全 文 ：书药用绞股蓝属植物基因组ＤＮＡ提取方法比较
　收稿日期：２０１２－０７－０６
　基金项目：：陕西省教育厅（２００９ＪＫ３１６）与安康学院科技创新团队 （２００８ＡＫＸＹ００６）项目共同资助。
　作者简介：杨松杰（１９６４－），男，河北深州人，博士，副教授，主要从事植物遗传资源与生物工程教学与研究。
杨松杰
（安康学院农学与生命科学院，陕西省富硒食品工程实验室，陕西 安康　７２５０００）
摘　要：从叶片中提取高质量的ＤＮＡ是进行绞股蓝分子生物学研究的前提。植物基因组ＤＮＡ的提取方法
较多，笔者以安康平利县产绞股蓝属植物幼嫩叶片为材料，通过采用改良的ＣＴＡＢ法、改良ＳＤＳ法和高盐低
ｐＨ值法三种方法提取绞股蓝基因组ＤＮＡ，并通过琼脂糖凝胶电泳对所提取ＤＮＡ样品进行质量检测。结果
显示高盐低ｐＨ值法提取的ＤＮＡ电泳主带较亮且点样孔基本无异物，为绞股蓝叶片ＤＮＡ提取比较适宜的
方法。
关键词：绞股蓝；基因组ＤＮＡ；ＤＮＡ提取；优化
　　绞股蓝（Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ　ｐｅｎｔａｏｈｙｌｌｕｍ （ｔｈｕｎｂ）
Ｍａｋｉｎｏ）系葫芦科绞股蓝属多年生草本质藤本植
物［１］。据《中药大辞典》记载，绞股蓝味苦寒、无毒，
具有消炎解毒、止咳祛痰之功，主要用来治疗慢性
支气管炎。药理实验和临床应用证实，绞股蓝不仅
对人体有滋补、镇静、催眠、抗紧张、促食欲、降血
脂、降胆固醇、降转氨酶、延缓衰老等作用，还能防
止正常细胞癌化并使癌细胞转化为正常细胞［２－４］。
１９８６年，国家科委在“星火计划”中，把绞股蓝列为
待开发的“名贵中药材”之首位，２００２年３月５日国
家卫生部将其列入保健品名单［５］。
我国绞股蓝属植物资源丰富，广泛分布于秦
岭及长江以南地区。在长期的自然环境及人工栽
培的条件下，逐渐形成了众多品种及栽培类型［６］。
目前，对绞股蓝的研究主要集中在栽培管理、化学
成分、药理作用、皂甙提取工艺的改善等方面。自
绞股蓝产品开发以来，野生绞股蓝资源在全国范
围内被广泛的采集与栽培，并经多年人工培育和
选育，逐渐形成了众多的地方品系及栽培类型。
安康平利县建有国家中药绞股蓝生产 ＧＡＰ基
地，管理规范，药材质量得到保证，已有我国“绞股
蓝第一大乡”之称 ［７－１０］。
从绞股蓝叶片提取高质量的ＤＮＡ是进行绞
股蓝分子生物学与分子遗传学研究的前提。提取
植物基因组ＤＮＡ已发展出的方法较多，或多或
少都能从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮
部等组织器官中提取出ＤＮＡ。但是有些情况下，
不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、
部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织
结构等内在特点的差异，在提取基因组ＤＮＡ时
需要选择不同的方法或作一些特殊的处理［１１］。
笔者实验将在传统植物ＤＮＡ提取方法基础上对
绞股蓝进行基因组ＤＮＡ的提取，以优化出适合
绞股蓝基因组ＤＮＡ提取的最有效办法。
１　实验材料与仪器
１．１　实验材料
实验以安康平利县百草堂科技有限公司绞股
蓝种质资源圃基地中种植的绞股蓝幼嫩叶片为材
料，采摘的叶片经冷冻干燥后置于－８０℃超低温
冰箱保存备用。
１．２　主要试剂、仪器
ＣＴＡＢ、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、ＰＶＰ、ＫＡｃ、ＮａＡｃ均购
自上海生工生物工程有限公司。其他试剂为国产
分析纯。
高速冷冻离心机（Ｔｈｅｒｍｏ公司），漩涡混合
器（江苏康健医疗用品有限公司），ＷＤ－９４１３Ｃ
