全 文 ：收稿日期:2011-03-06; 修订日期:2011-10-25
基金项目:广西壮族自治区自然科学基金(No． 2010GXNSFA013145)
作者简介:徐 鹏(1985-) ，男(汉族) ，广西柳州人，现为广西医科大学在
读硕士研究生，学士学位，主要从事药用植物分子生物学研究工作．
* 通讯作者简介:吴耀生(1958-) ，女(汉族) ，广东澄海人，现任广西医科
大学教授，博士学位，主要从事药用植物分子生物学研究工作．
3 种广西钩藤属药用植物的 RAPD多态性分析
徐 鹏1，吴耀生1* ，黄瑞松2，周 娟1，罗育1，李科志1，唐银琳1，刘 镛1
(1．广西医科大学，广西 南宁 530021;
2．广西民族医药研究所，广西 南宁 530001)
摘要:目的 运用随机扩增多态性技术探索广西钩藤属药用植物的遗传多态性，为其种质鉴定提供依据。方法 采用优化
的试剂盒提取法提取大叶钩藤、白钩藤、毛钩藤 3 种植物的总 DNA。用经过筛选的 18 条 10 个碱基的随机引物进行 PCR
扩增。结果 优化后的试剂盒提取法可有效获取 3 种钩藤属植物的基因组 DNA，18 条随机引物扩增得到条带共 260 条，
其中多态性条带 231 条，多态率达到 88． 9%，扩增效果好。按 UPGMA法进行聚类分析，计算其遗传相似系数，结果显示，
5份钩藤供试材料聚为 3 类。结论 3 种广西钩藤属药用植物的聚类结果与其种和地理区域远近一致，与形态学观察可
能存在差异。所得 RAPD标记可用于钩藤属药用植物的多态性研究，并为今后开发遗传鉴定的分子标记奠定基础。
关键词:钩藤属; 基因组 DNA; RAPD; 多态性
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 03． 087
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)03-0703-03
Polymorphism of Three Kinds of Medicinal Plants Uncaria from Guangxi by RAPD
XU Peng1，WU Yao-sheng1* ，HUANG Rui-song2，ZHOU Juan1，LUO Yu1，LI Ke-zhi1，TANG Yin-lin1，LIU Yong1
(1． Guangxi Medical University，Nanning 530021，China;2． Guangxi Institute of Nationality Medical Research，
Nanning 530001，China)
Abstract:Objective To research the polymorphism of three kinds of medicinal plants Uncaria． from Guangxi，by radom amplified
polymorphic DNA(RAPD)analysis and provide a basis for germplasm identification． Methods The modified extraction kit was
used to extract the genomic DNA of several plants，including 3 regions of Uncaria Macrophylla Wall，Uncaria Sessilifmctus Roxb．
and Uncaria Hirsute Havil，then amplified by 18 selected random primers with 10bp． Results Optimized extraction kit was effec-
tive for 3 Uncaria species genome DNA． With the DNA extracted from several plants as template，18 primers amplified a total of
260 bands，231 bands were polymorphic，polymorphism rate was 88． 85%，and the effect amplification was good． Then we con-
structed a dendrogram based on genetic distances by using UPGMA method． The dendogram reflected that 5 samples clustered into
three taxa． Conclusion This result is in accordance with their species and geographic origin，but may be different from morphologi-
