全 文 ：桫椤科植物 DNA提取方法研究
应站明 1 , 应正河2 , 潘伟华 3
(1.萍乡高等专科学校 ,江西萍乡 337000;2.福建省农科院食用菌研究所 ,福建福州 350014;3.中山大学生命科学学院 ,广东广州 510275)
摘要　[目的]探讨桫椤科植物 DNA提取的最优方法。 [方法]采用经过改良的SDS法和 CTAB法对 3种桫椤科植物进行基因组 DNA
提取 ,用紫外分光光度计测定其在波长 260和 280nm处的吸光值 , 并根据 A260nm /A280nm的比值分析其DNA的纯度。将提取的基因组
DNA进行叶绿体 trnL-trnF非编码区序列扩增和 ISSR分析。 [结果 ]改进的CTAB法所提出的 DNA较纯净 ,所获得 DNA样品的 A260nm /A280nm比值在 1.750 ～ 2.050范围内 ,琼脂糖凝胶电泳图谱显示条带清晰。 [结论]改良的CTAB法更适合桫椤科植物DNA的提取。
关键词　桫椤科;CTAB法;SDS法;ISSR
中图分类号　S312　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)08-03922-03
ExtractionMethodsofGenomicDNAfromCyatheaceaePlant
YINGZhan-mingetal　(PingxiangColege, Pingxiang, Jiangxi337000)
Abstract　[Objective] ToexploreanefficientmethodforextractinggenomicDNAfromCyatheaceaeplants.[Method] Theimprovedsodiumdo-
decysulphate(SDS)andcetytriethlammoniumbromide(CTAB)methodswereusedforthegenomicDNAextractionofthreekindsofCya-
theaceaeplants.TheabsorptionvaluesweredeterminedbyultravioletspectrophotometryatA260nmandA280nm, andtheDNApuritieswereanalyzed
byA260nm /A280nmratio.TheamplificationofchloroplasttrnL-trnFnon-codingregionandISSRanalysisofgenomicDNAwerethenconducted.[ Re-sult] TheresultsshowedthattheimprovedCTABmethodofextractinggenomicDNAfromCyatheaceaeplantswasbetterthantheimprovedSDS
method, andtheDNApurityoftheformerwashigherthanthatofthelater.TheA260nm /A280nmratiooftheextractedDNAwiththeimprovedCTABmethodwasintherangefrom1.750to2.050, anddistinctbandswerefoundintheagarosegelelectrophoresismapofISSR.[Conclusion] The
improvedCTABmethodismoresuitablefortheDNAextractionofCyatheaceaeplant.
Keywords　Cyatheaceae;CTABmethod;SDSmethod;ISSR
基金项目　国家自然科学基金项目(30771763)。
作者简介　应站明(1981-),男 ,江西鄱阳人 ,硕士 ,讲师 ,从事植物系
统分类方面的研究。
收稿日期　2009-12-21
　　桫椤科植物属木本蕨类 ,也叫树蕨 ,是第四纪冰川孑遗
植物 ,被称为植物界的 “活化石 ”[ 1] 。目前桫椤科植物已处于
濒危状态 ,被列为国家二级保护植物 [ 2] 。全世界约有 500余
种桫椤科植物 ,中国境内有 14种 ,包括 2个变种 [ 3] 。桫椤科
植物对物种的形成 、植物地理区系和环境变迁的研究具有重
要价值。随着分子生物学手段的发展 ,利用分子标记及对桫
椤科植物叶绿体非编码序列扩增来研究其系统发育及遗传
结构的方法逐渐兴起 [ 4] 。对其自然居群遗传多样性以及种
群分化的研究 ,可以为进一步保护和利用桫椤科植物 ,提供
进化分子遗传学依据 [ 5] 。提取高质量的基因组 DNA,是有效
开展分子生物学研究的前提 ,保证试验结果的重复性 [ 6] 。
PCR分析用的模板 DNA纯度要求很高 ,但由于桫椤科植物
的叶片组织细胞内酚类化合物和多糖类物质等次生代谢产
物较多 ,故提取高质量的基因组 DNA难度较大 [ 7-9] 。笔者
利用改进的 CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)和 SDS法(十
二烷基硫酸钠)分别对桫椤科 3种植物 ,即刺桫椤 、大叶黑桫
椤和中华桫椤的叶片进行总 DNA的提取 ,以期获得纯度高 、
完整性好的总 DNA。
1　材料与方法
