便和快速等特点，所以已广
泛应用于多糖组分的分析中。多糖中半乳糖和甘露
糖通常在普通氨基糖分析柱中很难获得满意的分离
效果(林勤保等，1998；赵仁邦等，2004)，采用柱前衍
生化可以改善两种单糖的分离度(Tapie等，2008；
吴彦等，2005，陈克克，2008)，但是分析时间会延长，
而且增加了柱前衍生化反应的操作。为了探索一种
高分离度、快捷、简便的直接分离分析多糖中半乳糖
和甘露糖含 量的方法 ，本试验 运用 SUGAR SP—G
0810(Pb型)糖分析色谱柱，利用示差折光检测器的
高效液相色谱外标法对猪屎豆种子胶多糖完全水解
产物进行了直接分离分析，获得了满意的结果。
1 材料与方法
1．1仪器和试剂
LC一6A高效液相色谱、岛津 RI一10A示差折光
检测器，色谱 柱 (Shodex)SUGAR SP—G 0810(300
mm×4．6 mm i．d．，l0 m，Pb型)；7725i手动进样
器，CTO一10AS柱温箱 ，CBM一20A在线控 制器 ，LC—
solution分析软件 ，各单糖标样均为 Sigma试剂，三
氟乙酸为分析纯。
1．2猪屎豆种子胶多糖的提取与纯化
1．2．1猪屎豆种子胶 的制备 种子泡涨 ，手工剥离
内胚乳，内胚乳烘干、粉碎，过 100目筛，得猪屎豆种
子胶粉。
1．2．2猪屎豆种子胶 多糖的分 离提纯 称取 5 g猪
屎豆胶粉溶于 700 mL蒸馏水中，搅拌 3 h，离心沉
降分离，沉淀部分用水洗涤2次，每次用水 200 mL，
搅拌 l h离心分离。合并清液，在搅拌下慢慢加入
6．5 mL斐林试剂析出铜络合物，静置 1 h，倾出上清
液，用水洗涤 3次，离心分离得络合物，向络合物中
加4℃ 75 mL蒸馏水，再滴加0．5 mol／L的HC1使
之全部溶解。加入 700 mL乙醇，所得絮状物分别
用乙醇、丙酮、乙醚各洗涤三次，冷冻干燥得洁白多
糖粉 。
1．3色谱方法
1．3．1样品的预处理 精确称取猪屎豆种子胶多糖
10 mg于 10 mL安培瓶中，精密加入 3 mL浓度为2
mol／mL的三氟乙酸 ，充人氮气后封管，于 100℃水
解 3 h，冷 冻干燥 ，残 留物再加 入 3 mL浓度为 2
mol／mL的三氟乙酸，条件同上重复水解一次，冷冻
干燥得水解后产物 ，五氧化二磷真空干燥器干燥至
恒重，去离子水溶解，过 0．45 nm膜后定容至10 mL
后进行色谱分析 。
1．3．2混合标准单糖溶液的配置 精确称取半乳
糖、木糖、葡萄糖和甘露糖标样各 10 mg，混合后按
“1．3．1”方法处理，得到混合标准单糖溶液，过 0．45
nm膜后定容至 1O mL后进行色谱分析。
1．3．3色谱条件 用 SP—G 0810色谱柱和示差折光
检测器，流动相 ：HzO；流速 ：1．0 mL／min；柱温：8O
℃；进样体积：2O L，与标准样对照，按保留时间和
峰面积分别进行定性、定量分析。
2 结果与讨论
2．1色谱条件的选择——流 速、柱温和洗脱剂对色
谱分离的影响
SP—G 0810(Pb型)为有机聚合物的离子络合物
糖分离柱，对柱压要求较为严格，一般流速使用不能
超过 1．0 mL／min，若流速选择在 0．5～1．0 mL／
min范围内，分析结果显示 ，各单糖均能得到较好的
分离 ，但选择较小的流速 ，则 分离 时间会延长 ，所以
本试验选择流速 1．0 mL／min。
SP—G 0810糖分离柱的使用温度最高为 95℃，
如果柱温低于 6O℃，单糖常会出现异构体的双峰，
8O℃是最为适宜的柱温选择。
该色谱柱使用的洗脱剂是纯水，但有时为了改
善分离度，可以在洗脱溶剂加入小于 20 (v／v)的
极性有机溶剂，如甲醇或 乙腈。本试验在尝试分别
加入浓度为 lO％甲醇和 10 9／6乙腈后，色谱分离效果
改观不大，所以采用纯水。
由图 1可知，四种标准单糖按出峰时间先后顺
序依次为：D一葡萄糖、【)’木糖、D一半乳糖和 D一甘露
糖。图 2是猪屎豆种子胶多糖酸水解产物的高效液
相色谱图，两个色谱峰(峰 l和峰 2)的保留时间分
别为 10．902 min和 12．27l min，对比标准单糖的保
留时间可知，猪屎豆种子胶多糖由半乳糖和甘露糖