凝胶成像分析仪（北京市六一仪器厂），ＰＨＳ－３Ｃ
型ｐＨ计（上海精密科学有限公司），超低温冰箱
（青岛海尔特种电器有限公司），Ｈ１干式恒温器
（珠海黑马医学仪器公司），电泳仪（百维信生物公
司），电子天平（德国赛多利斯股份公司），立式压
力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），液氮生物
容器（成都金凤液氮容器有限公司），微型台式真
空泵（绍兴市卫星医疗设备制造有限公司），制冰
机等。
·７８·２０１３（１） 陕　西　农　业　科　学
书２　实验方法
２．１　基因组总ＤＮＡ提取
将保存的绞股蓝幼叶用液氮研磨至粉末状，
分别采用以下三种方法提取基因组总ＤＮＡ。
（１）改良ＣＴＡＢ法：称取１００ｍｇ干粉于１．５
离心管，加入５００μｌ６５℃预热的 ＣＴＡＢ提取液
（１００ ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ·ＨＣ１ｐＨ８．０，３％ 可溶性
ＰＶＰ，２％β－巯基乙醇，２５ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ
８．０，２％ＣＴＡＢ）充分混匀后于６５℃保温３０ｍｉｎ，
取出稍冷却降至室温后加入等体积的氯仿／异戊
醇（２４∶１），振荡至出现乳浊状静置分层后１２　０００
ｇ，４℃离心１０ｍｉｎ，重复上述步骤至分层后中间
无白色物质，取上清液加入２倍体积－２０℃预冷
的无水乙醇，－２０℃静置３０ｍｉｎ，１５　０００ｇ，４℃离
心１５ｍｉｎ，７０％的乙醇洗涤沉淀２次，风干后溶
于５０μｌ　ＴＥ缓冲液中，４℃保存。
（２）改良的ＳＤＳ法：称取１００ｍｇ干粉于１．５
ｍｌ离心管中，加入５００μｌ冰上预冷的提取液（５０
ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ·ＨＣ１ｐＨ８．０，３％可溶性ＰＶＰ，２％
β－巯基乙醇，５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０，充分混
匀后冰上放置１０ｍｉｎ，６　０００ｇ离心５ｍｉｎ，弃上
清，加入提取液重悬沉淀，离心后弃上清，沉淀加
入５００μｌ６５℃预热的裂解缓冲液（１００ ｍｍｏｌ／ｌ
Ｔｒｉｓ·ＨＣ１ｐＨ８．０，２０ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０，
５００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣＬ，１．５％ＳＤＳ），６５℃水浴３０ｍｉｎ，
不时轻轻颠倒，取出稍冷却后加入５００氯仿／异戊
醇（２４∶１），颠倒成乳浊状，１０　０００ｇ，４℃离心１０
ｍｉｎ，重复２次，取上清加入０．２５（ｖ／ｖ）乙醇和
０．１１（ｖ／ｖ）５ｍｏｌ／ｌ　ＫＡｃ（ｐＨ４．８），立即１０　０００ｇ，
离心１０ｍｉｎ，取上清加入等体积－２０℃预冷的异
丙醇，置－２０℃静置３０ｍｉｎ，１５　０００ｇ，４℃离心２０
ｍｉｎ，７０％的乙醇洗涤沉淀２次，风干后溶于５０μｌ
ＴＥ缓冲液中，４℃保存。
（３）高盐低ｐＨ值法：称取１００ｍｇ干粉于１．５
ｍｌ离心管中，加入５００μｌ　６５℃ 预热提取液（１００
ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＡｃ，３％可溶性 ＰＶＰ，２％β－巯基乙
醇，２５ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０，１．５％ＳＤＳ），充分
混匀后于６５℃中保温３０ｍｉｎ，不时轻轻颠倒，
