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Method of genomic DNA extraction of the herb Blumea balsamifera

药用植物艾纳香基因组DNA提取方法研究



全 文 :广 西 植 物 Guihaia 29(6):763—767 2009年 11月
药用植物艾纳香基因组 DNA提取方法研究
庞玉新1 ,王文全1*,张影波2_3,刘国道2,莫廷辉0
(1.北京中医药大学 中药学院,北京 100102;2.中国热带农业科学院 热带作物品种
资源研究所 ,海南 儋州 571737;海南大学 农学院,海南 儋州 571737)
摘 要:以药用植物艾纳香为研究对象 ,以一20℃保存 、4℃保存 、室温 自然于燥和硅胶于燥四种样品保存方
式,并采用 SDS法 、CTAB法 、SDS—CTAB法和改良CTAB法 4种不同的基因组 DNA提取方法进行了对比试
验,以期建立艾纳香的较好的样品保存方法和基因组 DNA提取方法。结果表明,2O℃保存是艾纳香的较理
想的样品保存方式;改良 CTAB法是艾纳香基因组 DNA提取较适宜的方法,该方法提取的 DNA经紫外检
测,其 A26o/A28o为 1.8左右,明显优于 SDS法 (1.1~1.5)、CTAB法(1.2~1.5)和 SDS-CTAB法 (1.4~
l_6),琼脂糖凝胶电泳、酶切检测和 PCR扩增也得出了同样的结论。
关键词 :艾纳香;基因组 DNA;提取 ;方法
中图分类号:Q943 文献标识码 :A 文章编号:1000—3142(2009)06—0763—05
Method of genomic DNA extraction of
the herb B lumea balsamifera
PANG Yu-Xinl2,WANG Wen-Quan1 ,ZHANG Ying-Bo2,u,
LIU Guo—Dao 2,MO Ting-Hui3
(1.Colege of Chinese Medical Sciences,BeQing University of Traditional Chinese~V[edicine,Beijing 100102,China;
2.China Tropical Crops Genetic Resources Institute of Chinese Academy 0厂Tropical Agricultural Sciences,
Danzhou 571737,China;3.College of Agriculture,Hainan University,Danzhou 571737,China)
Abstract:The paper dealt with setting up a more suitable sample preservation way and genomic DNA extraction
method for Blumea balsamifera by comparing and analysing four sample preservation ways(preserved at一2O℃,pre—
served at 4℃,natural drying and silica gel drying)and extraction methods(SDS,CTAB,SDS-CTAB,and modified of
CTAB).The results showed that一20℃ was a better way for sample preserxtali(1I]fil({the modified CTAB method
was a better method for DNA extraction than others.The UV detection value of Az6o Az8o was 1.7一 1.8 for DNA
extracted by this modified CTAB method,obviously higher than that of others,such as 1.1— 1.5 for SDS method,1.
2——1.5 for CTAB method,1.4——1.6 for SDS-CTAB method.The agarose electrophoresis,restriction endonuclease
digestion detection and PCR amplification also indicated that the modified of C:TAB method was better than others.