1.1　材料　桫椤科植物营养枝的幼嫩新鲜叶片。刺桫椤采
自我国海南省国家自然保护区尖峰岭(N18°44′, E108°52′,
海拨 806 ～ 926 m),大叶黑桫椤采自我国海南省国家自然保
护区五指山(N18°54′, E109°54′,海拨 705 ～ 785 m),中华桫
椤采自云南屏边大围山自然保护区(N22°57′, E103°42′,海拨
1 630 ～ 1 721 m)。对采集的叶片编号 ,置于硅胶中密封
保存。
1.2　方法
1.2.1　改良的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法。具体操
作参考文献 [ 10]进行。
1.2.2　改良的 SDS法。取 0.5g硅胶干燥叶片 ,用去离子水
洗净 ,在液氮中研磨 10 min,分装 3管。加入 800 μl的 SDS
提取液(临用前加入 2μlβ-巯基乙醇 , 20%的 PVP100 μl),
轻轻振动 , 65 ℃条件下水浴 30 min;加入 90 μl5 mol/L的
KAc, -20℃条件下冰浴 30 min;4 ℃、10 000 r/min离心 15
min;取上清液 ,加入等体积氯仿 /异戊醇(V∶V=24∶1),轻轻
振动;4 ℃, 10 000 r/min离心 15 min;取上清液 ,加入等体积
异丙醇 ,轻轻振动几下 ,室温静置 30 min, 12 000 r/min离心
10min,取沉淀加入预冷的 75%乙醇洗涤干燥;沉淀用 500 μl
TE溶解 ,静置 5 min,加入等体积氯仿 /异戊醇(V∶V=24∶1),
轻轻振动几下 ,静置 10 min;4 ℃ 12 000 r/min离心 10 min;
取上清液 ,加入 1 μlRNAase轻轻振动 ,混匀 , 37℃条件下保
温 1h,加入 600 μl氯仿 /异戊醇(V∶V=24∶1),轻轻振动;4
℃, 12 000r/min离心 10 min;取上清液 ,加入 2.5 mol/L的醋
酸铵 60 μl,加入 2倍体积的无水乙醇 ,室温静置 30 min,
12 000r/min离心 10min;去除上清 ,沉淀干燥后 ,用 30μlTE
在 37℃水浴溶解 DNA, RNAase消化 RNA。用紫外分光光度
检测 DNA样品的浓度和纯度。最后样品 DNA稀释至 50
ng/μl,作为 PCR反应的模板。
1.2.3　叶绿体 trnL-trnF片段非编码区序列 PCR扩增 。取
改良 SDS和 CTAB法提取的 DNA为模板 ,分别扩增叶绿体
trnL-trnF基因间隔区序列 ,引物采用 Taberlet设计 [ 11] ,引物
1:5′-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3′;引物 2:5′-CGAAATCG-
GTAGACGCTACG-3′,反应体积为 50.00 μl:DEPC水 41.75
μl, 10×bufer(Mg2+)5.00 μl, trnF引物(25μmol/L)0.75μl,
trnL引物(25 μmol/L)0.75 μl, dNTP(10 mmol/L)1.00 μl,
Taq酶(5U/μl)0.25 μl, Pfu酶 1/3Taq单位 ,模板(50ng/μl)
责任编辑　王强　责任校对　傅真治安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(8):3922-3924
1.00μl。反应条件为:94 ℃预变性 7min, 94℃变性 45 s, 52
℃复性 50 s, 72℃延伸 1min30s, 32个循环 , 72℃再延伸 10
min, 4℃保温。
1.2.4　ISSR-PCR初始扩增体系及程序。以改良 CTAB法提
取的 DNA为模板 ,用 17个碱基长度的 ISSR引物扩增 ,选用
815号为引物 ,其序列为 5′-CTCTCTCTCTCTCTCTG-3′进行
ISSR扩增 [ 12-13] 。反应体积为 20 μl,含 10 ng基因组 DNA,
0.3 mmol/L引物 , 2 mmol/LMgCl2 , 1 UTaqDNA聚合酶和
Bufer,以及 0.3 mmol/LdNTP。扩增程序为:94 ℃预变性 5
min,然后 94℃变性 40s, 53 ℃复性 35s, 72℃延伸 70s,循环
39次 ,最后 72℃再延伸 5 min。
2　结果与分析
2.1　DNA提取　按上述方法提取的桫椤科植物叶片总
DNA,如图 1和 2所示。经紫外分光光度计检测 ,所有 DNA
样品的 A260nm /A280nm的比值均在 1.750 ～ 2.050。由图 1可
知 ,在琼脂糖凝胶电泳加样孔中有少量粘性多糖物质残留 ,
前段泳道降解的 RNA带较多 , DNA纯度不高。而图 2则表
明 ,所提的 DNA样品干净 ,无拖带现象 , DNA纯度较高。
　注:1、2.刺桫椤 , 3、 4.大叶黑桫椤 , 5.中华桫椤 , M.Mark。 图
2同。
　Note:1-2, Cyatheaspinulosa;3-4, Alsophilagiganteavar.gigantea;
5, AlsophilacostularisBaker;M, Marker.ThesameasFig.2.
