全 文 ： * ?国家高技术 ( 863)发展计划项目 (2003AA241130)、国家科技攻关项目 ( 2001BA539C )和山西省自然科学基金项目 ( 20021095) 资助
收稿日期 : 2004-07-09 改回日期 : 2004-08-22
蜡质芽孢杆菌 BC98-?发酵液与抑菌
粗提物对黄瓜枯萎病菌的抑菌特性研究 *
高 芬 马利平 乔雄梧 郝变青
(山西省农药重点实验室 太原 030031)
摘 要 试验研究结果表明 ,蜡质芽孢杆菌“BC98-?”发酵液与抑菌粗提物对黄瓜枯萎病菌具有良好抑制作用 , 可
降低孢子萌发率 , 使菌丝生长形态异常 ,且抑菌特性稳定 ,对外界环境有很强的适应力和耐受性。
关键词 蜡质芽孢杆菌“BC98-?” 发酵液 抑菌物质 抑菌特性
The antimicrobial characters of the fermenting liquor of BC98-? ( B . cereus) and its antifungal crude extraction on
Fusariumoxysporum(Schl .) f . sp . cucumerinum Owen . GAO Fen, MA Li-Ping, QIAO Xiong-Wu, HAO Bian-Qing
(Shanxi Key Laboratory of Pesticide Science, Taiyuan 030031, China) , CJEA ,2006,14(1) : 189～192
Abstract The results show that the fermenting liquor of BC98-? and its antifungal crude extraction have a strong
inhibitingeffect on cucumber wilt disease, they can decrease the rate of spore germination and make the hyphae grow
abnormally . Their antimicrobial character is stable and have good endurance to theoutsideenvironment .
Key words B . cereus BC98-? , Fermenting liquor, Antifungal substance, Antimicrobial characters
(Received July 9, 2004; revised Aug . 22, 2004)
针对拮抗菌发酵液在应用于大田时 , 其生态环境与发酵环境有很大的差异 , 本试验研究了蜡质芽孢杆
菌 BC98-?发酵液与抑菌粗提物对黄瓜枯萎病菌的抑菌特性 , 为有效防治蔬菜枯萎病提供理论依据。
1 试验材料与方法
试验于 2002年 8 月～2003 年 8 月在山西省农药重点实验室进行 , 供试 BC98-?菌株系本实验室于
1993～2000年从自沤肥浸渍液分离的 233个菌株中筛选所得 [ 1] ; BC98-?发酵液为大罐发酵 33h 的发酵液
( pH3.0～3. 3) ; 病原菌———黄瓜枯萎病菌 ( Fusariumoxysporum(Schl .) f . sp . cucumerinum Owen) 采自大
田自然发病株 , 并由本实验室分离鉴定。试验分两部分进行 , 分别测定了酸碱、温度对 BC98-?发酵液生物
量和抑菌特性的影响 ,并测定了 BC98-?发酵液抑菌粗提物的抑菌特性。
酸碱处理方法即在无菌条件下每三角瓶 (150mL )装 50mL 发酵液 ,再加入 30%不同 pH 值的酸或碱 , 设
