全 文 ：山 东 农 业 科 学 2016，48(9):6 ～ 9，16 Shandong Agricultural Sciences
DOI:10． 14083 / j． issn． 1001 － 4942． 2016． 09． 002
收稿日期:2016 －05 －27
基金项目:国家自然科学基金项目(31201635、31301786);山东省农业科学院青年英才重点扶持项目
作者简介:孙亚玲(1990 －)，女，硕士研究生，主要从事蔬菜遗传育种。E － mail:ylsun17863856559@ 163． com
陈立(1992 －)，男，硕士研究生，主要从事蔬菜遗传育种。E － mail:cl956599848@ 163． com
* 同为第一作者。
＊＊通讯作者:杨妍妍，E － mail:ty_7@ 163． com;霍雨猛，E － mail:hmxj2001@ 163． com
葱属主要蔬菜作物高质量 ＲNA提取方法研究
孙亚玲1，2，陈立1，2* ，刘冰江1，缪军1，孔素萍1，高莉敏1，
曹辰兴2，吴雄1，杨妍妍1＊＊，霍雨猛1＊＊
(1． 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所 /山东省设施蔬菜生物学重点实验室 /国家蔬菜改良中心山东分中心，
山东 济南 250100;2． 山东农业大学园艺科学与工程技术学院，山东 泰安 271018)
摘 要:葱属蔬菜作物(洋葱、大葱、大蒜和韭菜等)各组织部位富含多糖等次生代谢物质，严重影响了
ＲNA的提取质量。本研究以洋葱叶片为样本，对多种 ＲNA 提取方法进行了比较分析，获得了一套适合葱属
蔬菜作物 ＲNA提取的系统方法。该方法将 CTAB － GT连用、蛋白酶 K替代 DEPC和冰浴电泳检测相结合，其
所提取的 ＲNA样本产量约为 152． 35 μg /gFW，ＲNA完整性 ＲIN值约为 7． 5，条带清晰，无多糖、蛋白质和 DNA
残留，28S约为 18S两倍，提取过程安全无强致癌物质 DEPC，可满足下游 ＲNA分子实验的要求。且该方法适
合于大葱、洋葱、大蒜和韭菜不同组织部位样本 ＲNA的提取。
关键词:葱属蔬菜;ＲNA提取;多糖;CTAB － GT
中图分类号:S633 + Q781 文献标识号:A 文章编号:1001 －4942(2016)09 －0006 －05
High Quality ＲNA Extraction Method from Main Allium Vegetables
Sun Yaling1，2，Chen Li1，2* ，Liu Bingjiang1，Miao Jun1，Kong Suping1，
Gao Limin1，Cao Chenxing2，Wu Xiong1，Yang Yanyan1＊＊，Huo Yumeng1＊＊
(1． Vegetable and Flower Ｒesearch Institute，Shandong Academy of Agricultural Sciences /Shandong Provincial Key Laboratory
for Biology of Greenhouse Vegetable /Shandong Branch of National Improvement Center for Vegetable，Jinan 250100，China;
2． College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
Abstract Allium vegetables (including Allium cepa，Allium fistulosum L． var． giganteum Makion，Alli-
um sativum and Allium tuberosum Ｒottl． ex Spreng)are rich in polysaccharides and other secondary metabo-
lites，which seriously affect the quality of extracted ＲNA． In this study，we compared and analyzed a variety
of ＲNA extraction methods using onion leaves as samples，and obtained a set of method for ＲNA extraction
from Allium vegetables． This method was comprised of CTAB － GT，Proteinase K instead of DEPC and ice
