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Effects of Ceratocystis fimbriata on phenolics content, PPO and PAL activity in sweet potato

黑斑病对甘薯叶酚类物质含量、PPO及PAL活性的影响



全 文 :广 西 植 物 Guihaia 32(3):406-409                                2012 年 5 月
 
DOI:10.3969/j.issn.1000-3142.2012.05.024
黑斑病对甘薯叶酚类物质含量、
PPO及PAL活性的影响
王景景1,刘美艳1,谢逸萍2,孙厚俊2,张 健1*
(1.徐州师范大学 生命科学学院,江苏 徐州221116;2.中国农科院 甘薯研究中心,江苏 徐州221121)
摘 要:选用对甘薯黑斑病抗性不同的品种南京-92(高抗)和烟台-252(高感)的叶片为材料,研究黑斑病对甘
薯叶总酚含量、绿原酸含量、类黄酮含量以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性和酚氧化酶(PPO)活性的影响。结
果表明:在未受黑斑病侵染时,南京-92叶片中类黄酮含量、绿原酸含量、PAL活性显著或极显著高于烟台-
252,可以作为选育和鉴定抗黑斑病品种的生理指标,但总酚含量和PPO活性差异不显著。接种后2~8d内,
南京-92叶片内总酚含量和PPO活性增加迅速,与烟台-252达到显著或极显著差异,总酚含量和PPO活性的
上升速度快、保持时间长,有利于提高对黑斑病的抵抗能力。
关键词:甘薯;黑斑病;总酚;绿原酸;类黄酮;苯丙氨酸解氨酶;酚氧化酶
中图分类号:S435.31  文献标识码:A  文章编号:1000-3142(2012)03-0406-04
* Effects of Ceratocystis fimbriata on phenolics
content,PPO and PAL activityin sweet potato
WANG Jing-Jing1,LIU Mei-Yan1,XIE Yi-Ping2,
SUN Hou-Jun2,ZHANG Jian1*
(1.School of Life Sciences,Xuzhou Normal University,Xuzhou 211116,China;2.Sweet Potato
Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Xuzhou 221121,China)
Abstract:Two varieties of sweet potato including high resistance-Nanjing-92and high susceptible-Yantai-252to Cer-
atocystis fimbriata were used for detection the content of total phenol,chlorogenic acid,flavonoid and the activity of
PPO and PAL in sweet potato leaves.The results showed that flavonoid content,chlorogenic acid content and PAL
activity of Nanjing-92were higher than that of Yantai-252and even reached significant or extremely significant differ-
ence in normal condition,which could be regarded as physiological indices of identifying and selecting resistant variety.
It was also found that total phenol content and PPO activity of two varieties were not significant different in normal
condition,however,when infected by C.fimbriata,total phenol content and PPO activity of Nanjing-92increased
sharply and significant or extremely significant higher than that of Yantai-252within 2th to 8th day.The total phenol
content and PPO activity raised speedily and maintained long period which could increase the resistance ability to C.
fimbriataof sweet potato.
Key words:sweet potato;Catalysts fimbriata;total phenol;chlorogenic acid;falconoid;phenylalanine ammonia
lyase;polyphenol oxidase
* 收稿日期:2011-12-23  修回日期:2012-04-08
基金项目:中央公益性行业(农业)科研专项 (nyhyzx07-012-01);国家甘薯产业技术体系协作课题 (CARS-11-B-09-A)[Supported by Special Agro-
Scientific Research Fund for the Public Interests(nyhyzx07-012-01);the National Coordination Task of Sweet Patato Industry Technology System
