全 文 ：　 　 倡 福建省青年创新基金（２００６F３０２５）资助
　 　 倡倡 通讯作者
收稿日期 ：２００５唱１０唱２８ 　 改回日期 ：２００５唱１２唱３１
温度对淡紫拟青霉 NH唱PL唱03 菌株培养特性及毒力的影响 倡
李 　芳１ 　刘 　波２ 倡倡 黄素芳２
（１畅 福建农林大学植保学院 　 福州 　 ３５０００２ ； ２畅 福建省农业科学院生物技术中心 　 福州 　 ３５０００３）
摘 　 要 　 试验测定了淡紫拟青霉 NH唱PL唱０３ 菌株在不同温度条件（１５ ～ ３５ ℃ ）下培养过程中生长特性（OD 值 、pH
值 、菌丝干重 、孢子量 、基质消耗）的变化趋势及对线虫的致死率 ，系统研究温度对淡紫拟青霉生长的影响 ，结果表
明 ：温度不仅影响菌体的生长 ，且影响次生代谢物的毒力 。 在 １５ ～ ３０ ℃ 范围内 ，菌体生长 、孢子生成及基质消耗
（C 、N）速率随温度升高而升高 ；２５ ℃ 为菌体生长的最合适温度 ，培养第 ５d 进入快速增长期 ，第 ９d 菌丝干重达到
１畅０８g ，第 １０d菌液孢子量达到 ４０１畅２ 万个／ mL ；３０ ℃ 时总体毒力最高 ，第 ７d 培养液对茎线虫的致死率达到
６４畅６０ ％ ，其次是 ２５ ℃和 ２０ ℃ ，最高致死率分别达到 ５６畅１７ ％ 和 ３７畅２１ ％ ；１５ ℃ 最高致死率仅为 ２４畅７１ ％ 。 说明在一
定范围内 ，温度上升有利于毒力产物生成 。
关键词 　 淡紫拟青霉 　 温度 　 菌丝干重 　 孢子量 　 毒力
Effect of temperature on Paecilomyces lilacinus culture characteristics and its toxicity to Ditylenchus destructor ．LI Fang１ ，LIU
Bo２ ，HUANG Su唱Fang２ （１畅Department of Plant Protection ，Fujian University of Agriculture and Forestry ，Fuzhou ３５０００２ ，Chi唱
na ； ２畅Center of Biotechnology ，Fujian Academy of Agricultural Sciences ，Fuzhou ３５０００３ ，China） ，CJEA ，２００７ ，１５（４） ：１３０ ～ １３３
Abstract 　 In this paper ，the effect of temperature on Paecilomyces lilacinus growth was investigated ．The grow th index
for OD ，pH ，mycelia dry weigh t ，and spore number and their toxic ef fect on nematodes at different temperatures （１５ ～
３５ ℃ ）were analyzed ．Results show that temperature is a key factor of fermentation ．Paecilomyces lilacinus exhibits normal
growth within ２０ ～ ３０ ℃ ，optimum mycelia g row th and sporulation occur at ２５ ℃ ，mycelia biomass reaches １畅０８g in ９
days ，spore number reaches ４畅０１２ × １０６ ／mL in １０ days ．Between １５ ～ ３０ ℃ ，higher temperatures can increase C and N