bath gel electrophoresis． The yield of ＲNA samples was about 152． 35 μg /gFW，the ＲNA integrity (ＲIN val-
ue)was about 7． 5，the bands of gel electrophoresis were clear without contaminations of polysaccharides，pro-
tein and DNA residues，the ratio of 28S /18S was about 2 and the extraction process was safe without strong
carcinogen of DEPC． The ＲNA quality was suitable for downstream molecular experiments． Besides，this
method could be applied to the extractions of different tissues of welsh onion，onion，garlic and Chinese
chives．
Keywords Allium vegetables;ＲNA extraction;Polysaccharides;CTAB － GT
洋葱、大葱、大蒜和韭菜在 APGⅢ分类系统
中均为天门冬目石蒜科葱亚科葱属蔬菜作物，广
泛种植于世界各地。它们不仅是人们餐桌上必备
的香辛和调味蔬菜，而且具有重要的医疗保健价
值。洋葱、大葱和大蒜耐储运，是我国重要的出口
创汇蔬菜，而韭菜是人们逢年过节的传统蔬
菜［1］。
分类学上的一致性，使得它们都具有巨大的
基因组［2］，各组织部位都含有丰富的多糖物
质［3］。多糖的理化性质与 ＲNA极为相似，在沉淀
ＲNA时，多糖也会随之沉淀，严重影响了 ＲNA 的
提取质量。而多糖去除不净将严重影响 ＲNA 高
通量测序分析、Northern 杂交分析、ＲT － PCＲ、cD-
NA文库构建等下游的分子生物学操作［4］。传统
提取 ＲNA 的方法有热酚法［5，6］、异硫氰酸胍
法［7］、CTAB法［8，9］、SDS法［10，11］等，这些方法均具
有各自的优缺点，单一的方法无法满足葱属蔬菜
作物高质量 ＲNA提取的需求。DEPC 作为 ＲNase
清除剂广泛应用于 ＲNA提取过程中，但其本身是
一种强致癌物质，存在严重的安全隐患［12］。此
外，DNA残留也是葱属蔬菜作物高质量 ＲNA 提
取的难点。
针对上述问题，本研究将经典的 CTAB 法和
异硫氰酸胍(GT)法有机结合起来，利用 CTAB 法
去除多糖、酸性 GT 试剂(主要包含异硫氰酸胍)
去除 DNA 污染以及低浓度的蛋白酶 K(1 μg /
mL)作 为 ＲNase 清 除 剂 替 代 强 致 癌 物 质
DEPC［12］，对葱属蔬菜作物进行 ＲNA 提取，以期
获得高质量的 ＲNA样本。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
洋葱、大葱、大蒜和韭菜的叶片、鳞茎和花蕾，
均取自山东省农业科学院蔬菜花卉试验基地，液
氮速冻后 － 80°C超低温冰箱保存备用。
1． 2 试剂
蛋白酶 K购置于宝生物工程(大连)有限公
司，提取用生化试剂购置于生工生物工程(上海)
股份有限公司，ＲT － PCＲ相关试剂购置于北京全
式金生物技术有限公司。主要试剂配制方法:
(1)ＲNA处理水:50 μL 蛋白酶 K(20 mg /mL)溶
于 1 L超纯水中，至终浓度为 1 μg /mL;(2)LiCl
溶液(8 mol /L):17 g LiCl 溶于 50 mL ＲNA 处理
水;(3)CTAB提取液:0． 25 mol /L Tris － HCl (pH
8． 0)，0． 05 mol /L EDTA (pH 8． 0) ，2． 5 mol /L
NaCl，2% CTAB，3% PVP － 40，使用时加入巯基乙
醇至终浓度为 0． 2%;(4)GT变性液:称取 0． 7764
g 柠檬酸钠，溶解于 50 mL水中(此时 pH约为9． 5
左右)，用盐酸调节 pH 为 7． 0，盐酸用量约为 35
μL，加入 0． 528 g十二烷基肌氨酸钠，高温灭菌后
加入异硫氰酸胍 50 g，巯基乙醇 0． 2 mL，8 －羟基
喹啉 0． 1 g，定容至 100 mL。
1． 3 提取方法
1． 3． 1 改良 CTAB法［8，9］ (1)取供试组织材料
液氮研磨并将粉末转移到 CTAB 裂解液(w∶ v 为