pH1. 50(?)、pH3. 00(?) 、pH4.50(?)、pH9.50(?)、pH11.00(?)、pH12. 50(?) 6 个处理 , 另以加入 30% 无菌
蒸馏水为对照 ( CK ) , 均置室温 7d。温度处理方法即在无菌条件下每三角瓶 ( 150mL ) 装 50mL 发酵液 , 置恒
温水浴锅中分别于 45℃、50℃、55℃、60℃处理 10min(处理时待水浴锅内温度达设定值后 , 将待处理的三角
瓶和另一内装 50mL 水及温度计的三角瓶一同放入 , 以该瓶内温度计达设定温度时开始计时 ) , 设自然室温
放置为对照 ,处理后即置冰箱保存。用平皿稀释计数法测定上述生物量。抑菌特性测定方法即采用平皿法
孢子萌发试验[ 2] , 将经不同处理的 BC98-?发酵液 (浓度为 20% ) 与病原菌液 (40×10下 8～16个新鲜病原菌
孢子/ 视野 ) 按 1∶1( V/ V) 比例混合 , 使发酵液最终浓度为 10% , 每平皿装 10mL 混悬液置 28℃温箱培养
16h后于显微镜检测 (40×10) , 每处理 3次重复 ,每重复观察 10个视野 ,记录孢子萌发、形态变化、厚垣孢子
数目和芽管抑制等状况 ,计算 BC98-?发酵液对孢子萌发总抑制率 :
总抑制率 = 对照萌发率 - 处理萌发率× (1 - 芽管抑制率 )对照萌发率 ×100% (1)
参照裴炎等[ 3] 方法提取并测定 BC98-?发酵液粗提物对高温高压及紫外线的稳定性。酸碱稳定性的测
第 14 ?卷第 1期 中 国 生 态 农 业 学 报 Vol .14 No .1
2 0 0 6 ?年 1 月 Chinese Journal of Eco-Agriculture Jan ., 2006
定[ 4] 即 pH2. 2～8.0用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液测定 , pH9. 0～10. 6用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液测定。用挖
井扩散法测定抑菌效果 , 即将 PDA 平皿 ( 20mL/ 皿 ) 充分干燥后 ,加入 0. 4mL 真菌孢子液 ( 40×10下 1～2个
孢子/ 视野 ) 涂匀 ,用直径 7mm的打孔器等距离打孔 , 每皿打 4个孔 , 每孔加入浓度为 10mg/ mL 抑菌粗提物
处理液 60μL ,置 4℃冰箱过夜 ,然后置 28℃温箱培养 ,以无菌蒸馏水为对照 , 每处理 5次重复 ,于 3d和 7d后
记录抑菌圈大小并分别挑取抑菌圈边缘和对照孔边缘的菌丝块 , 置显微镜观察菌丝生长状况。用悬滴法 [ 2]
表1 酸碱处理对BC98-?发酵液生物量的影响
Tab .1 Effect of acidandalkali on biomass
of BC98-? fermenting liquor
处 理 生物量/ 亿 cfu·mL - 1 N存活率/ %
Treatments Biomass Rate of survival
? 15 ?. 5 54. 39
? 71 ?. 0 249. 12
? 86 ?. 0 301. 75
? 45 ?. 5 159. 65
? 21 ?. 5 75. 44
? 24 ?. 5 85. 96
对照 28 ?. 5 -
测定粗提物对孢子萌发的影响 ,即将浓度为 20mg/ mL 等量粗提
物溶液与真菌孢子液 (10×40下 10～20个孢子/ 视野 )混匀滴于
洁净玻璃片上 ,小心反转置于凹玻璃片上 , 再置纱布保湿的培养
皿内 , 于 28℃温箱培养 8h 后观察孢子萌发、菌丝形态变化状
况 , 并计算孢子萌发抑制率 , 每处理 3次重复 , 每重复观察 10
个视野 , 并用 SPSS 软件对孢子萌发抑制率进行 Duncan新复极
差检验。
2 结果与分析
酸碱对 BC98-?发酵液生物量的影响。试验结果表明 BC98-?