cal observed． RAPD markers can be used to analyze polymorphisms of medicinal plants Uncaria，and provide the genetic basis for
identification．
Key words:Uncaria; Grenomic DNA; RAPD; Polymorhism
中药钩藤以茜草科钩藤属钩藤 Uncaria rhynchophylla (Miq．)
Jacks、大叶钩藤 Uncaria Macrophylla Wal1．、毛钩藤 Uncaria hirsute
Havil．、华钩藤 Uncaria Hasinensis(0liv．)Havil．和无柄果钩藤(又
名白钩藤)Uncaria sessilifmctus Roxb． 的带钩茎枝为主，主要分布
于江西、广东、广西、湖南、云南等地，其性微寒味甘，归肝、心包
经，可清热平肝、熄风定惊，用于头痛眩晕。感冒夹惊，惊痫抽搐，
妊娠子痫，高血压等症［1］。化学研究表明，钩藤中主要有效成分
为生物碱［2］。国外最新研究表明，其提取物具有激活巨噬细胞，
增强免疫［3］:促进神经修复，治疗帕金森病［4］;基于细胞毒作用
的抗肿瘤效应［5］;增强造血功能［6］;促进皮肤损伤修复［7］等作
用。由此引发了对钩藤属药用植物开发利用的热潮。根据药典
记载，除以上 5 种外，另有十余种钩藤属植物不入药，而中药钩藤
仅取其钩作为入药部分，从而给鉴别带来困难。广西是我国钩藤
分布最广，种属最多的省份(共十余种) ，相关研究表明［8］，除不
同的产地、部位(根、茎、钩枝、嫩枝、叶)、采收时间等因素外，影
响钩藤中总生物碱含量最主要的还是钩藤品种。因此，进行科学
准确的种质鉴别对广西钩藤属植物的开发利用起着至关重要的
作用。本实验应用 RAPD (随机扩增多态性 DNA，random ampli-
fied polymorphic DNA)技术对 3 种广西钩藤属药用植物(大叶钩
藤，白钩藤，毛钩藤)进行初步研究，为今后进行中药钩藤的分子
鉴定奠定基础。
1 材料与仪器
1． 1 样本 大叶钩藤 Uncaria macrophylla Wal1．，白钩藤 Uncaria
sessilifmctus Roxb．和毛钩藤 Uncaria hirsute Havil．由广西民族药物
研究所黄瑞松教授提供并鉴定。本研究选用来自 3 个不同产地
的大叶钩藤，以及白钩藤，毛钩藤各 1 种。见表 1。每种植物均
取其幼嫩叶片作为提取基因组 DNA的材料，于 － 20℃保存。
1． 2 仪器 TGL － 18K台式高速冷冻离心机，长沙英泰仪器有限
公司;PCR扩增仪，T1 Thermocyclear (Biometra) ;凝胶成像仪，英
国 UVI公司。
1． 3 试剂和引物 新型快速植物基因组提取试剂盒(离心柱型)
购于北京百泰克生物技术有限公司，Taq 酶、dNTPs、10 × buffer 缓
冲液、Mg2 +等均购自大连 TaKaRa公司;RAPD引物为上海生工公
司产品;其它试剂均为进口或国产分析纯。
2 方法
2． 1 大叶钩藤，白钩藤，毛钩藤总 DNA提取 采用北京百泰克生
物技术有限公司的新型快速植物基因组 DNA 提取试剂盒(离心
柱型)的使用手册提取方法并稍加改进。取 100 mg新鲜叶片，在
研钵中加入液氮研磨成细粉。迅速转至另一个研钵，加入适量预
冷的 STE核分离液，快速研磨成糊状。将糊状物转入 1． 5 ml 离
心管，12 000 × g离心 5min，去上清，留沉淀。此后照使用手册进
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL ． 23 NO． 3 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 3 期
行提取。STE 核分离液:700 mmol·L －1 NaC1;100 mmol·L －1
Tris － HCl，pH8． 0;0． 5 mmol·L －1 EDTA;2% PVP(W/V) ;3% β －
巯基乙醇(V /V)［9］。
表 1 5 份材料的来源及分类
编号 样品 采集地 产地 采集时间 备注
DG1 大叶钩藤Ⅰuncaria macrophylla Wal1． Ⅰ
广西南宁四
塘 广西南宁
2010 － 03 半干品
DG2 大叶钩藤Ⅱuncaria macrophylla Wal1． Ⅱ
广西药用植
物园 广西南宁
2010 － 06 新鲜品
DG3 大叶钩藤Ⅲuncaria macrophylla Wal1． Ⅲ
广西宁明县
爱店镇那党
村
广西崇左 2010 － 04 半干品
BG 白钩藤uncaria sessilifmctus Roxb．
广西中医学
院药用植物
园
广西南宁 2010 － 08 新鲜品
MG 毛钩藤uncaria hirsute Havil．