(CARS-11-B-09-A)]
作者简介:王景景(1967-),女,江苏徐州人,硕士研究生,从事生物化学与分子生物学的研究,(E-mail)zzzwangjing@126.com。
*通讯作者(Author for correspondence,E-mail:zhangjian@xznu.edu.cn)
  甘薯((sweet potato,Ipomoea batataslam)是
我国重要粮食之一,而甘薯黑斑病(Ceratocystis
fimbriata Elis.et Halst)是甘薯栽培和贮藏中的
重要病害之一(周茂繁等,1992)。据统计,我国每年
由该病造成的产量损失为5%~10%,危害严重时
造成的损失为20%~50%,甚至更高。我国已将该
病列为国内检疫对象,筛选、种植抗病品种是最重要
的综合防治措施。近年来对甘薯黑斑病的研究主要
集中在抗性资源筛选和品种选育、抗性遗传和抗性
鉴定方法研究,抗病基因分子标记、药剂防治等方
面,甘薯抗黑斑病生理生化机制研究较少。甘薯抗
黑斑病的生理过程相当复杂,抗病性的高低受植株
体内多种抗性生理进程的综合影响。植物酚类化合
物是植物次生代谢物的主要类型之一(Balasundram
等,2006),是苯丙烷类代谢的途径的产物,该途径中
催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶-苯丙氨酸解氨
酶(PAL),是酚类物质、植保素、黄酮和木质素等抗
菌物质合成过程中关键酶和限速酶(Dixon等,
2002)。酚类物质对于植物抗病性有着重要的作用,
而这些物质的含量总是与PAL的活性密切相关,因
此PAL被认为是植物中重要的防御酶。酚类化合
物本身对病原物具有毒害作用(Ndubizu,1976),而
酚类植保素如绿原酸和黄酮类植保素等在阻碍入侵
病原菌菌丝的正常发育的同时对植物也起到一定的
保护作用。酚类物质氧化产物较酚类物质的杀菌能
力强许多倍,例如,绿原酸酶促氧化产物的杀菌力比
本身提高了30%。有些酚类物质原来不具备杀菌
能力,酚氧化酶氧化后转化成杀菌物质,因此多酚氧
化酶(PPO)也被认为与植物的抗病性关系密切(陈
伟等,1997)。甘薯抗黑斑病的酚类物质代谢研究未
见报道。本试验以甘薯叶为材料,通过人工接种黑
斑病菌,研究酚类物质与甘薯黑斑病抗性之间的关
系,以期为鉴定和选育抗黑斑病品种提供可靠的抗
性指标和理论依据。
1 材料与方法
1.1供试甘薯品种及黑斑病菌悬浮液的制备
供试甘薯品种:南京-92(高抗黑斑病)和烟台-
252(高感黑斑病)。甘薯黑斑病病原物由江苏省徐
州市农科院中国甘薯研究中心提供。在PDA平板
培养基上接种甘薯黑斑病菌,26℃培养箱倒置培
养,当整个平板长满菌丝,孢子呈黑色时,向平板内
加入无菌水,用接种环剥离孢子,制成孢子悬液,用
血球计数板在显微镜下计数,配成每1mL为1×
107 孢子的悬浮液备用。
1.2试验方法
剪生长一致的甘薯心叶下6个茎节的薯苗,将
薯苗茎基部剪口对齐后浸入菌液3~5cm 深,20
min后取出,以此作为处理组,以浸入清水20min
为对照组,将处理组和对照组薯苗栽在无病蛭石里,
栽后浇水保湿,每2d取长势基本相同的第二、三完
全展开的功能叶进行各项指标测定,3次重复取样。
总酚含量的测定参照林植芳等(1988)的方法。
绿原酸含量的测定:取待测样品0.2g加入无水乙
醇(1∶5W/V)室温下提取1h,取上清液,用752紫
外及可见分光光度计于324nm下测定 OD值,以
OD324/g-1 FW/mL-1表示甘薯叶片中绿原酸的相对
含量。类黄酮含量的测定参照庄炳昌等(1993)的方
法。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定参照王敬
文等(1982)的方法。酚氧化酶(PPO)活性的测定参
照李忠光等(2005)的方法并加以改进,取0.1g样
品于研钵中,加500μL pH5.8柠檬酸—磷酸缓冲
液冰浴上研磨,然后转移到离心管中,再加500μL
缓冲液定容至1mL,摇匀。在冷冻离心机上10 000
r/min-1离心15min,取上清液测定酶的活性,反应液
为3mL邻苯二酚和0.1mL酶提取液,用0.1mL蒸
馏水代替酶提取液作空白对照,于波长410nm下测
定反应液光密度值(OD)的变化,把每1min光密度值
变化0.01定义为一个酶活性单位(U)。
试验数据用SPSS17.0软件进行统计分析,P<
0.05为显著性差异,P<0.01为极显著性差异。
2 结果与分析
2.1黑斑病对两种不同抗性薯叶中总酚含量变化的
影响
  黑斑病对甘薯叶片总酚含量的影响见图1。未
接菌前,高抗品种南京-92与高感品种烟台-252总
酚含量3次取样平均值分别为10.91mg/gFW 和
9.01mg/gFW,差异不显著。接种病原菌后南京-
92叶片内总酚含量迅速上升,在第6天达到峰值,
随后开始逐渐下降。烟台-252总酚含量变化曲线
与南京-92趋势一致,但是增加速度较慢。分析表
明,接种病原菌后2~8d时,南京-92叶片内总酚含
量极显著高于烟台-252。高抗品种在接菌初期总酚
7043期       王景景等:黑斑病对甘薯叶酚类物质含量、PPO及PAL活性的影响
含量迅速达到较高水平,在较长一段时间内保持高
浓度,这对于抵抗病原菌的入侵有着积极的意义。
图1 黑斑病对甘薯叶片总酚含量的影响
Fig.1 Effects of Ceratocystis fimbriata on total
phenol content of leaves of sweet potato
*P<0.05,表示南京-92处理组与烟台-25处理组差异达显著水
平;**P<0.01,表示南京-92处理组与烟台-252处理组差异达
极显著水平。下同。
*P<0.05,significant difference between NanJing-92and Yan-
Tai-252;**P<0.01,extremely significant difference between
NanJing-92and YanTai-252.The same below.