图 1　采用 SDS法提取DNA电泳图谱
Fig.1　 TheelectrophoresispaternsofDNAextractedbySDS
method
图 2　采用 CTAB法提取 DNA电泳图谱
Fig.2　TheelectrophoresispatternsofDNAextractedbyCTAB
method
2.2　trnL-trnF非编码区序列 PCR扩增　由图 3和 4可见 ,
改良 CTAB法所提 DNA模板较 SDS法得到更为清晰稳定的
扩增图谱 ,因此 ,该方法获得的 DNA适于以 PCR为基础的
DNA多态性分析研究 。
图 3　改良SDS法提取的刺桫椤 DNAtrnL-trnF非编码区序列
PCR扩增产物电泳图谱
Fig.3　AgarosegelelectrophoresisofPCRamplifiedproductsof
trnL-trnFintergenicregionsofDNAextractedfromCya-
theaspinulosaextractedbyimprovedSDSmethod
图 4　改良CTAB法提取的刺桫椤DNAtrnL-trnF非编码区序列
PCR扩增产物电泳图谱
Fig.4　AgarosegelelectrophoresisofPCRamplifiedproductsof
trnL-trnFintergenicregionsofDNAextractedfromCya-
theaspinulosaextractedbyimprovedCATBmethod
2.3　ISSR扩增　图 5是改良后 CTAB法提取的大叶黑桫
椤叶子总 DNA在 S815引物 ISSR扩增结果。条带清晰 ,扩增
效果良好。
3　结论与讨论
桫椤科植物的叶片组织细胞内 ,含有较多酚类和多糖类
等次生代谢产物 [ 14] ,这些物质是影响酶活性和保存时间的
主要因素。采用 SDS法提取其 DNA,虽然提取率较高 ,但不
能有效去除酚类和多糖类杂质 , DNA降解严重并且操作繁
琐 。而改进 CTAB法的提取率 ,虽然较 SDS法低 ,但操作简
单 ,产物的杂质较少 , DNA降解程度轻且纯度高 ,充分满足了
ISSR等分子检测的要求 [ 15] 。在抽提过程中加入 CTAB,可使
蛋白质等大分子物质的萃取更为彻底 ,原因可能是因为加入
CTAB,调节至高离子强度(>0.7 mol/LNaCl)的溶液时 ,酚
和氯仿连续抽提后可去除 CTAB、黏多糖和蛋白质复合物等
杂质 ,使提取的 DNA纯度提高 [16] 。 CTAB能与核酸形成特
异的可溶性复合物 ,对 DNA的选择溶解性强 ,普通的 CTAB
法主要用于草本植物和不含酚类或酚类少的植物的 DNA提
取 [ 17] 。由于酚类物质的干扰 ,使得桫椤科植物 DNA提取较
其他植物难度大。试验结果表明 ,采用不同方法提取桫椤科
植物基因组 DNA的质量和纯度不同。笔者采用改良 CTAB
法 ,取得了比较满意的结果 。在缓冲液中加入 PVP和 β-巯
基乙醇 ,起到了防止多酚类物质被氧化的作用 ,避免了因细
392338卷 8期　　　　　　　　　　　　　　　　应站明等　桫椤科植物 DNA提取方法研究
胞与细胞核同步裂解而导致 DNA被大量杂质污染的可
能 [ 18] 。PVP可以很好地抑制多酚氧化酶和细胞色素氧化酶
的活性 ,是一种重要的稳定剂和抗氧化剂 ,可减轻杂质的干
扰 ,若提取液中不加 PVP,则无法获得纯白色的 DNA。 β-巯
基乙醇具有抗氧化作用 ,增加其浓度 ,可防止氧化褐变 ,获得
较好的 DNA提取结果。这 2种物质的加入 ,使改良 CTAB法
提取的 DNA纯度较高 ,且颜色为纯白色 [ 19] 。从 DNA提取纯
度 、完整性和 trnL-trnF非编码区序列 PCR扩增结果看 ,改良
CTAB法较 SDS法更适用于桫椤科植物 DNA的提取。
图 5　改良 CTAB法提取的大叶黑桫椤 DNA,在引物 S815(1-34号样品)PCR扩增电泳图
Fig.5　AgarosegelelectrophoresisofISSR-PCRproductsofDNAextractedfromAlsophilagiganteavar.giganteabyCTABmethodwith
primerS815(Samples1-34)M:SD-014 100bpDNAmarker
参考文献
[ 1] 于永福.中国野生植物保护工作的里程碑———国家重点保护野生植物
名录(第一批)[ J].植物杂志, 1999(5):3-4.