广西中医学
院药用植物
园
广西南宁 2010 － 08 新鲜品
2． 2 引物筛选 选用本课题组通过 Blast 比对筛选出的 20 条 10
碱基 RAPD引物［10］与钩藤属植物基因组 DNA进行 PCR扩增，选
出多态性高，重复性好的 18 条用于本研究。
2． 3 PCR 扩增及电泳检测 参照本课题组用于绞股蓝的 RAPD
－ PCR扩增条件［11，12］稍加修改。反应在 PCR 扩增仪上进行，使
用 25 μl 反应体系，其成分为:10 × Buffer 2． 5 μl;25 mmol /L
Mg2 + 2 μl;2． 5 mmol /L dNTP 2 μl;10μmol /L 10 碱基随机引物各
1 μl，TaqDNA聚合酶 1 U，模板 DNA60 ng 左右。反应程序:预
变性 94℃3 min;扩增程序:94℃ 30 s，36℃ 30 s，72℃ 80 s，40
个循环;然后 72℃补充延伸 10 min，4℃保存。取扩增产物 10 μl
在 1． 5 %琼脂糖凝胶上，100 V恒压电泳 20 min，电泳结束后在
UVI － 7600Z凝胶成像系统上观察并照像。
2． 4 数据处理 用 Quantity One 软件计算电泳条带长度选取重
复性好的条带(包括亮带和可识别的暗带)进行统计分析。将电
泳图谱上清晰条带(包括可识别弱带)记为“1”，同一位置没有条
带记为“0”，生成 0 和 1 的原始矩阵表，统计每条引物扩增出来
的总带数和其中的多态性带数，并计算其多态性条带百分率
(percentage of polymorphic bands，PPB) ，PPB =多态位点数 /位点
总数。用 NTSYS － PC 软件中的 Simqual 程序估算 5 个钩藤属植
物相似系数(genetic similarity，GS) ，并用平均连锁聚类分析法进
行聚类分析 ，构建遗传相关聚类图。
3 结果
3． 1 试剂盒法提取植物基因组 DNA方法的优化 由于钩藤属药
用植物所含次生代谢产物(尤其是糖类和酚类) ，在提取 DNA 过
程中次生代谢物易被氧化，发生褐化现象。氧化的次生代谢物和
DNA发生不可逆结合，导致 DNA提取效率低，并影响后续反应。
传统的 CTAB法和直接采用试剂盒提取未得到高质量的 DNA，在
分子生物学上被称为顽拗植物［13］。本研究参照肖璇等［9］提取龙
眼基因组 DNA的思路，在破核溶解 DNA前用核分离液处理液氮
研磨后的样本，以去除细胞质中的杂质。后续提取过程按试剂盒
说明书操作。最终成功提取 5 种钩藤属药用植物 DNA。
优化后的试剂盒法提取的 DNA溶液无色透明，无粘稠，电泳
条带清晰可见(图 1)。A260 /A280 在 1． 8 ～ 2． 0 之间(表 2) ，样
品 DG1 和 DG3 为半干品，其余为新鲜品，由实验数据可知半干品
所提取 DNA 浓度较干品低，但纯度无显著差异，说明提取的
DNA质量好，适合 RAPD分析。
3． 2 RAPD扩增结果 18 条 RAPD 引物对 5 个钩藤属植物样本
进行扩增得到条带的相对分子量集中在 200 ～ 2000bp之间，得到
亮带和可识别的暗带共计 260 条。其中共有条带 29 条，多态性
条带 231 条，多态率达到 88． 9%。平均每个引物产生 14． 4 条带
和 12． 8 多态性条带(表 3)。扩增效果好，可用于对样本的分类
鉴定。部分扩增图谱见图 2。
表 2 基因组 DNA的纯度、浓度
样本编号 A260 A280 A260 /A280 浓度 /μg·ml －1
DG1 0． 718 0． 357 1． 89 35． 9
DG2 3． 787 1． 940 1． 98 189． 4
DG3 0． 582 0． 311 1． 88 29． 1
BG 1． 514 0． 807 1． 87 75． 7
MG 1． 174 0． 589 1． 99 58． 7
GD1，GD2，GD3，BD，MD为相应的样本编号(见表 1)
图 1 5 个样本基因组 DNA电泳图
表 3 18 条随机引物 RAPD扩增结果
引物编号 扩增条带数 多态性条带数 多态率(%)
1 17 15 88． 2
2 21 19 90． 5
3 15 15 100
4 11 11 100
5 10 8 80． 0
6 19 16 84． 2
7 16 15 93． 8
8 22 21 95． 5
9 12 10 83． 3
10 15 12 80． 0
11 15 15 100
12 13 12 92． 3
13 11 10 90． 9
14 11 10 90． 9
15 14 13 92． 9
16 14 12 85． 7
17 11 8 72． 7
18 13 9 69． 2
总计 260 231 －
平均 14． 4 12． 8 88． 9
3． 3 聚类分析 根据扩增条带计算 5 个钩藤属植物的遗传相似
系数。结果见表 4。聚类分析结果见图 3。