发酵液的生物量仅在加入强酸 ( pH 1. 50)、强碱 ( pH 11.00、
pH 12. 50)后有所下降 ,
其他处理生物量均有不
同程度增加 , 表明发酵
液中 BC98-?拮抗菌在
环境受到酸碱较强影响
下仍能保持较高存活率
并旺盛生长 ( 见表 1)。
酸碱处理后 BC98-?发
酵液对黄瓜枯萎病菌孢
子萌发的影响。试验结
果表明所有处理对黄瓜
枯萎病菌孢子均具有很
表 2 酸碱处理后 BC98-?发酵液对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的影响 *
Tab.2 Effect of BC98-? fermenting liquor treated with acid and alkali on the spore
germination of Fusariumoxysporum (Schl .) f .sp . cucumerinumOwen
处 理 萌发抑制率/ % 孢子溶解率/ % 芽管抑制率/ % 厚垣孢子/ 个·百个 - 1 ?总抑制率/ %
Treatments

Inhibiting rate to
sporegermination
Dissolving rate
of spores
Inhibiting rate to
length of germ tube
Sporangiocyst
spores
Total inhibi-
ting rate
? 38 k. 32 27 ?.49 66 b. 14 11 ?. 18 74 . 55A
? 38 k. 78 15 ?.57 65 b. 42 6 ?. 42 67 . 09A
? 34 k. 54 26 ?.64 73 b. 08 10 ?. 34 78 . 75A
? 32 k. 67 22 ?.39 70 b. 56 14 ?. 58 77 . 36A
? 36 k. 65 22 ?.94 66 b. 87 11 ?. 15 73 . 80A
? 35 k. 43 42 ?.52 67 b. 20 5 ?. 81 74 . 06A
对照 36 k. 78 16 ?.69 72 b. 41 5 ?. 50 78 . 01A
* 相同字母表示新复极差检测差异不显著 ( P = 0 . 05) ,下同。
表 3 温度处理对 BC98-?发酵液生物量的影响
Tab. 3 Effect of temperature on biomass
of BC98-? fermenting liquor
处理温度/ ℃ 生物量/ 亿 cfu·mL - 1 ?生活率/ %
Treatment
temperature
Biomass

Rateof survival

45 ?52 . 5 175 M.00
50 ?15 . 8 52 M.67
55 ?23 . 3 77 M.67
60 ?17 . 5 58 M.33
对照 30 ?. 0 -
强的抑制萌发作用 , 经 Duncan新复极差检验与对照抑制率
相比差异不显著。比较对照和各处理在相同观察视野中的
孢子数发现部分孢子被溶解 (见表 2) , 且显微镜观察亦发现
孢子被溶解时留下的痕迹如形态不完整孢子、破裂孢壁等 ,
观察平皿中菌丝生长状况发现对照菌丝生长茂密、且形成白
色厚实的菌丝片 ,而处理的菌丝短小稀疏、呈绒毛状。
温度对 BC98-?发酵液生物量的影响。BC98-?发酵液
经不同温度处理 10min后 ,除 45℃处理外 ,其他温度处理生
物量均有所下降 ,但存活率均保持在 50%以上(见表 3)。
温度处理后BC98-?
发酵液对黄瓜枯萎病菌
孢子萌发的影响。新复
极差检验表明 ,与对照相
比经温度处理 BC98-?
发酵液对黄瓜枯萎病菌
孢子萌发总抑制率无显
著差异 ( 见表 4) , 孢子
溶解和菌丝生长状况见
表 2。平皿中菌丝生长
表 4 温度处理后 BC98-?发酵液对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的影响
Tab. 4 Effect of BC98-? fermenting liquor treated with temperature on the spore
germination of Fusariumoxysporum (Schl .) f .sp . cucumerinumOwen
处理温度/ ℃ 萌发抑制率/ % 孢子溶解率/ % 芽管抑制率/ % 厚垣孢子/ 个·百个 - 1 ?总抑制率/ %
Treatment