consumption and toxin production ．At ３０ ℃ ，cultured ７d ，the toxicity to Ditylenchus des tructor can reach ６４畅６０ ％ ．
Key words 　 Paecilomyces lilacinus ，Temperature ，Mycelia biomass ，Sporulation ，Toxicity
（Received Oct ．２８ ，２００５ ；revised Dec ．３１ ，２００５）
淡紫拟青霉［ Paecilomyces lilacinus（Thom）Samson］是许多重要农作物病虫的生防菌 ，此菌能在土壤中
习居并宿存 ，能寄生控制多种植物根结线虫 ，淡紫拟青霉还是多种非土栖害虫如荔枝蝽蟓 、稻黑蝽 、稻叶蝉
等的天敌 。 同时 ，此菌还有明显的拮抗作用 ，能抑制多种农作物病原细菌 、真菌等［１］ 。 温度是菌体生长的重
要因子 ，温度会影响基质和氧在发酵液中的溶解和传递速度 ，影响菌体对某些基质的分解和吸收速度 ，直接
影响发酵反应速率 ，还通过改变发酵液的物理性质间接影响产物合成 。 此外温度还能影响生物合成的方向
和有毒物质的积累 。 温度对液体培养过程的影响是多方面的 ，它是各种因素综合作用的结果［２］ 。 据 Luciana
研究报道 ，最适于淡紫拟青霉生长与产孢的温度条件是 ２５ ～ ３０ ℃ ，最适 pH 为 ５ ～ ９［９］ 。 孙漫红等研究表明 ，
淡紫拟青霉 M唱１４ 菌株发酵滤液对大豆胞囊线虫二龄幼虫有较强的抑杀作用［３］ 。 国外学者研究证实 ，淡紫
拟青霉发酵液对根结线虫 ２ 龄幼虫有明显的毒杀作用 ，可在 ２４h 内导致 １００ ％ 幼虫死亡 ，且滤液的毒力随发
酵时间延长而增加［１０］ 。 温度对淡紫拟青霉菌生长特性以及杀线虫代谢物毒力的影响报道较少 。 本研究设
置 １５ ℃ 、２０ ℃ 、２５ ℃ 、３０ ℃ 、３５ ℃ ５ 个系列温度 ，从培养过程的 OD 值 、pH 、菌丝量 、孢子量 、C 和 N 含量 、对茎
线虫毒力等 ６ 方面综合考察温度对淡紫拟青霉生长的影响 。
1 　 试验材料与方法
供试菌株为淡紫拟青霉 Paecilomyces lilacinus（Thom ．） Samson st r ．NH唱PL唱０３ ，从感染根结线虫的番茄
根围分离得到 。 供试甘薯茎线虫（ Ditylenchus dest ructor）由福建省农业科学院生物技术中心农业环保技术
第 １５卷第 ４ 期 中 国 生 态 农 业 学 报 Vol ．１５ 　 No ．４
２ ０ ０ ７ 年 ７ 月 Chinese Journal of Eco唱Agriculture July ，　 ２００７
研究室提供 。 淡紫拟青霉 NH唱PL唱０３ 菌株培养基配方为马铃薯 ２００g ，蔗糖 ２０g ，水 １０００mL ，培养条件为每瓶
（容量 ２５０mL）装 ５０mL 培养液 ，用移液枪吸 ０畅２mL 淡紫拟青霉孢子悬浮液（ ≈ ５ 万个／mL） 于每瓶培养基
中 ，恒温摇床温度分别为 １５ ℃ 、２０ ℃ 、２５ ℃ 、３０ ℃ 、３５ ℃ ，转速为 １１０r／min ，培养 ２４h 后开始取样检测 。 每 ２４h
取样 １ 次 ，每次取样 ３ 瓶 ，３０００r／min 离心 １０min ，取上清液做 OD 和 pH 分析 ；用 ７５１ 分光光度计 、波长
６２０nm测定 OD值 ；用 pHS唱２５ 酸度计（上海雷磁仪器厂）测定 pH 值 。 测定菌丝干重时每 ２４h 取样 １ 次 ，每
次 ３ 瓶 ，从三角瓶中倒出所有菌液 ，滤过双层纱布 ，烘干 ，称重 。 测定产孢量 、总 N 量和含糖量时每 ２４h 取样
１ 次 ，每次 ３ 瓶 ，产孢量用血球计数法 ；总 N 量检测用凯氏定 N 法［４］ ；糖含量测定用 ３ ，５唱二硝基水扬酸法［４］ 。