GD1，GD2，GD3，BD，MD为相应的样本编号见表 1;
M表示 Marker DL5000
图 2 8 条引物对 5 个样本的扩增结果
表 4 5 个钩藤属植物的遗传相似系数
DG1 DG2 DG3 BG MG
DG1 1． 0000000
DG2 0． 8846154 1． 0000000
DG3 0． 8461538 0． 8153846 1． 0000000
BG 0． 4269231 0． 4192308 0． 4884615 1． 0000000
MG 0． 5000000 0． 4692308 0． 4846154 0． 4192308 1． 000000
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图 3 用 UPGMA法构建的 5 个钩藤属植物的聚类图
5个样本在遗传距离 0． 55 的位置上可分为 3 类:3 种大叶钩
藤归为一类，毛钩藤，白钩藤各为一类;不同产地 3 种大叶钩藤之
间的遗传相似系数最大为 0． 88，表明该物种具有丰富的多态性，
而产地靠近的大叶钩藤 1 和大叶钩藤 2 遗传相似性系数高于与
大叶钩藤 3 之间，可认为多态性与地域有关;大叶钩藤与毛钩藤
在遗传距离 0． 50 处可为一类，而与白钩藤在 0． 44 处可为一类，
表明毛钩藤比白钩藤在亲缘关系上更靠近大叶钩藤。
4 讨论
高质量的基因组 DNA提取是进行药用植物分子生物学研究
的重要环节。由于中草药大多为多年生植物，富含次生代谢物，
在提取过程中与 DNA发生不可逆结合，导致 DNA 提取效率低，
并影响后续反应。段中岗等［13］将 7 种 DNA 提取方法进行比较，
总结出改进后的 CTAB 法为顽拗植物 DNA 提取的有效方法，但
该方法用时长，并且实验操作对提取结果影响较大，使得在大样
本，尤其在植物 DNA条形码研究中的运用受到限制。
近年来，越来越多的实验室采用试剂盒法提取 DNA，其优点
在于省时，方便，稳定，从而适合样本量较大的研究。但由于不同
公司生产的试剂盒适用范围有限，按照说明书的操作不能有效提
取所有植物特别是顽拗植物的 DNA，针对某一种属或某一种植
物对试剂盒方法的改进是必不可少的。黄凤兰等［14］通过对试剂
盒的改进成功提取高质量的蓖麻基因组 DNA，主要进行了反应
条件(包括反应时间、温度等)的优化，并未改变反应步骤。本研
究使用基于 CTAB法的离心柱型试剂盒辅以 STE 核分离液［9］处
理，充分利用传统提取法和试剂盒法的优势，获得质量较好的基
因组 DNA，适合 RAPD研究。
实验结果表明，不同产地的 3 个大叶钩藤遗传相似系数仅为
0． 81 ～ 0． 88，提示大叶钩藤具有丰富的多态性。而产地靠近的
DG1和 DG2 的遗传相似系数高于与 DG3 比较的遗传相似系数，
提示该多态性可能与地域相关，还有待今后进一步研究。广西钩
藤属植物资源丰富，分子水平上找到地区特异性的分子标记，可
为广西钩藤属药用植物的开发利用提供理论依据。
我们通过观察，在叶片大小，厚度，色泽，有无毛刺等形态学
特征上白钩藤比毛钩藤更接近大叶钩藤。本研究发现，在遗传距
离上毛钩藤较白钩藤更接近大叶钩藤，与形态学的观察有差异。
后续可通过增大样本量以及相关序列的比对进一步比较相互间
遗传距离。要得到可靠的遗传距离，应该尽可能地增加物种内的
取样个体数。然而，考虑到研究成本，现在通常认为每个物种内
不超过 10 个个体，并最好包括 5 个不同居群［15］。
目前，钩藤属药用植物的分子标记相关研究仅见于陶刚
等［16］对贵州中药材钩藤属植物的 ITS 序列进行比对分析，但是
对不同钩藤属植物的 RAPD 图谱分析还没有报道。本研究通过
RAPD扩增得到 29 条种间共有条带和一些种内特有条带，目前
已筛选出扩增效率高，分辨率好，分子量适中的条带。种间共有
条带 :1 号引物扩增，长度 1 580 bp 条带;5 号引物扩增长度 440
bp条带;6 号引物扩增，长度 1 200 bp条带;9 号引物扩增，长度 1
290 bp条带;14 号引物扩增，长度 520 bp 条带;17 号引物扩增，
长度 1 050 bp条带。大叶钩藤共有条带:2 号引物扩增，长度为 1
122 bp和 430 bp条带;3 号引物扩增，长度 1 500 bp条带;13 号引
物扩增，长度 490bp条带;18 号引物扩增，长度 450bp条带。这些
条带有望作为种内和属内的分子标记。白钩藤和毛钩藤的特征
性条带与其它条带长度差异不明显，需扩大样本量实验才能确
定。在后续的研究中我们将针对以上 RAPD特征性条带 DNA序
列设计特异引物，转化为稳定的 SCAR 标记，从而增加扩增结果
的稳定性和重复性，为钩藤属药用植物的分子鉴定提供理论依
据。
致谢:广西民族药物研究所黄瑞松研究员为本研究鉴定并
提供样品，特此致谢。
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