图2 黑斑病对甘薯叶片绿原酸含量的影响
Fig.2 Effects of Ceratocystis fimbriata on chloro-
genic acid content of leaves of sweet potato
2.2黑斑病对两种不同抗性甘薯叶片绿原酸含量的
影响
  未受黑斑病菌侵染时,高抗品种南京-92与高
感品种烟台-252叶片绿原酸含量差异显著(P=
0.042<0.05),因此可以把叶片绿原酸含量作为甘
薯对黑斑病抗性大小的判断指标(图2)。两品种对
照组绿原酸含量在测量期间变化不明显,南京-92
处理组叶片绿原酸含量高于烟台-252,差异显著性
分析表明,两品种试验组绿原酸含量在0~2d内显
著差异,4~8d内达到极显著差异。
2.3黑斑病对两种不同抗性甘薯叶片类黄酮含量的
影响
  黑斑病对不同抗性甘薯叶片类黄酮含量的影响
见图3。从图3中可以看出,未受黑斑病侵染时,南
京-92和烟台-252叶片中类黄酮含量分别为1.158
和0.871(P=0.001<0.01),差异极显著,所以可以
把薯苗内类黄酮含量的差异作为抗性选育的指标。
接菌后,南京-92和烟台-252叶片中类黄酮含量均
有上升,并且都在第6天达最大值。在0~8d处理
期间,南京-92叶片内类黄酮的含量均高于烟台-
252,差异分析表明,两者差异均达到极显著水平。
图3 黑斑病对甘薯叶片类黄酮含量的影响
Fig.3 Effects of Ceratocystis fimbriata on flavonoid
content of leaves of sweet potato
2.4黑斑病对两种不同抗性甘薯叶片PAL活性的
影响
  未感染黑斑病病菌时,南京-92和烟台-252叶
片中PAL活性分别为322U/g-1 FW(高抗)和220
U/g-1FW(高感),分析表明二者差异达显著水平(图
4),说明供试两个甘薯品种叶片在正常状态下PAL
活性存在差异,可以作为选育抗性品种的指标。受
黑斑病侵染后,高抗品种与高感品种叶片PAL活性
变化趋势相同,但是高抗品种叶片PAL活性增加明
显大于高感品种。分析表明,两品种PAL活性在2
~6d时差异极显著。
2.5黑斑病对两种不同抗性甘薯叶片PPO活性的
影响
  黑斑病对两种不同抗性甘薯叶片PPO活性的
影响见图5。从图5中可以看出,未接种黑斑病菌
时,南京-92和烟台-252叶片PPO活性分别为18
U/mg和13U/mg,差异不显著。接菌后两品种甘
薯叶片PPO活性迅速上升,于第6天达到最大值,
而高抗品种PPO活性增加的速度要快于高感品种,
804 广 西 植 物                  32卷
差异分析表明,接种后2~6d两品种甘薯叶片PPO
活性差异显著。
图4 黑斑病对甘薯叶片PAL活性的影响
Fig.4 Effects of Ceratocystis fimbriata on PAL
activity of leaves of sweet potato
图5 黑斑病对甘薯叶片PPO活性的影响
Fig.5 Effects of Ceratocystis fimbriata on PPO
activity of leaves of sweet potato
3 结论与讨论
酚类物质被认为与植物抗病性有较密切的关系
(庄炳昌等,1993)。植物体内酚类物质的来源有两
个主要的途径,一是植物原始酚类物质的积累,二是
在受病原菌侵染后,宿主细胞作出反应,酚类物质迅
速积累。特别是抗病品种在受侵染时,会积累从莽
草酸或乙酸途径合成的大量酚类物质。酚类物质的
抗病过程中重要的的一个机制是多酚氧化酶(PPO)
的氧化作用使酚类物质转变为具有高毒性的醌类物
质,这些醌类物质对于病原菌磷酸化酶的活性具有
很强的抑制作用,它们作为氧化磷酸化非共扼剂而
进一步对病原物的果胶分解酶、纤维素分解酶等活