1∶ 5)中，用时提前加入 β －巯基乙醇至 0． 2%，涡
旋混匀 60 s，65℃水浴 5 ～ 10 min，每隔 2 min混匀
一次，加入等体积的氯仿 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1)，静置
2 ～ 5 min;(2)12 000 r /min 4℃离心 10 min，转移
上清到新的离心管中，加入 1 /3 体积 8 mol /L
LiCl，－ 20℃沉淀至少 30 min;(3)12 000 r /min
4℃离心 10 min，弃上清，ＲNA沉于管底;(4)75%
乙醇涡旋洗涤，12 000 r /min 4℃离心 5 min，重复
(4)后，室温干燥 5 min，用高温处理的蛋白酶 K
水溶解。
1． 3． 2 改良 GT法［7］ (1)取供试组织材料液氮
研磨并将粉末转移到 GT 变性液(w∶ v为 1∶ 5)中，
用时提前加入 β －巯基乙醇至 0． 2%，涡旋混匀
60 s，室温放置 5 ～ 10 min，加入 1 /10 体积的 2
mol /L醋酸钠(pH = 4． 0)剧烈混匀，加入与裂解
液等体积的水饱和酚剧烈混匀，静置 2 ～ 5 min，加
入 1 /5 体积氯仿 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1)剧烈混匀，静置
2 ～ 5 min;(2)12 000 r /min 4℃离心 10 min，转移
上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，静置
5 ～ 10 min;以下同 1． 3． 1 中的(3)和(4)。
1． 3． 3 GT － CTAB连用法 将 1． 3． 2 改良 GT法
(3)中获得的 ＲNA 沉淀，用 75%乙醇洗涤一次，
加入 CTAB裂解液约 600 μL于 65℃水浴溶解，再
下同 1． 3． 1。
1． 3． 4 CTAB － GT连用法 将 1． 3． 1 改良 CTAB
法(3)中获得的 ＲNA 沉淀，用 75%乙醇洗涤一
次，加入 GT 裂解液约 600 μL 于室温溶解，再下
同 1． 3． 2。
1． 4 检测方法
7第 9 期 孙亚玲，等:葱属主要蔬菜作物高质量 ＲNA提取方法研究
琼脂糖凝胶电泳检测，将电泳槽置于含冰水
混合物的容器中，进行普通 TBE 琼脂糖凝胶电
泳，电压 20 V /cm，电泳 25 min，EB 染色，BIO －
ＲAD凝胶成像系统拍照。采用安捷伦 2100 芯片
生物分析仪检测 ＲNA完整性、OD值及浓度。
2 结果与分析
2． 1 四种提取方法对洋葱叶片总 ＲNA提取质量
的影响
由图 1 可以看出，四种方法均能够提出洋葱
叶片的总 ＲNA，GT和 CTAB法点样孔中存在大量
的多糖或蛋白质杂质，特别是 GT 法中点样孔更
亮，而且所提取的样本粘稠，推测为多糖;CTAB
法中虽然 LiCl能选择性地沉淀 ＲNA，然而样本中
仍然存在大量的 DNA残留，这也是许多文献中报
道的 LiCl 沉淀 ＲNA 后必须用 DNase 处理样本的
原因［8］。为了验证 LiCl 对 DNA也具有沉淀效果，
我们将一份 DNA溶液平均分成两份(各 300 μL)，
其中一份用经典的异丙醇沉淀法沉淀 DNA，另一
份用1 /3体积即100 μL 8 mol /L的 LiCl进行沉淀，
结果(图 2)表明，异丙醇和 LiCl 均能有效地沉淀
DNA，异丙醇沉淀 DNA的效率大于 LiCl。
图 1 洋葱叶片总 ＲNA四种提取方法提取质量电泳图
1:异丙醇沉淀;2:LiCl沉淀。
图 2 异丙醇和 LiCl沉淀 DNA效果比较
GT － CTAB和 CTAB － GT法连用时获得了高
质量 ＲNA样本，然而在进行实际操作时，GT法获
得的沉淀由于含有大量的多糖、蛋白质以及其他
次生代谢产物很难溶解，而 CTAB 法获得的沉淀
却极易溶解，因此，后续试验采用了 CTAB － GT
法。由图 1 还可以看出，GT法中 5S rＲNA的亮度
显著高于 LiCl沉淀的其他样本，这也表明 LiCl对
低分子量 ＲNA的沉淀效率明显低于高分子量样
本。
由表 1 可以看出，四种方法提取的 ＲNA 样
本，其 ＲIN(ＲNA Integrity Number)值均大于 7． 0，
28S /18S均不小于 1． 4，基本达到了后续试验(特
别是高通量测序)的要求。前两种方法 28S /18S
值较低的原因可能是蛋白质去除不彻底导致其干
扰了测定结果或者部分 ＲNA 样本发生了降解。
从 OD260 /OD280和 OD260 /OD230比值可以得出，GT
法所获得的 ＲNA 中存在大量的多糖干扰，而