组成，外标法定量得到其单糖摩尔比是半乳糖：甘露
424 广 西 植 物 30卷
糖=l：2．417，其单糖组成不同于其它豆科种子胚乳
胶多糖(马文秀等，1999；蒋建新等 ，2000；杨永利等 ，
1995，2006)。
mV
O．5
0 O
图 1 标准单糖的高效液相色谱图
Fig．1 HPLC of the standard monosaccharides
图 2 猪屎豆种子胶多糖的高效液相色色谱图
Fig．2 HPLC of the poIysaccharide in
Crotalaria mucronata seed gum
此外 由图 1和 图 2可知 ，与其它普通的碳水化
合物氨基糖分析柱比较(林勤保等，1998；赵仁邦等，
表 l 各单糖的回归方程、相关系数、最低检测限和线性范围
Table 1 The regression equation，correlation eoefficent，limt of detection，liner range of monosaccharide
保留时间 Retention time(rain)
组份 — —
Component 标样 猪屎豆胶
Standard sample Crotalaria lgggronata seed gum
样品含量 添加量 测定值 回收率
Sample content Added Found Recovery
(mg／ml ) (mg／mI ) (mg／mI ) ( )
Xyl
Glc
Gal
Man
0．880
0．900
0．73O
0．750
0．868
0．875
0．942
l_410
98．64
97．2Z
95．83
1O3．68
2004)，铅型有机聚合物的离子络合物糖分离柱 SP—
G 0810对半乳糖和甘露糖的分离效果显著提高，分
离度可达到 97 ～100 ，接近基线分离 。
2．2线性关系和最低检测限量的考察
分别吸取“1．3．2”中的混合标准单糖溶液 200
L，400 L，600 L，800 L，1 000／~L于 1 mL容量
瓶中，分别定容到 l mL，在选定色谱条件下进样 2O
L，测定峰面积。以单糖标准品峰面积(Y)对相应
浓度(x，mg／mL)进行线性回归分析，求出各单糖标
准品的直线回归方程，结果见表 1。再将标糖溶液
逐级稀释，依次进样，计算所对应的标准溶液的质量
浓度以确定最低检测限(LOD)。由表 l可知，在线
性范围2～10 mg／mL内，各单糖与其峰面积有良好
的线性关系。当信噪比(S／N)为 3时，四种单糖的
检 出限在 1．O～2O tg之间。
2．3精密度试验
考察实验方法的精密度：按照“1．3．1”平行制备
测定单糖含量的样品各 5份，连续进样，测量峰面积
值，计算各单糖的 RSD(n一5)，葡萄糖、木糖、半乳
糖、甘露糖的 RSD分别为 1．43％，0．83％，1．53
和 1．5O ，说明各单糖的精密度良好。
2．4回收率试验
精确称取 4种标准单糖配成 1．0 mL溶液，依
次量取 0．1 mL分别加入到猪屎豆种子胶多糖样品
10 mg中，干燥 ，按“1．3．1”方法处理后 ，过 0．45 nrn
膜后定容至 10 mL，测定加样回收率，结果见表 2。
3期 郭守军等：高效液相色谱法分析猪屎豆种子胶多糖中的单糖组成 425
半乳糖和甘露糖 的回收率分别为在 95．83 9／5和
103．68 ，由结果可知回收率较好，方法可行。
3 结论
建立了高效液相色谱法直接测定半乳甘露聚糖
中单糖组份的方法。多糖酸水解后的单糖组分不需
要衍生化 ，可直接进行 HPLC分 析，在 SP-G 0810
糖分析柱上得到了 良好 的分离。相对标准偏差
0．83 ～1．53 ，回收率 95 ～104 。保 留时间
定性可知，猪屎豆种子胶多糖 由半乳糖 和甘露糖组
成，外标法定量得到其单糖组成的摩尔比是半乳糖
：甘露糖一1：2．417，该结果为猪屎豆种子胶多糖
的精细结构研究提供科学依据。此方法简便快速，
可以在20 min内完成。精密度高，结果准确可靠。
为半乳甘露聚糖中单糖组成的分析提供了一种好
方法。
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