[ 2] 王用平.待开发的活化石———桫椤 [ J].中国野生植物 , 1990(3):21-
22.
[ 3] 李雪雁,郑博 ,徐茵,等.中国桫椤科 6种植物的RAPD分析[ J] .中山大
学学报论丛 , 2002, 22(1):227-231.
[ 4] 王艇 ,苏应娟 ,郑博,等.中国桫椤科植物叶绿体trnL内含子和trnL-trnF
基因间隔区序列的系统发育分析 [ J].热带亚热带植物学报, 2003, 11
(2):137-142.
[ 5] 周志琼 ,苏智先 ,廖永梅,等.桫椤的生物学研究进展 [ J].贵州师范大
学学报:自然科学版 , 2004, 22(3):100-103.
[ 6] XZAQ.TheclassificationoftheChineseCyatheaceae[J] .ActaPhyotaxo-
nomicaSinica, 1989, 27(1):1-16.[ 7] 王艇,苏应娟,李雪雁,等.孑遗植物桫椤种群遗传变异的 RAPD分析
[ J].生态学报, 2003, 23(6):1200-1205.
[ 8] 王经源 ,黄儒珠.刺桫椤 DNA的简便快速提取方法[ J].福建林学院学
报 , 2001, 21(4):376-379.
[ 9] 徐艳,刘燕 ,石雷.大叶黑桫椤孢子超低温保存 [ J] .植物生理学通讯,
2006, 42(1):55-57.
[ 10] 罗群 ,马丹炜 ,王跃华.川乌遗传多样性的 ISSR鉴定 [ J].中草药,
2005, 37(10):1555-1556.
[ 11] TABERLETP, GIELYL, PAUTOUG,etal.Universalprimersforamplifi-
cationofthreenon-codingregionsofchloroplastDNA[ J].PlantMolBi-
ol, 1991, 17:1105-1109.
[ 12] 施苏华 ,杨淑达 ,周仁超.滇牡丹遗传多样性的 ISSR分析 [ J].生物多
样性, 2005, 13(2):105-111.
[ 13] 王建波.ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用 [ J].遗传 ,
2002, 24(5):1-5.
[ 14] 王伯荪 ,王艇,施苏华.海南岛热带林生物多样性及其物种进化 [ M].
北京:科学出版社, 2005:77-100.
[ 15] 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用 [ M].北京:化学工
业出版社, 2005.
[ 16] SANBROOKJ,RUSSELLDW.分子克隆实验指南[ M].3版.黄培堂 ,
译.北京:科学出版社, 2002:473-512.
[ 17] 张岳峰 ,万里翔 ,徐敏,等.乌头DNA的改良 CTAB提取和 ISSR检测
[ J].湖北农业科学, 2008, 47(1):12-14.
[ 18] 谢一青 ,李志真,黄儒珠,等.光皮桦基因组DNA提取方法比较 [ J].浙江林学院学报, 2006, 23(6):664-66.
[ 19] 侯义龙 ,曹同,蔡丽娜 ,等.苔藓植物 DNA提取方法研究 [ J].广西植
物 , 2003, 23(5):425-428.
(上接第 3915页)
后可以形成每丛 20 ～50个丛生芽 。
木本植物的不定根诱导在组培快繁技术中是很关键的
一步 ,最常用的是瓶内直接一步生根 ,该方法适用于大多数
植物的生根 ,而对于一些难生根的木本植物 ,近年来研究出
了滤纸桥法 、气培生根法及有瓶外生根法。相比较而言 ,瓶
外生根工序简单 ,培养周期短 ,不需要炼苗 ,可以直接插入培
养基质中生根。因此 ,该试验有待于进一步研究 ,以减少移
栽工序 ,节约培养成本。
参考文献
[ 1] 陈风顺.矮生地被型紫薇市场前景看好[ J] .中国林业, 2002(2):63.
[ 2] 忘宏欣.紫薇的繁殖栽培及其园林应用 [ J].中国花卉园艺, 2004(16):
31-33.
[ 3] 黎玉才.矮生地被型紫薇[ J].湖南林业, 2002(6):12.
[ 4] 陈正华.木本植物组织培养及其应用 [ M].北京:高等教育出版社 ,
1986:526-529.
[ 5] 董志渊,郑思乡.百合的组织培养及其在育种中应用 [ J].西部林业科
学, 2004, 33(2):64-68.
[ 6] 陈建军,陆志民,章林 ,等.大叶山杨优树组培微繁工厂化生产技术的研究 [ R] .长春:吉林省林业科学研究院, 1999.
3924 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年