性强烈的抑制作用。
本试验结果显示,未受黑斑病浸染时,高抗品种
南京-92甘薯叶片内类黄酮含量、绿原酸含量、PAL
活性就显著或极显著高于高感品种烟台-252,这与
在香蕉受枯萎病菌侵染(胡玉林等,2011)以及甘蔗
受黑穗病菌侵染(龚得明等,1995)的研究结果一致,
由此可以把甘薯叶片内类黄酮含量、绿原酸含量、
PAL活性作为选育和鉴定抗黑斑病品种的生理指
标。王涛等(2011)研究不同抗性的黄瓜被白粉虱侵
染后发现,抗性品种的PAL活性显著高于感性品
种。本试验结果显示受黑斑病浸染后,高抗品种南
京-92叶片内类黄酮含量、绿原酸含量、PAL活性要
高于烟台-252,从而提高了甘薯对黑斑病的抵抗能
力。在接种溃疡病菌前不同抗性的杨树之间酚类含
量差异都很明显(理永霞等,2011),而不同抗性品种
的小麦受白粉菌侵染前PPO活性无明显差异(王宏
梅等,2009)。本试验结果显示未感染黑斑病时,虽
然总酚含量和PPO活性差异不显著,但染菌后抗病
品种叶片内总酚含量和PPO活性比感病品种的积
累速度快、保持较高浓度时间长,从而有利于抵抗病
原菌的侵害。
本试验测定了甘薯感染黑斑病初期,叶片内几
种次生代谢物质和酶活性的变化,以期探讨它们和
甘薯黑斑病抗性之间的关系,随着黑斑病病情的进
一步扩展和发病级别的升高,相应生理指标和酶活
性的变化规律是需要进一步研究的内容。
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9043期       王景景等:黑斑病对甘薯叶酚类物质含量、PPO及PAL活性的影响
51.4(C-243)、32.3(C-25)、21.3(C-26)、19.2(C-
27)、25.6(C-28)、12.5(C-29)。上述数据与任风芝
等(2001)报道的豆甾醇碳氢谱数据基本一致,故鉴
定化合物5为豆甾醇(Stigmasterol)。
化合物6 白色针状晶体,mp 283~285℃,溶
于丙酮、吡啶、氯仿,难溶于甲醇。该化合物在TLC
上喷洒5%硫酸-乙醇液后烤板显红色的斑点,且有
拖尾现象,在展开剂中加少量酸后,拖尾现象消失,
说明该化合物含有羧基。Liebermann-Burchard反
应阳性,1 H-NMR(300MHz,CDCl3)δ:5.14(1H,t,
J=3.6Hz,H-12),3.20(1H,dd,J=12.0,5.0Hz,
H-3),3.53(q,J=9.3Hz,CH2OH),1.26(3H,s,
29-CH3),1.10(3H,s,27-CH3),1.02(3H,s,23β-
CH3),1.01(3H,s,24α-CH3),1.00(3H,s,30-
CH3),0.95(3H,s,26-CH3),0.93(3H,s,25-
CH3);13C-NMR(125MHz,pyridine-d5)δ:38.3(C-
1)、27.0(C-2)、79.0(C-3)、39.9(C-4)、56.8(C-5)、
19.7(C-6)、34.1(C-7)、40.3(C-8)、49.0(C-9)、38.3
(C-10)、24.7(C-11)、123.5(C-12)、145.7(C-13)、
42.9(C-14)、28.9(C-15)、24.7(C-16)、47.6(C-17)、
43.1(C-18)、47.4(C-19)、31.9(C-20)、35.1(C-21)、
34.1(C-22)、29.3(C-23)、16.5(C-24)、16.5(C-25)、
17.4(C-26)、27.0(C-27)、181.1(C-28)、34.1(C-
29)、24.7(C-30)。上述数据与张敉等(2001)报道的
熊果酸碳氢谱数据基本一致,故鉴定化合物6为熊
果酸(Ursolic acid)。
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