４℃，１０　０００ｇ离心１０ｍｉｎ，取上清液加２／３倍体
积的２．５ｍｏｌ／ｌ　ｐＨ４．８的ＫＡｃ溶液，０℃放置１５
ｍｉｎ，１０　０００ｇ，４℃离心１０ｍｉｎ取上清液加等体积
的氯仿／异戊醇（２４∶１），振荡至出现乳浊状，静置
分层后１０　０００ｇ，４℃离心１０ｍｉｎ，取上清液加等
体积的－２０℃预冷的异丙醇，－２０℃静置３０
ｍｉｎ，１５　０００ｇ，４℃离心２０ｍｉｎ，７０％的乙醇洗涤
沉淀２次，风干后溶于５０μｌ　ＴＥ 缓冲液中，４℃
保存。
２．２　基因组ＤＮＡ的检测
用１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测用不同方法
提取的绞股蓝植物基因组ＤＮＡ，并在紫外凝胶成
像仪上观察拍照（图１）。
图１　３种方法提取的绞股蓝基因组ＤＮＡ电泳分析
泳道１．高盐低ｐＨ法；泳道２．改良ＳＤＳ法；泳道３．改良ＣＴＡＢ法
３　结果与分析
图１为三种方法提取的基因组ＤＮＡ琼脂糖
凝胶电泳结果。从图中看出，高盐低ｐＨ 值法提
取的ＤＮＡ电泳主带较亮且点样孔基本无异物，
说明该法效果最好，对绞股蓝叶片中多糖和次生
代谢产物的去除效果较好。
实验操作上，改良ＳＤＳ法较为繁琐，费时；改
良的ＣＴＡＢ法在加入乙醇的过程中容易使ＤＮＡ
沉淀，但该方法步骤少，比较简便，但ＤＮＡ产量
减少；而高盐低ｐＨ 值法相对省时且提取效果
较好。
植物组织材料的采集与保存对提取ＤＮＡ 的
产量和质量有很大影响。通常应尽可能采集新
鲜、幼嫩的组织材料。采集过程中应尽可能使组
织材料保持水分，用浸湿的纱布包裹采集的组织
材料，并放置在密闭的冰盒中，这样可使组织材料
３－５ｄ仍保持新鲜。野外远距离采集样本时，在
可能的条件下冷冻保存；当不具备冷冻条件时，最
好用盛有无水ＣａＳＯ４的瓶子保存，使其迅速干
燥，这种方法可将材料保存数月，返回后应尽快进
行ＤＮＡ 的提取工作。对具有大量次生代谢物
·８８· 陕　西　农　业　科　学 ２０１３（１）
书（如丹宁、酚类、醌类等）的植物材料，应尽可能采
集幼嫩组织外，最好进行冷冻保存并在短时间内
进行ＤＮＡ提取。对于采集回来的样品如要长期
保存，应经液氮处理后贮存在－８０℃冰箱或直接
储放于液氮中，且在与提取缓冲液接触前，应防止
冰冻的样品在空气中融化，否则酚类易被氧化。
李学营等［１２］报道保存的植物叶片在半年内提取
ＤＮＡ结果并无明显变化。谢中稳等人［１３］从室温
下贮存１周、３个月、６个月、１ａ的硅胶干燥叶片
中提取的ＤＮＡ用于ＲＡＰＤ扩增所得的扩增产物
没有差异。因此干燥保存植物叶片用于ＤＮＡ分
析是可行的，但对于绞股蓝而言干燥保存的最长
时间有待进一步确定。
绞股蓝叶片富含酚类及多糖，ＳＤＳ法提取的
ＤＮＡ呈深褐色且电泳拖尾现象严重，笔者实验
中对传统的ＳＤＳ法进行了改进。提高提取缓冲
液中β－巯基乙醇的浓度至２％，并在研磨样品时
加入３％ＰＶＰ。ＰＶＰ有很强的结合多酚化合物的
能力，可与多酚结合形成复合物，可以在抽提液中
加入ＰＶＰ以去除多酚的影响。在细胞裂解液中
加入ＰＶＰ，解决了酚类、色素和蛋白质等对ＤＮＡ
质量的影响。β－巯基乙醇作为强还原剂也能防
止多酚的氧化，还可以打断多酚氧化酶的二硫键
使之失活。二者协同作用，有效地抑制酚类物质
对ＤＮＡ的影响［１４］。
高盐低ｐＨ 值法提取的 ＤＮＡ纯度较好，从
ＤＮＡ的检测结果及实验操作方面综合比较，高盐
低ｐＨ法最适合绞股蓝叶片ＤＮＡ的提取。电泳
图谱显示高盐低ｐＨ值法提取的ＤＮＡ点样孔较
亮，可能高盐对绞股蓝ＤＮＡ多糖的去除效果不
明显，也可能是在沉淀ＤＮＡ时较大的离心力使
ＤＮＡ与杂志结合紧密，短时间的高盐浸泡不能很
好的溶解多糖。
改良的ＳＤＳ法对未经提取液预洗的样品提
取ＤＮＡ，结果提取出的ＤＮＡ颜色呈黄色，不能