对线虫毒力测定 。 带茎线虫的甘薯切成 ０畅１５ ～ ０畅２０g 小块 ，浸泡于 ４０ ℃ 温水中 ３h ，让薯块中的茎线虫
尽快游出 ，８０００r／min 、４ ℃ 离心 １０min ，弃上清 ，将底部的 １mL 带茎线虫的浓缩液（大约 １００ 只线虫） 滴入
５mL待测菌液中 ，２５ ℃ 恒温箱置放 ２４h ，采用盐刺激法（加 １０ ％ 的 NaCl溶液 ）判断线虫的死活 。 设清水对
照 ，３ 次重复 ，计算甘薯茎线虫校正死亡率 。
以上数据均应用 DPS 数据处理平台 ，采用 Duncan’s 新复极差法进行差异显著性测定［５］ 。
2 　 结果与分析
2畅1 　 温度对淡紫拟青霉 NH唱PL唱03 菌株培养过程 OD620nm值与 pH值的影响
图 1 　 温度对淡紫拟青霉发酵过程 OD620 nm（a）与 pH（b）的影响
Fig畅１ 　 Effects of temperature on OD６ ２ ０ n m （a） and pH（b） of Paecicomyces lilacinus
温度对淡
紫拟青霉 NH唱
PL唱０３ 菌株培
养过程 OD６２０nm
值的影响见图
１a 。 在 １５ ～
３０ ℃ 范 围 内
OD６２０nm 值 的
上升速率与温
度成正比 ，总
体上 OD６２０nm值
随时间推延而上升 ，初期 OD６２０nm值缓慢上升 ，随后明显跃升 ，培养９ ～ １１d达到峰值 ，以后保持相对稳定 。 ３０ ℃ 条件
下 OD６２０nm值上升速率最快 ，培养 ９d上升到 １畅２０４ ；其次为 ２５ ℃ ，第 １０d达到 １畅１４ ，１５ ℃和 ３５ ℃设置 OD６２０nm值变化
处于停滞状态 ，３５ ℃条件下培养后期 OD６２０nm上升主要是由菌液浓缩所引起 。
温度对淡紫拟青霉 NH唱PL唱０３ 菌株培养过程 pH 值的影响见图 １b 。 pH 值总体上随菌丝快速生长而下
降 ，随后上升并维持在中性左右 。 ２０ ～ ２５ ℃ 菌液有明显的中性化趋势 ；３０ ℃ 条件下 ，培养 ４d ，其 pH值达到最
低值 ４畅９０ ；２５ ℃ 、２０ ℃ 培养 ，pH分别在第 ６d 和第 ７d 达到最低值 ４畅８０ 、４畅８５ ；１５ ℃ 培养条件下 pH 值处于平
稳变化状态 ；而 ３５ ℃ 条件下 pH值一直保持初值 ６畅３０ 。
2畅2 　 温度对淡紫拟青霉 NH唱PL唱03 菌株培养过程菌丝干重与孢子量的影响
温度对培养过程菌丝干重的影响见图 ２a 。温度对菌液生物量积累有明显影响 ，总体上菌丝干重随培养历
图 2 　 温度对淡紫拟青霉发酵过程菌丝重量（a）及产孢量（b）的影响
Fig畅２ 　 Effects of temperature on mycelia biomass（a） and sporulation（b）of Paecilomyces lilacinus
期推延 而
增长 ，培养
初期 （２ ～
４d）菌丝重
量增加 缓
慢 ，６ ～ ７d
菌丝量 增
长进入 跃
升期 ，约在
８ ～ ９d 达到
峰值 ，随后
第 ４期 李 　 芳等 ：温度对淡紫拟青霉 NH唱PL唱０３ 菌株培养特性及毒力的影响 １３１　
有所下降并保持相对稳定 。 ２５ ℃ 时菌丝干重增加最快 ，第 ５d 进入快速增长期 ，第 ９d 达到 １畅０８g ；其次为
３０ ℃ 和 ２０ ℃ ；１５ ℃ 时菌丝干重缓慢增加 ，第 １４d 菌丝干重仅达到 ０畅４７g（菌丝干重表示菌丝累积的相对值 ，
测定方式是将整瓶菌液进行过滤称重 。 然而 ，随着培养时间的推延 ，特别是高温度处理 ，菌液浓缩日益显
著 ，到后期菌液量均少于 ５０mL ，因此菌丝干重的单位设为 g） 。
温度对淡紫拟青霉 NH唱PL唱０３ 菌株培养过程产孢量的影响见图 ２b 。 培养初期（２ ～ ３d）产孢量增加缓
慢 ，培养４ ～ ５d产孢量增长进入跃升期 ，约在 ９ ～ １２d产孢量达到峰值 ，随后有所下降并保持动态平衡 。 温度