Key words:Blumea balsamifera;genomic DNA;extraction;method
艾纳香(Blumea balsamifera)为菊科艾纳香属多
年生木质草本植物 ,别名大风艾 、大风叶、冰片艾等,
全草入药。富含挥发油等成分,具有开窍醒神,清热
止痛等功效,是苗族、黎族、壮族等民族重要的民间用
药,又是天然冰片的重要原料之一(黄卫东等,2008)。
DNA的分离提取是进行植物分子生物学研究
工作的基础,也是分子生物学实验的关键步骤,但由
于不同的植物材料细胞 中所含次生代谢产物的种类
收稿日期:2008—09—05 修回日期 :2009—06—13
基金项目:国家自然科学基金(30860370)[Supported by the National Natural Science Foundation of china(3O860370)]
作者简介:庞玉新(1 975-),男(内蒙古人),博士生 ,研究方向为中药材质量形成机制与分子生药学,(E-mail)pyxmarx@1 26.corn。
通讯作者(Author for c0rrespondence,E—mail:wwq57@126.com)
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和含量不同,所 以不同植物的 DNA 提取方法也不
尽相同。当前 ,小麦 、水稻等重要农作物的植物细胞
总 DNA提取己有较成熟技术方案(Scott等,1988;
孙鑫等,2004;楼巧君等,2005)但有关诸多珍稀濒危
植物及传统的药用植物的总 DNA的提取方法仍处
于不断探索之中(邹喻苹等 ,1994a;李钧敏 ,2002;侯
义龙 ,2003;陈莉等,2007)。艾纳香植物组织中含有
丰富的酚类 、色素、单宁及酯类等成分 ,若提取方法
不当,不仅容易使提取 的基因组 DNA 降解,而且可
能会使提取的基因组 DNA含有较多的酚类、色素
等杂质 ,进而影响 PCR扩增反应 的稳定性和重复
性。本实验选取 4种常规提取植物基 因组 DNA的
方法 ,稍加改动,分别用于提取艾纳香基因组 DNA,
通过检测结果的比较,筛选 出一种 比较适合艾纳香
DNA提取的方法 ,为艾纳香属植物的系统发育及遗
传多样性研究提供技术支持 。
1 材料与方法
1.1材料来源
叶片来源于中国热带农业科学院热带作物品种
资源研究所南药种质圃。选取无病虫害的一年生嫩
叶,采后迅速置于冰盒中并带回实验室 ,除去主叶脉
后在电子天平上精确称取0.5 g,分别置于不同的处
理下保存 3 d后用于 DNA提取 ,这 四种处理方法
是:(a)一2O℃保存 (b)4℃保存(c)室温 ,通风避光干
燥(d)室温,硅胶干燥 。
1.2 DNA提取方法
(1)SDS法(Pich& Schubert,1993):取经处理
过的叶片 0.5 g,用液氮研磨 均匀后置于 15 mL离
心管 中,并迅 速加入 2.5 mL,65℃ 预热 5×SDS
DNA提取液[0.1 tool/L Tris—HC1(pH8.0),0.05
mmol/L EDTA(PH8.0),0.5 mmol/L NaC1,5
SDS,2 的 PVP(聚乙烯吡咯烷酮,下 同),2 (V/
V)p一巯基乙醇(用前加人),(Sigma,2002)],在 65
℃的水浴中温浴 30 13~lin。加 800 L的 5 mol/L的
KAc,混 匀后 冰浴 3O rain,12000 r/rain离 心 l5
rain。上清转入另一离心管,室温下用等体积的异
丙醇沉淀3O rain,12 000 r/rain离心 15 rain(4℃),
弃上清液。管中加入 2oo L冷冻的 75%的乙醇洗
涤沉 淀 2次 ,干 燥 沉 淀。沉 淀 用 500 L TE
(pH8.O)充分溶解,加等体积 tr[s酚/氯仿/异戊醇
(25:24:1),轻颠几次混匀 ,于 4℃,10 000 r/min
离心 10 rain。上清液转人另一离 心管,加入 6 L
RNAase(10 mg/mL)于 37℃温浴 45 rain。用等体
积氯仿/异戊醇(24:1)抽提 ,上清液转入另一离心
管,加终浓度为 1/10体积 5 mol/L的 NaAc的,混
匀,加入 2倍体积的无水乙醇,轻缓混匀,室温放置
30 rain以上;以 12 000 r/rain的速度离心 15 rain,
加入 200 L冷冻的 75 的乙醇洗涤沉淀 2次 ,吹
干沉淀;加入 5O L ddH:0溶解 DNA,4℃保存
备用 。
(2)CTAB法(邹瑜苹等,2001b)取经处理过的
叶片 0.5 g,用液氮研磨均匀后置于 l5 mL离心管
中,并迅速加入 2.5 mL,65℃预热 2×CTAB DNA
提取液[O.1 mol/L Tris HCI(pH8.0),0.05 mol/L
EDTA(PH8.O),1.4 tool/L NaC1,2 CTAB,2 的
PVP,2 (V/V)j3一巯基 乙醇(用前加入)],在 65℃
的水浴中温浴 30 min。加入等体积的 Tris酚/氯仿
/异戊醇(25:24:1)混匀后 ,12 000 r/min离心 15
rain。上清转入另一离心管加入等体积的异丙醇混
匀后室温放置 10 rain,12 000 r/rain离心 10 rain,弃
上清液。管 中加人冷冻的 75 的乙醇 2OO L乙醇
洗涤 2次,干燥沉淀。沉淀用 500 L TE(pH8.0)
充分溶解 ,加入 6 L的 RNAase(10 mg/mL)于 37
℃温浴 45 rain,加等体积氯仿/异戊醇 (24:1),轻
颠几次离心管 ,放置片刻,4 oC 10 000 r/rain离心
10 rain。上清液转入另一离心管 ,加终浓度为 l/10
体积 5 mol/L的 NaAc的,混匀,加入 2倍体积的无
水乙醇,轻缓混匀 ,室温放置 30 rain以上 ;12 000 r/
rain离 15 rain,75 的乙醇洗涤 2次,吹干沉淀;加
入 5O L ddH:0溶解 DNA,4℃保存备用。
(3)SDS—CTAB结合法 (参照孙鑫等,2004;黄
绍辉等 ,2007)取经处理过的叶片 0.5 g,用液氮研磨
均匀后置于 15 mL离心管中,并迅速加入 2.5 mL,
65℃预热 5×SDS DNA提取液[0.1 mol/L Tris—
HCl(pH8.0),0.05 tool/I EDTA(PH8.0),0.