temperature
Inhibiting rate to
sporegermination
Dissolving rate
of spores
Inhibiting rate to
length of germ tube
Sporangiocyst
spores
Total inhibi-
ting rate
45 B6 W.84 29 ?.00 75 b. 04 3 ?. 77 76 . 06A
50 B6 W.84 16 ?.07 67 b. 78 11 ?. 08 69 . 75A
55 B14 W.47 29 ?.25 77 b. 42 5 ?. 15 79 . 59A
60 B8 W.06 36 ?.05 73 b. 29 6 ?. 26 75 . 24A
对照 5 W.45 23 ?.09 70 b. 36 6 ?. 93 72 . 66A
190 中 国 生 态 农 业 学 报 第 14 ?卷
状况同前。
BC98-?发酵液抑菌粗提物对黄
瓜枯萎病菌的抑制特性。BC98-?发
酵液抑菌粗提物为浅黄色干燥粗
粉 ,对黄瓜枯萎病菌有较强的拮抗
作用 , 耐高温高压且紫外线稳定性
好 ( 见表 5)。BC98-?发酵液抑菌
粗提物对酸碱有一定敏感性 , 酸性
条件下易失活 , 其抑菌效果明显降
低 , 中 性 偏 碱 条 件 下 ( pH5. 0～
10.6)则抑菌活性高 ( 见表 6)。
表 5 BC98-?发酵液抑菌粗提物对黄瓜枯萎病菌的抑制作用
Tab.5 Inhibiting effect of crude extraction of BC98-? on Fusarium
oxysporum(Schl .) f .sp . cucumerinum Owen
处 理 T = 3 Yd T = 7 yd
Treatments


抑菌圈直径/ mm
Diameter of inhibi-
tion zones
相对抑菌活性/ %
Relative inhibi-
tory activity
抑菌圈直径/ mm
Diameter of inhibi-
tion zones
相对抑菌活性/ %
Relative inhibi-
tory activity
粗 提 物 处 理 16 ?. 50 - 17. 11 -
对 照 0 ?. 0 - 0. 0 -
高温高压处理 15 ?. 15 82 @. 34 12. 95 91 `.84
对 照 18 ?. 40 - 14. 10 -
紫 外 线 处 理 20 ?. 40 99 @. 51 16. 80 96 `.55
对 照 20 ?. 50 - 17. 40 -
表 6 不同 pH BC98-?发酵液抑菌粗提物的抑菌活性
Tab.6 Antagonistic activity of crude extraction of BC98-? treated with various pH values
处理时间/ d 抑菌圈直径/ mm Diameter of inhibi tion zones
Treatment time pH 值 pH values
2 ?. 2 3 8.0 4. 0 5 . 0 6 W. 0 7 ?.0 8. 0 9 v. 0 10. 0 10. 6
3 ?11 . 00 10 8.75 12. 00 15 . 13 17 W. 75 17 ?.63 18. 88 18 v. 75 17. 63 16. 87
7 ?11 . 38 12 8.00 12. 75 15 . 63 18 W. 88 18 ?.50 18. 75 18 v. 50 17. 75 17. 38
图 1 BC98-?发酵液抑菌粗提物对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用 *
Fig. 1 Inhibiting effect of crude extraction of BC98-? on Fusarium
oxysporum(Schl .) f . sp . cucumerinum Owen
* A 为抑菌粗提物处理黄瓜枯萎病菌孢子及菌丝 ;
B 为对照黄瓜枯萎病菌孢子及菌丝。
BC98-?发酵液抑菌粗提物对黄瓜枯
萎病菌菌丝及孢子的影响。对抑菌圈内
培养基块和对照菌丝块显微镜观察发现 ,
抑菌圈内菌丝节间缩短且变形 , 产生大量
的厚垣孢子 , 菌丝量明显少于对照 ; 而对
照菌丝修长舒展 , 生长茂密 ,且无厚垣孢子
产生 (见图 1)。孢子萌发试验中 , BC98-?