全部溶解在ｄｄＨ２０中。李均敏等［１５］提到对实验
样品先预洗以除去细胞质中的多糖和酚类物质，
可以得到质量较好的ＤＮＡ，郭宝林［１６］等人在提
取丹参干叶片ＤＮＡ时，使用０．２５（ｖ／ｖ）乙醇和
０．１１（ｖ／ｖ）５ｍｏｌ／ｌ　ＫＡｃ（ｐＨ４．８）去除多糖效果明
显，结合以上方法，对 ＳＤＳ法进行改良，提取
ＤＮＡ前先将样品预洗，并且使用 ＫＡｃ（ｐＨ４．８）
和乙醇去除多糖，得到白色的ＤＮＡ沉淀，但产量
较未预洗的少。改良的ＣＴＡＢ法得到的ＤＮＡ产
量和质量均不高，可能是单独使用乙醇对除绞股
蓝多糖的去除效果不明显，同时ＤＮＡ也被沉淀
下来造成产量的大大减少。
参 考 文 献：
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学出版社，１９８６：２６５－２７７．
［２］　孙广利，边洪荣．长梗绞股蓝与绞股蓝最新研究进
展［Ｊ］．中华实用中西医杂志，２００３，３（１６）：１　８２３－
１　８２４．
［３］　江波，兰小中．药用植物绞股蓝的研究新进展［Ｊ］．西
藏科技，２００５，（１２）：１５２．
［４］　李俊峰，李文军．绞股蓝药理作用的研究进展［Ｊ］．河
北中医药学报，１９９９，１４（２）：３７－４２．
［５］　岳琳娜，高学玲，岳鹏翔．绞股蓝有效成分的研究进
展［Ｊ］．综述与述评，２００８，（１１）：６．
［６］　周霞，何和明，郑觉．绞股蓝生态生理特性的研究
［Ｊ］．中国野生植物资源，２００８，１８（２）．
［７］　李纯，孟洁．安徽省绞股蓝资源调查及质量评价［Ｊ］．
安徽农学通报，１９９７，３（３）：２２－２４．
［８］　郑小江，刘金龙．恩施州绞股蓝属植物及绞股蓝类型
调查［Ｊ］．中国野生植物资源，２００２，２１（２）：２０－２２．
［９］　李敏莲，程建国．秦巴山区中草药资源及其开发［Ｊ］．
陕西农业科学，２００２，（１０）：１９．
［１０］　宋小俊．商洛地区绞股蓝野生资源及开发［Ｊ］．商洛
师范专科学校学报，１９９９，１０（４）：８５－８６．
［１１］　Ｃｓａｉｋｌｕｍ，Ｂａｓｔｉａｎ　Ｈ，Ｂｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ　ｆａｓｔ，ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｍａｘｉ－ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｈｉｇｈ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｐｌａｎｔ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，１９９８，６１：６９－８６．
［１２］　李学营，彭建营，彭士琪等．部分枣属硅胶干燥叶
片ＤＮＡ提取方法的比较［Ｊ］．河北农业大学学报，
２００６，２９（１）：３８－４０．
［１３］　谢中稳，曹颂，洪德元等．从普通野生稻硅胶干燥的
小量叶片中制备ＤＮＡ用于ＲＡＰＤ分析和总ＤＮＡ
库的建立［Ｊ］．植物学报，１９９９，４１（８）：８０７－８１２．
［１４］　陈莉，魏莉，周童等．几种中药ＤＮＡ提取方法的比
较研究［Ｊ］．广西植物，２００７，（１）：１３７－１３９．
［１５］　李均敏，金则新，边才苗等．大血藤 ＤＮＡ提取及
ＲＡＰＤ研究初探［Ｊ］．植物研究，２００２，２２（４）：１１．
［１６］　郭宝林，林生．丹参干叶片的ＤＮＡ提取［Ｊ］．中草
药，２００２，３３（５）：４１８．
致谢：实验得到安康平利县百草堂生物技术
有限公司、安康学院农学与生命科学学院薛沁和
高望同学的大力支持与帮助，特此致谢。
·９８·杨松杰：药用绞股蓝属植物基因组ＤＮＡ提取方法比较