mol/L NaC1, SDS,2 的PVP,2 (V/V)p一巯基
乙醇(用前加入),(Sigma,2002)],在 65℃的水浴
中温浴 30 rain。加 1 mL的 5 mol/L的 KAc,混匀
后冰浴 30 rain,12 000 r/rain离心 15 rain。取上清,
加入 ]/5体积 的 2×CTAB DNA提取液 ([0.1
mol/I Tris—HCl(pH8.0),0.05 mol/L EDTA
(PH8.0),0.5 mol/L NaC1,2 CTAB,2 的 PVP,
2 (V/V)l3一巯基乙醇(用前加入)],充分混匀,65
℃水浴 10~20 rain。冷却至室温后,加入等体积的
6期 庞玉新 等:药用植物艾纳香基 因组 DNA提取方法研究 765
Tris酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)混匀后,12 000
r/rain离心 15 rain。上清转入另一离心管加入等体
积的异丙醇混匀后室温放置 10 rain,l2 000 r/rain
离心 10 rain,弃上清液。加入 200 L冷冻 的 75
的乙醇 洗 涤 沉 淀 2次 ,干 燥 沉 淀。沉 淀 用 500
t~LTE(pH8.o)充分溶解,加入 6 L的 RNAase(10
mg/mL)于 37℃温浴 45 rain,加等体积氯仿/异戊
醇(24:1),轻颠几次离心管,放置片刻 ,4℃ 10 000
r/min离心 10 rain。上清液转入另一离心管,加终
浓度为 1/10体积 5 M 的 NaAc的 ,混匀 ,加入 2倍
体积的无水乙醇 ,轻缓混匀 ,室温放置 3O rain以上;
12 000 r/rain离 心 15 rain,加入 200 L冷冻 的
75 的乙醇洗涤沉 淀 2次 ,吹干沉 淀;加入 50 L
ddH20溶解 DNA,4℃保存备用。
(4)改 良 CTAB法 (Licy等,2000;安泽伟 等,
2OO5)取经处理过的叶片 0.5 g,用液氮研磨均匀后
置于 15 mL离心管 中,并 迅速加人 2.5 mL DNA
buferEO.35 mol/L的甘露醇,0.1 mol/L Tris—HC1
(pH8.0)、0.005 tool/L EDTA(pH8.0)、2 (W/
V)PVP,2 (V/V)p一巯基 乙醇(用前加入)]混匀
后 ,冰上放置 2o rain,于 4℃下以 4 000 r/rain离心
2O rain。弃去上清液 ,沉淀 中加人 65℃预热的 2.5
mL 2×CTAB DNA提取液[0.1 mol/L Tris—HC1
(PH8.0),0.05 mmol/L EDTA(pH8.0),1.4 tool/
L NaC1,2 CTAB,2 的 PVP,2 (V/V)l3一巯基
乙醇(用前加入)],混匀后于 65℃水浴中保温 3O
rain。加入等体积 的 Tris酚/氯仿/异戊醇(25:24
:1)混匀后 ,12 000 r/rain离心 15 rain。上清转入
另一离心管加入 6 L的 RNAase(10 mg/mL)于 37
℃温浴 45 rain,再加入 10 L(10 mg/mL)的蛋 白酶
K于 37℃温浴 45 rain后加人等体积氯仿/异戊醇
(24:1)混匀后,12 000 r/rain离心 15 rain。上清转
人另一离心管加入等体积的异丙醇混匀后室温放置
10 rain,12 000 r/min离心 10 rain,弃上清液。管中
加入冷冻的 75 的乙醇 200 L洗涤 2次,干燥沉
淀,加入 5O L ddH 0溶解 DNA,4℃保存备用。
1.3 DNA样品的紫外消光值检测
在各种方法提取 DNA样品 5 L中加 ddH。0
495 tlL混匀后 ,用石英 比色杯于 Genova蛋白质分
析仪中测定紫外消光值,根据其在 260 nm和 280