发酵液抑菌粗提物对黄瓜枯萎病菌抑制作
用主要表现在对孢子萌发和芽管生长的抑
制 ,并使芽管畸形扭曲甚至串珠状膨大 , 其
萌发率为 43. 26% (而对照为 94.95% ) , 抑
制率为 54.44% ,芽管抑制率为 76.77%。
3 小结与讨论
芽孢杆菌是土壤和植物微生态的优势微生物种群 , 具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用。生物防治芽
孢杆菌往往同时产生多种对特定病原菌具有很高活性的抗生素[ 5] 。一些由蜡质芽孢杆菌分泌的多肽抗生
素具有耐热性和稳定性好的特点[ 3] 。而 BC98-?发酵液抑菌粗提物恰符合此特点 , 这可能是该发酵液抑菌
特性较稳定的原因。本研究表明蜡质芽孢杆菌 BC98-?发酵液及其分泌的抑菌物质对外界环境有很强的适
应力和稳定的抑菌特性 ,因此该菌株生物制剂应用于大田可稳定发挥其防病、抑病作用。BC98-?发酵液及
其抑菌粗提物抑菌作用主要表现在对病原菌孢子萌发及芽管和菌丝生长的抑制 , 同时由于不良的环境影
响 ,病原菌产生了厚垣孢子 , 并有部分病原菌孢子被溶解。溶菌一般是指微生物间因抗生作用、竞争以及直
接寄生或酶解等引起受害者细胞壁溶解 ,其细胞质释放入环境中并为其他微生物所消耗的现象[ 6] 。许多病
原真菌细胞壁含有几丁质和β-1、3-葡聚糖 ,几丁质酶和β-1、3-葡聚糖酶是植物病程相关蛋白 , 它们通过破坏
病原真菌的细胞壁而具有抗菌防病作用[ 7] 。本研究平皿试验中证实 BC98-?可产生另一类抑菌物质———几
丁质酶 ,这可能是孢子萌发试验中孢子溶解的原因。
参 考 文 献 h
1 马利平 , 乔雄梧 ,高 芬等 .防病促生枯萎病拮抗菌 98-?对 4 种枯萎病的效果研究 .中国生态农业学报 , 2005, 13(1) : 91～94
2 方中达 .植物研究方法 .北京 : 中国农业出版社 , 1982 .144
第 1 ?期 高 芬等 : 蜡质芽孢杆菌 BC98 ?-?发酵液与抑菌粗提物对黄瓜枯萎病菌的抑菌特性研究 191
3 裴 炎 , 李先碧 ,彭红卫等 .抗真菌多肽 APS-1 的分离纯化与特性 .微生物学报 , 1999, 39(4) : 344～349
4 刘焕利 , 潘小玫 ,张学军等 .产抗菌蛋白芽孢杆菌的筛选及抗菌蛋白性质 .中国生物防治 , 1995 ,11( 4) : 160～164
5 陈中义 , 张 杰 ,黄大?等 .植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究 .植物病理学报 , 2003, 33(2) : 97～103
6 鲁素云 .植物病害生物防治学 .北京 :北京农业大学出版社 , 1993 .69
7 ?杨合同 , 唐文华 ,宋家华等 .绿色木霉菌 LT R-2 对小麦纹枯病菌的作用机制 .植物病害研究与防治 .北京 : 中国农业科技出版社 , 1998
日本发展循环经济型社会的经验
———?. 完备立法与制定经济优惠政策
20世纪 90年代末日本政府针对面临的严峻资源与环境问题 ,提出了建立循环经济的构想。2000年日本把建立循环型社
会提升为基本国策 ,将该年定为“循环型社会元年”,并颁布和实施了《循环型社会形成推动基本法》等 6部法律 , 标志着日本
进入了推进循环经济、建立循环型社会的全面发展阶段。其主要经验一是建立了完备的循环经济立法体系并严格执行 , 首先
是在立法体系上有较强的规划性 , 采取了基本法统领综合法和专门法的模式 , 其法律体系分为 3个层次 : 基本法即循环型社
会形成推进基本法 ,综合法即废弃物处理法和资源有效利用促进法 ,专门法即容器包装再生利用法、家电再生利用法、建筑材
料再生利用法、食品再生利用法、汽车再生利用法和绿色采购法等 , 做到发展循环型社会有法可依、有章可循 ; 其次是立法中
明确了国家、地方政府、企业、公众的责任和义务 ,特别是规定企业和公众的“排放者责任”原则和“扩大生产者责任”原则 , 规
范了官、产、民在建立循环型社会方面的社会行为 ;再次是赋予循环型社会形成推进基本计划一定的法律效力 ,强调循环基本