对菌液的产孢速率与产孢量有明显影响 ，２５ ℃ 条件下产孢量最多 ，第 １０d 菌液孢子量达到 ４０１畅２ 万个／mL ；
３０ ℃ 次之 ，培养 ９d菌液孢子量达到 ３５５畅４ 万个／mL ；其次为 ２０ ℃和 １５ ℃ ，孢子量峰值分别达到 ２９２畅２ 万个／mL
和 １２０畅８万个／mL ；３５ ℃条件基本无孢子产生 。说明 ２５ ～ ３０ ℃ 最适宜产孢 ，温度太低或太高不利于孢子生成 。
2畅3 　 温度对淡紫拟青霉 NH唱PL唱03 菌株培养过程含 N量与含糖量的影响
图 3 　温度对淡紫拟青霉发酵过程含 N量（a）与含糖量（b）的影响
Fig畅３ 　 Effects of temperature on contents of total nit rogen （a） and reducing sugar （b） of Paecilomyces lilacinus
温 度 对
淡紫 拟青 霉
NH唱PL唱０３ 菌
株培 养过 程
含 N 量消耗
有明显影响 ，
试验 结果 见
图 ３a 。 菌 丝
与孢 子生 成
消耗 N ，而孢
子萌 发和 菌
体崩解又释放出 N ，由此导致 N 素的动态消解态势 。 培养 ２ ～ ８d 菌液含 N 量快速下降 ，约在 ９ ～ １２d达到最
低值 ，随后缓慢回升 ，进入动态平衡 。 在 １５ ～ ３０ ℃ 范围内 ，N 素消耗趋势大致相同 ，且 N 素消耗速率基本与温
度成正比 ；培养 ６d ，３０ ℃ 条件总 N 含量从 ０畅０２５２g／kg下降到 ０畅００９７g／kg ，N 消耗 ６１畅５ ％ ；同期 ２５ ℃ 、２０ ℃ 、１５ ℃
条件下 N 消耗分别为 ６２畅０ ％ 、４５畅８ ％ 、２５畅９ ％ ；３５ ℃ 条件下 N 素基本没有消耗 。
温度对含糖量消耗的影响试验见图 ３b ，总体上培养液的含糖量呈动态下降趋势 ，温度与糖消耗速率成
正比 。 ３０ ℃ 糖消耗最快 ，培养 ７d 糖含量从原有的 １９畅７８mg／mL 下降到 ０畅４８mg／mL ，消耗量达 ９７畅 ５７ ％ ；其
次为 ２５ ℃ ，培养 ９d糖含量从原有的 ２３畅９１mg／mL 下降到 ０畅４２mg／mL ，消耗 ９８畅２４ ％ ；２０ ℃ 条件下培养 １１d
糖含量从 １９畅７２mg／mL 下降到 ０畅３２mg／mL ，消耗量达 ９８畅３８ ％ ；１５ ℃ 条件下培养 １４d 时培养液含糖量仍有
５畅６３mg／mL ，糖仅消耗 ６９畅４４ ％ ；而 ３５ ℃ 时糖消耗基本处于抑制状态 。
2畅4 　 温度对淡紫
拟青霉 NH唱
PL唱03 菌 株
培养过程毒
力的影响
由表 １ 可知 ，总
体上培养液对茎线
虫的毒力随发酵历
期延长呈上升趋势 。
３０ ℃ 条件其总体毒
力最高 ，第 ７d 培养
液对茎线虫的致死
率达到 ６４ 畅６０ ％ ；其
次是 ２５ ℃和 ２０ ℃ ，最
　 　 　 　
表 1 　 温度对淡紫拟青霉 NH唱PL唱03 菌株培养过程毒力的影响
Tab畅１ 　 Effects of temperature on the toxicit y of Paecilomyces lilacinus to Ditylenchus des tructor
培养温度 茎线虫校正死亡率 ／ ％ The recti fied mortalit y of Di ty len chus dest ructo r
Culturing ２d ３d ４d ５d ６d ７d ８d
temperature
１５ ℃ ４畅７０ ± １畅５７ ４ ．４５ ± １畅０９ ８畅７２ ± ０畅７９ １５畅２１ ± ０畅５５ １４畅５６ ± １畅７６ １８畅２７ ± １畅７１ ２４畅７１ ± １畅６２
cC dD cCD dD dC dC dD
２０ ℃ ４畅４９ ± １畅 ０９ １４畅７５ ± ２畅１９ ２１畅９１ ± １畅７８ ２４畅１７ ± １畅５８ ３７畅２１ ± １畅３７ ３７畅０８ ± ２畅１６ ３６畅３１ ± ２畅２２