nm波长处的光吸收值计算 DNA产率,根据 A。。/
A 判断 DNA样品的纯度。DNA样 品的浓度( g/
mI )为:在 260 nm的紫外消光值 ×核酸稀释倍数 ×
5o。纯 DNA样品 A2。/A2。紫外消光值应为 1.6~
1.8。A2 。/A2∞值大于 1.9时,表明有 RNA污染,小
于 1.6时,表明样品中存在蛋白质或酚污染。
1.4琼脂糖凝胶电泳检测
各种 DNA提取方法所得 DNA样品 5.0 L,
加入 1 L TIANGEN 6×loading Buffer在 1.0
琼脂糖(含 0.5 t~g/mLEB)凝胶中,加入 1×TAE缓
冲液 ,3~4 V/cm 电压下 电泳,3~4 V/cm 电压下
电泳 2.5 h左右 ,在 UVP公司 GDS一8OOO凝胶成像
系统上观察并拍照。比较各种方法的 DNA质量。
1.5酶切检测
各种 DNA提取方法所得 DNA样 品 5.0 L,
参照 TaKaRa公司的 EcoRV的使用说 明,分别加入
EcoRV 0.2 L,1O×H Buffer 0.4 L,加 ddH20至
2O L,37℃温浴过夜 ,加入 1 L 10×loading Buff—
er后在 1.0 琼脂糖(含 0.5 t~g/mLEB)凝胶中,电
泳后在凝胶成像系统上观察并拍照。
1.6 PCR扩增检测
各种 DNA提取方法所得 DNA样 品 1.0 L,
引物(碱基序列为 TTCCCCCCAG)2.0 tlL,TIAN—
GEN 2×taq PCR MasterMix 10 L,加 ddH20至
2O L。扩增程序为 :94℃预变性 3 min,94℃变性
40 S,34℃退火 3O S,72℃延伸 1 rain,30个循环,72
℃最后延伸 10 rain,4℃保存。PCR扩增产物直接
在 1.5 琼脂糖(0.5 t~g/mL EB)凝胶 中电泳,电泳
后在凝胶成像系统上观察并拍照。
2 结果分析
2.1紫外消光值检测
各种方法所 提取 的 DNA 溶 解于 等量 5O L
ddHz0后 ,由于所含杂质的种类和数量 的差异,它
们所表现 出的颜 色深浅不一。改 良 CTAB法所得
DNA不仅 A 。/Azs。在 1.8左右,其颜色也明显浅
于其它方法所得 DNA。在其它几种方法中,酚类、
多糖等次生物质与核酸形成复合物,使 DNA难于
溶解或产生不同程度的褐变,影响了所提 DNA含
量和纯度(表 1)。
2.2琼脂糖凝胶电泳检测
从 4种方法提取 DNA 的琼脂糖电泳凝胶成像
照片(图 1)可见,改良 CTAB法提取 DNA质量较好,
条带较强,残留杂质少,SDS法和 CTAB法的条带虽
强,但点样孔有较多残留的糖类和蛋白质等杂质。
766 广 西 植 物 29卷
表 1 不同处理下和不同提取方法的 DNA
提取的紫外消光值和产率
Table 1 Value and extraction percentage of
different DNA extraction methods and
different experimental treatments
注 :a1,a2,a3和 a4分别表示一2O℃条件保存 3 d后采用 SDS法 ,
CTAB法 ,SDS—CTAB法和改 良CTAB法提取 的 DNA;bl,b2一d3,
d4则分别表示不同处理 ,不同提取方法下 的 DNA提取结果。下同。
Note:81,a2,a3 anti a4 are respectively the DNA extratiom results
of SDS method,CTAB method,SDS—CTAB method and modified
CTAB method,perserved at一20℃ for 3 days;blIb2一d3,d4 werethe
rcSki1tS of dlffcrent persation way and different extraction methods.