计划以环境基本计划为基础制定 ,有关循环型社会形成的其他国家计划以循环基本计划为基础制定 , 使其起到循环基本法与
各个具体措施之间的桥梁作用 ,确保循环型社会各项措施的贯彻实施。同时对利用、处置废旧资源的基本顺序法定化 , 明确
了利用再生资源的优先顺序依次为抑制废弃物的产生、再使用、再生利用、热回收和妥善处置 , 上述法定顺序对在物质生产、
流通及消费过程中最大限度地降低污染负荷发挥了重要作用。事实证明日本实现法定目标是可行的 , 而且不少废弃物的循
环利用率已达到或超过法定目标 , 如在执行几种资源的回收利用率方面的立法进程中 ,实施包装容器再生法后 , 其中 2002年
塑料瓶回收利用率为 53.4% ;实施资源有效利用促进法 (实施对象品种有 10 个行业 69个品种 )后 , 其中 2002 年回收利用率
台式计算机为 75.1% (法定回收再利用率目标为 50% )、笔记本计算机 43.8% (法定目标 20% )、显像管显示器 66. 7% (法定目
标 55% )、液晶显示器 63% (法定目标 55% )、小型密封电池 50% (法定目标 50% )、镍氢电池 79% (法定目标 55% )、铬电池
72% (法定目标 60% )和锂电池 64% (法定目标 30% ) ;实施食品再生法后 , 其中 2001年饮食业垃圾的再生率为 37% (法定目
标 2006年为 46% ) ;实施家电再生法后 , 其中 2002 年回收利用率空调为 78% (法定目标为 60% )、电视机 75% (法定目标
55% )、电冰箱 61% (法定目标 50% )和洗衣机 60% (法定目标 50% ) ; 实施建材再生法后 ,其中 2002年回收利用率水泥为 96%
(法定目标 2010年为 95% )、木材 83% (法定目标 2010年为 95% )和沥青、水泥 98% (法定目标 2010年为 95% ) ;实施汽车再
生法[含汽车解体残留物 ( ASR )、氟里昂、空气安全袋 ]后 , 其中 2002 年汽车回收利用率为 80% 以上 (法定目标 2015 年为
95% ) ,而 ASR 法定目标 2015年为 70%以上。二是日本制定了一系列鼓励与支持循环型社会发展的经济优惠政策 , 用经济手
段刺激和促进循环经济的快速持续发展。首先建立了生态工业园区补偿金制度 , 并由环境省和经产省执行 , 环境省主要资助
生态工业园区的软硬件设施建设和科学研究与技术开发 ,而经产省主要资助硬件设施建设、与 3R 相关技术的研发及生态产
品的研发等 , 国家对入园企业的补助经费占企业初步建设经费总额的 1/ 2～1/ 3, 地方政府也有一定补贴 ; 其次通过税收优惠
政策鼓励企业建立循环经济生产系统 , 日本对废旧塑料制品类再生处理设备在使用年度内除普遍退税外 , 还按取得价格的
14%进行特别退税 ,对废纸脱墨、玻璃碎片杂物去除、空瓶洗净、铝再生制造等设备实行 3年的退还固定资产税 ; 再次是实行
废旧物资商品化收费制度 ,日本在个别物品再生利用法中规定了废弃者应当支付与旧家电、旧容器包装、旧汽车的收集、再商
品化等有关费用 ,如家电再生利用法中明确规定居民废弃 1台家电应交的处理费 , 汽车再生利用法中要求汽车所有者负担再
循环利用费用等 ; 此外日本还实行集体资源回收团体奖励金制度 ,对由市民组织团体回收家庭所产生的废物给予相应的奖励
金。从总体上日本政府为推动、促进循环经济法的实施 ,2000年以来每年都投入近 1.4万亿日元(按 2004年汇率、折合约 130
亿美元)的与《促进循环经济型社会基本法》有关的启动资金 ,预算资金经批准后直接拨给环境省、经产省、农林省和国土交通
省等主要相关部门 ,并规定由环境省统筹负责跟踪调查 , 评估实施效果 , 且此项预算开始要多些 , 在达成社会共识、形成产业
循环后将视情况而减少。从目前情况看日本政府的这些措施已经对循环型社会的建设、对日本的经济和环境都产生了积极
的影响 , 并引发了新的商业机会和市场竞争 , 2000年单物质循环 (回收和再资源化事业 )这 1 项产值就高达 210 亿日元、创造
了 57万个就业机会。
192 中 国 生 态 农 业 学 报 第 14 ?卷