cC cC bB cC cB cB cC
２５ ℃ ９畅８４ ± １畅２４ ２２畅０１ ± ２畅３０ ２２畅４４ ± １畅０６ ２８畅６０ ± １畅６７ ４１畅８１ ± １畅７２ ４７畅６２ ± １畅０１ ５６畅１７ ± １畅６５
bB bB bB bB bB bA aA
３０ ℃ １４畅１ ± １畅５２ ２６畅５４ ± ０畅９１ ３２畅５２ ± ２畅５１ ３８畅８２ ± １畅４６ ５７畅７７ ± ５畅６３ ６４畅６０ ± ５畅９５ ５２畅２３ ± １畅７５
aA aA aA aA aA aA bA
CK ３畅４６ ± １畅５２５ ３畅８９ ± ０畅５４ ４畅６７ ± １畅４８ ５畅４１ ± １畅６２ ６畅１３ ± ０畅３９ ６畅２４ ± ０畅５６ ７畅４７ ± ０畅７５
dC dD dC eE eD eD eE
高致死率分别达到 ５６畅１７ ％ 和 ３７畅２１ ％ ；１５ ℃ 最高致死率仅为 ２４畅７１ ％ ；说明在一定范围内 ，温度上升有利于
毒力产物生成 。 ３５ ℃ 条件下菌不能生长 ，故未做毒力测定 。
１３２　 中 国 生 态 农 业 学 报 第 １５ 卷
3 　 小 　 结
试验表明 ，１５ ～ ３０ ℃ 淡紫拟青霉菌体都能正常生长 ，随着温度升高 ，菌体生长速度及营养消耗的速率也
随之加快 ，进入生长稳定期的时间明显缩短 。 但过高的温度（３５ ℃ ）却严重抑制菌的正常生长 。 发酵培养微
生物的实质就是利用微生物细胞中酶的作用将培养基中无机或有机物质转化为菌体或代谢物 。 从酶促反
应动力学来看 ，温度升高 ，反应速率加快 ，基质消耗和生长代谢加快 ，产物分泌提前 ，但酶本身也很容易因热
而丧失活性 ，当温度超过一定限度（３５ ℃ ） ，酶很快失去活性 ，菌体生长也处于停滞状态［６］ 。 本研究结果完全
印证了这一规律 。 据 Fioret to报道 ，在 １５ ～ ３５ ℃ 区间内 ，淡紫拟青霉菌体都能正常生长 ，这与本试验结果有
一定差异 ，可能是因为菌株的差异所致［１１］ 。
温度既可以影响菌液生理指标（OD 值 、pH 值） 、菌丝生长及产孢速率 ，又影响 C 、N 消耗和菌液次生代谢
物的毒力 。 C 、N 消耗有内在联系 ，当 C 消耗殆尽时 ，N 消耗也处于停滞状态［７］ ；同时 C 、N 消耗与 OD 值 、pH
值 、菌体生物量有明显对应关系 ，当含 C 量迅速下降并达到最低值时 ，OD 值跃升 ，pH值也随之下降 ，达到最
低值 ，随后 ，菌丝生物量和孢子量达到峰值 。
发酵过程 pH 值下降主要是缘于糖酵解产酸及菌丝合成过程产生有机酸 ，随着 N 素利用及发酵后期孢
子消解 ，释放出碱性氨基酸 ，导致 pH 值回升 ，故温度对 pH 值影响的主要途径是改变菌体生长代谢速率 。
２５ ℃条件最适合于菌体生成与孢子产生 ，３０ ℃ 条件有利于毒素分泌 ，菌体生长与次生代谢物生成所需
的最佳温度有所区别 ，因此 ，发酵培养全过程不应只选择一种温度 ，而应根据发酵的不同阶段选择不同的培
养温度 。 在生长阶段应选择最适生长温度 ２５ ℃ ，在次生代谢物分泌阶段 ，应选择次生代谢物生成的最佳温
度 ３０ ℃ ，这样的变温发酵所得产物比较理想 。
采用分批补料方式发酵培养真菌能明显延长菌生长的对数期 ，使菌体生物量得以显著增长［８］ 。 因此 ，
研究温度对淡紫拟青霉培养过程 OD 值 、pH 值 、菌体生长 、基质消耗以及次生代谢物的影响规律 ，有助于正
确判断发酵进程 ，选择合适的调控时机与方法（添加基质或温度调节） ，从而为工厂化生产淡紫拟青霉菌剂
打下基础 。
参 　 考 　 文 　 献
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第 ４期 李 　 芳等 ：温度对淡紫拟青霉 NH唱PL唱０３ 菌株培养特性及毒力的影响 １３３