Th sanlc below.
2.3酶切检测
从 4种方法提取 DNA的琼脂糖电泳凝胶成像
照片(图 1)可见,改 良 CTAB法提取 DNA质量较
好 ,条带较强,残 留杂质少,可 以被 EcoRV完全 酶
切。SDS法和 CTAB法则只能被部分酶切。
2.4 PCR扩增检测
从 PCR 扩 增 反 应后 的 电泳 图谱看 (图 2),
CTAB法和改 良 CTAB法提 取的 DNA 均可用 于
PCR扩增,扩增产物有较清 晰的电泳条带,且条带
数较 多,可用 于进 一步 的分 子生物 学研究,但是
CTAB法直接提取 2o℃保存和 4℃保存的样品时
则会出现点样空中有较 多的杂质。SDS法和 SDS—
CTAB提取一2O℃保存和 4℃保存的样品 DNA时
由于杂质较多无法扩增 。
3 结论与讨论
3.1不同方法抽提艾纳香基因组 DNA的质量与产量
用不 同的 方法 抽 提艾 纳 香 嫩 叶 的 DNA,从
DNA色泽上看 ,CTAB法和改 良 CTAB法所得的
DNA基本上是无色的,而 SDS法 SDS—CTAB法所
得 DNA的色泽 为黑色或黄褐色,可能污染有色素
或醌类物质。各种方法抽提的DNA经紫外分光度
图 1 各种方法提取的DNA和 EcoRV酶叨的电泳
Fig.1 Electrophoresis of DNA and its digesting with EcoRV sorts of experimental treatments and sorts of extraction methods
①a1,a2⋯⋯d3,d4分别表示不同处理,不同提取方法下的DNA提取结果;②al ,a2 ⋯⋯d3 ,d4 分别表示不同处理,不同提取方法下的DNA
酶切结果 ;③M:Lambda DNA/Hind II
检测分析结果显示 (表 1),改 良 CTAB法所 抽提
DNA的 A。 /A。 。在 1.67~1.8之间,纯度较高,含
较少的杂质,而其它方法所抽提 DNA的 A。 。/A:。
在 1.12~1.7之间不等,说明其质量有很大的不稳
定性 ,且杂质较多,改良 CTAB法得率也较稳定 ,可
达 32.5~87 ug/g鲜重;从琼脂糖凝胶电泳和酶切
检测以及 PCR检测也得出相同的结论,此方法所抽
提 DNA的点样空 中无 蛋 白质污染 ,可以被限制性
内切酶酶切成 一定亮度均匀的条带,PCR扩增也可
以扩增出清晰的条带,而其它方法所抽提的 DNA
或者点样空中有较多的杂质或不能被完全酶切,且
均没有办法扩增出较好的条带。从以上结果分析可
知,改良CTAB法较适合于艾纳香基因组 DNA的
提取。
6期 庞玉新等 :药用植物艾纳香基因组 DNA提取方法研究 767
图 2 各种处理和提取方法的 PCR扩增
Fig.2 PCR amplification of DNA for sorts of experimental treatments and
sorts of extraction method ①M:DL2000(TIANGEN Markers)
3.2不同保存 方法对抽提 艾纳香基 因组 DNA的质
量与产量
由于不同的保存条件,所抽提得到的艾纳香基
因组 DNA 的质量 与产量 都会 有一 定 的影 响,从
DNA溶液色泽上来看 ,一2O℃和 4℃保存所得 的
DNA颜色较浅;而硅胶干燥 和通风避光干燥所得
DNA的色泽为黑色或黄褐色 ,可能伴随着温度的较
高和干燥环境,色素大分子降解为可被异丙醇或乙
醇沉淀的水溶性小分子物质。不同保存方法抽提的
DNA经紫外分光光度检测、琼脂糖凝胶电泳和酶切
检测以及 PCR检测分析结果表明,伴随着保存温度
的升高 ,会显著地降低 DNA的产量,同时也会降低
其中的蛋白质含量,所以对艾纳香叶片保存 的最好