CTAB法获得的 ＲNA 存在蛋白质或者盐离子污
染。从浓度和产率来分析，GT 法最高，之后依次
是 CTAB、CTAB － GT 和 GT － CTAB，在后两种方
法中产率的差异可能是 GT 法中沉淀产物很难溶
解造成的。从样品状态可以看出，GT 和 CTAB 法
提取的 ＲNA 均为粘稠状态。而图 1 中的 CTAB
法提取的 ＲNA，存在大量的 DNA 污染，因此 GT
和 CTAB 法单独使用所获得的 ＲNA 均不适合后
续高质量 ＲNA 需求的分子实验操作(如高通量
测序建库)，故选择 CTAB － GT 法作为后续的试
验方法。
表 1 四种提取方法提取 ＲNA样本的质检结果
提取方法 ＲIN值 28S /18S
OD260 /
OD280
OD260 /
OD230
浓度
(ng /μL)
产率
(μg /gFW)样品状态
GT 7． 1 1． 5 1． 82 1． 36 824 214． 96 非常粘稠
CTAB 7． 0 1． 4 1． 89 1． 56 716 186． 78 粘稠
GT － CTAB 7． 0 1． 6 2． 32 1． 85 344 89． 74 正常
CTAB － GT 7． 5 2． 2 2． 09 2． 06 584 152． 35 正常
2． 2 四种方法提取的 ＲNA反转录效率及半定量
效果研究
为了验证四种方法所获得的 ＲNA 能否用于
ＲT － PCＲ试验，我们分别将其反转录后利用洋葱
TUB引物进行 PCＲ 扩增(29 个循环)。图 3 表
明，GT、CTAB、GT － CTAB 和 CTAB － GT 四种方
法用于 ＲT － PCＲ 试验均可获得扩增产物，但
CTAB和 GT － CTAB法以 LiCl作为沉淀剂导致扩
增产物急剧降低，而将 ＲNA 样本用 75%乙醇洗
8 山 东 农 业 科 学 第 48 卷
涤 3 次后，扩增效果恢复到与其他方法无可见差
异状态，由此可以看出，LiCl 干扰了反转录反应，
降低了反转录效率。因此，在利用 LiCl 作为最终
沉淀剂获取 ＲNA时必须对样本进行多次洗涤，以
尽可能降低其对后续分子生物学实验的影响。
1:GT法;2:CTAB法;3:GT － CTAB法;
4:CTAB － GT法;5、6:75%乙醇洗涤沉淀 3 次后的 2、3。
图 3 四种方法获得的 ＲNA ＲT － PCＲ结果
2． 3 CTAB － GT 连用法在葱属主要蔬菜作物不
同组织部位 ＲNA提取中的应用评估
为了验证 CTAB － GT 连用法对葱属主要蔬
菜作物 ＲNA样本提取的适用性，我们分别提取了
洋葱、大葱、韭菜和大蒜样本的花蕾、茎(或假茎)
和叶片的总 ＲNA。由图 4 可以看出，点样孔清
晰，表明无蛋白或多糖残留;DNA 带不可见，表明
几乎无 DNA 残留;28S 和 18S 清晰，且 28S 的亮
度约为 18S的两倍，表明 ＲNA 样本完整。因此，
该方法可以用于多个葱属蔬菜作物不同部位
ＲNA样本的提取试验，特别是该方法对样本取量
无限制，既可以对少量或微量样本提取，进行普通
的 ＲT － PCＲ 试验，也可以对大量的样本提取，进
行高通量测序及杂交分析等。
a:花蕾;b:茎(假茎);c:叶片。1:洋葱;2:大葱;3:韭菜;4:大蒜。
图 4 CTAB － GT连用法对葱属蔬菜作物组织样本 ＲNA提取质量的电泳评价
3 讨论与结论
采用改良的 CTAB － GT连用、蛋白酶 K 替代
DEPC和冰浴电泳检测方法，解决了葱属蔬菜作
物 ＲNA提取过程中多糖干扰的难题。该方法所
提取的 ＲNA 样本产量高，条带清晰，ＲNA 完整度
高，无多糖、蛋白质和 DNA 残留，28S 约为 18S 两
倍，可满足下游 ＲNA 分子实验(特别是高通量测
序建库)的要求，且该方法适合于大葱、洋葱、大
蒜和韭菜不同组织部位样本 ＲNA的提取。
该方法首先采用改良 CTAB 法进行 ＲNA 的
粗提，去除多糖残留，然后利用改良 GT 法对样本
进行纯化，去除蛋白质和 DNA 残留。CTAB 法中
的 LiCl虽然可选择性沉淀 ＲNA，但试验结果表明
LiCl同样可以沉淀 DNA和部分蛋白质，而酸酚可
以有效地去除蛋白质并使 DNA 溶解于有机相从
而获得高质量的 ＲNA。蛋白酶 K(1 μg /mL)的使
用更是取代了强致癌物质 DEPC，降低了对于实
验人员的安全隐患［12］，且未发现对 ＲNA 后续试
验的不利影响。在试验过程中应特别注意由于
PVP与苯酚会产生结晶［7］，因此 CTAB 法中不能
使用苯酚抽提，而 GT法中不能使用 PVP。
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