方法是置于一2O℃长期保存或 4℃做短期保存 ,但
当环境条件不允许时,可以采用硅胶干燥保存 。
植物基因组 DNA提取是分子生物学实验的一
个关键环节。不同植物材料含有的次生代谢产物种
类和含量不 同,而 DNA提取方法 改进 的关键是在
不破坏 DNA的前提下尽可能的去除这些杂质。艾
纳香由于其有效成分是龙脑、柠檬烯等萜类与黄酮
类物质 ,其不仅极易氧化,而且呈现一定 的水溶性和
醇类物质可沉淀性,所以提取方法的改进主要是尽
可能地去除这些杂质 ,本改进的 CTAB法相对于其
它 DNA提取方法的不 同之处有:(1)在细胞核裂解
前用提取缓冲液对样品进行预处理 ,通过质壁分离
使细胞质中的大部分多糖,酚类和色素类物质溶解
在提取缓冲液中,利用低速离心使之与含有总 DNA
的样品分离。(2)提取缓冲液中用甘露醇代替葡萄
糖作为稳定剂,不仅可以保持渗透性,而且可以起到
保护样品使之处于一个相对稳定的环境 。(3)用高
浓度 PVP结合多酚类和黄酮类易氧化物质 ,艾纳香
是酚类和黄酮类特别丰富的植物 ,本改 良方法通过
利用PVP中其“CO N一”基随多酚化合物中芳环羟
基数量的增加而加强的结合多酚化合物能力,其结
合成复合物后,通过离心除去。(4)用高浓度巯基乙
醇作抗氧化剂 ,p一巯基 乙醇 主要是利用其“巯”基打
断多酚氧化物酶的二硫键而使之失活 ,防止 酚类化
合物被氧化而不被形成复合物,有利于离心除去酚
类物质 。此外适当地提高 I3一巯基乙醇含量可以有效
去除多糖等次生代谓}物质。(5)利用酚/氯仿/异戊
醇抽提后即开始利用 RNAase去除RNA,这样不仅
可以节省一部分时间,而且亦利用了在较高浓度的
Tris—HC1和 EDTA 下,可 以较完 全地 除去 RNA。
(6)利用蛋白酶 K去处抽 提后剩余的蛋白质 ,避免
了单纯用氯仿抽提无法去除部分的组蛋 白,有效的
去除 DNA 中的杂质 ,获得高质量的基因组 DNA。
我们用这一方法已提取 了近 500个艾纳香样品
的 DNA,均获得较满意 的结果,OD猢/OD 。在 1.6
~ 1.8。大量提取 DNA实验证 明,采用这一方法提
取艾纳香 DNA是切实可行的,所得 DNA没有蛋 白
质、酚类及小分子的污染,不仅可 以满足 RAPD等
对 DNA质量要求不 高的后 续实验 ,而且亦可 以满
足 RFLP等对 DNA质量要求较严格的后续实验 。
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(下转第 791页 Continue on page 791)
6期 凌征柱等:多效唑对珐菲亚的叶绿素含量、抗逆性及活性成分的影响 791
些变化有利于增强珐菲亚生长后期 的抗旱、抗衰老
作用。
对作物进行化学调控,培育健壮植株,最终目的
就是为了提高其产量、改善品质。药用植物不同于
一 般的粮食农作物 ,其品质取决于次生代谢物质(活
性成分)含量 ,珐菲亚品质取决于活性物质——总皂
苷含量。多效唑化学调控处理对其根部总皂苷含量
即珐菲亚品质影响不大。
多效唑是一种高效低毒的植物生长延缓剂,具
有延缓植物生长、抑制茎枝伸长、使茎杆粗壮、促进
分蘖、根系发达、成花和座果、增强抗寒及抗旱性、提
高耐盐性和延缓植物衰老等多种效应 ,在农作物、果
树 、药用植物等方面广泛应用(黎建玲等,2006;李明
军等,2007;付传明等,2007)。用多效唑适期化控处
理珐菲亚植株是一项简单易行 、有效 的化学控制途
径 ,并且用量少,成本低 ,不会造成环境污染和公害,
建议在使用多效唑化控处理珐菲亚大 田植株时,在
250~3O0 mg/L之问较为合适。
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