全 文 ：背景颜色太深 , 条带模糊难以观察 , 过短会使条带显影不完
全。AFLP分析是一种高效的 DNA指纹图谱技术 , 具有多态性
强 、灵敏度高 、稳定可靠等优点 , 在华中五味子指纹图谱构建
和遗传多样性分析等相关研究中具有广阔的应用前景。
参考文献:
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优化蕺菜属 ITS-PCR扩增条件的研究
赵欢1 , 2 ,吴卫2＊ ,郑有良2(1.西华师范大学生命科学学院 , 四川 南充 637002;2.四川农业大学农学院 , 四川 雅安 625014)
摘要:目的:建立蕺菜 rDNA ITS 扩增反应的优化体系。 方法:以蕺菜 DNA 为模板 , 采用单因素试验设计 , 对影响蕺菜 rDNA
ITS 区扩增的重要参数进行了优化试验。结果:最优蕺菜 ITS-PCR 的反应体系为 25μl反应体系中含 Taq 酶 0.75U、Mg2+ 2.
5mmol L、dNTP 0.15mmol L、引物对 0.6μmol L、模板 DNA 10ng。扩增程序为在 94℃下预变性 4min , 然后进行 36 个循环(94℃变性
45s , 60℃退火 50s , 72℃延伸 90s), 最后在 72℃延伸 8min。结论:这一体系的建立为利用蕺菜 rDNA ITS 区研究蕺菜种质资源的系
统进化提供了标准化程序。
关键词:蕺菜;PCR反应体系;rDNA ITS;影响因子;优化
中图分类号:Q781　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2009)02-0040-05
A Preliminary Study of Optimal Condition on PCR Amplification
of rDNA ITS Sequence from Houttuynia Thunb
ZHAO Huan
1, 2 ,WU Wei2＊ ,ZHENG You-liang2
(1.College of Life Science , China West Normal University , Nanchong 637002;2.Agronomy College of Sichuan Agricultural University , Ya an 625014 , China)
Abstract:Objective:we optimized PCR conditions for amplifying rDNA ITS from Houttuynia Thunb.Method and Result:The results indicated
that the best ITS -PCR reaction system should follow the conditions as follows:Taq DNA polymorase0.75U , Mg2+ 2.5mmol L , dNTP 0.
15mmol L , primers 0.6μmol L , DNA 10ng.PCR procedures are described as follows:94℃ for 4min , followed by 36 cycles (94℃ for 45s ,
60℃ for 50s , 72℃ for 90s), finally extended at 72℃ for 8min.Conclusion:The result provided a standard ITS-PCR program for the analysis
of phy logenic and evolutionary of Houttuynia Thunb.
Key words:Houttuynia Thunb.;PCR reaction system;rDNA ITS;influencing factors;optimization
收稿日期:2008-12-01;修回日期:2009-01-20
基金项目:四川省教育厅重点资助项目(2003 A011);教育部留学回国
人员科研启动基金项目资助
作者简介:赵欢(1982-),女 ,硕士 , 助教 ,研究方向:生物化学与分子
生物学 , Tel:0817-2568353 , Email:zhaohuan1982@yahoo.com.cn;＊通
讯作者:吴卫(1970-), 女, 博导 , 教授 ,研究方向:药用植物学 , Tel:
0835-2882108 , Fax:0835-2882336 ,Email:ewuwei@sicau.edu.cn。
　　蕺菜为三白草科(Saururaceae)蕺菜属(Houttuynia)多年生
草本植物 , 其全草入药 , 性寒味辛 , 有清热解毒 、利尿消肿 、祛
痰止咳 、镇痛化瘀等功效 , 尤其抗菌 、抗病毒作用明显[ 1 ,2] 。自
国家卫生部正式确定为“既是药品 ,又是食品”的极具开发潜
力的资源之后 ,蕺菜的开发利用及基础研究上有了突破性进
展 ,并在制药 、化妆品 、保健食品 、保健饮料等领域开发出一系
列的产品[ 3] 。
高等植物细胞核中 nrDNA 是高等植物中的 rRNA 基因
(rDNA)是高度重复的串联序列单位 , 18S 、5.8S 和 26S rDNA 联
结在一起 ,作为一个转录单位。 18S-26S rDNA在植物中有一
至数个位点[ 4] , 拷贝数可达 500 ～ 40 000 , 18S-26S rDNA 基本
结构由18S rDNA、26S rDNA、5.8S rDNA 和位于三者之间的基因
内转录间隔区(ITS)组成 , 其中 ITS 区由被 5.8S rDNA所分隔的
ITS1和 ITS2两个片段组成[5] 。其转录物不加入成熟核糖体 ,
只是部分地对 nrDNA的成熟起作用。目前 , ITS 区序列分析已
成为在分子水平上探讨科 、亚科 、属 、种 ,尤其是近缘属种间关
系十分有效的手段 , 在植物系统发育与分类的研究中起了重
要作用。曹晖等[ 6]还认为可将 ITS 区用于种下一级分类群亲
缘关系研究。本试验针对蕺菜资源 ITS -PCR 反应体系中
Mg2+、dNTP、随机引物 、Taq 酶的浓度和退火温度 、循环次数等
因素进行优化 , 旨在建立一套主要影响因子进行了优化研究 ,
旨在建立一套适合蕺菜 ITS -PCR 的反应体系 , 为今后运用
rDNA ITS 区研究蕺菜属植物种内及种间系统进化关系 , 并提
高实验的准确性奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验材料
23 份材料于 2001年采集于四川和重庆不同地区 , 包括 22
份蕺菜 Houttuynia cordata Thunb.与 1 份峨嵋蕺菜 Houttuynia
emeiensis Z.Y.Zhu et S.L.Zhang(W01-86)。所有材料均由四川
农业大学农学院特用植物生产学系吴卫教授鉴定 , 材料均栽
培于四川农业大学小麦研究所。 每个居群的凭证标本现保存
在四川农业大学教学科研农场。
1.1.2　试剂
Taq DNA聚合酶 、Mg2+购自宝杰生物科技有限公司 , dNTP
购自上海英骏生物技术有限公司 , ITS 引物(上游序列:5 -
CGTAACAAGGT TTCCGTAGTGA AC-3 ;下游序列:5 -TTATT-
GATATGCCTTAAACTCAGCGGG-3 )由上海英骏生物技术有限
公司合成 ,琼脂糖和Tris 来自 Bio Basic 公司 , 溴化乙锭购于华
美生物工程公司。
1.1.3　仪器
PCR扩增仪(bio-Rad-2200), 紫外凝胶成像系统(Bio-
Rad),电泳仪(Bio-Rad),各种型号微量移液器 ,各种枪头。
40　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 19(2)
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2009.02.031
表 1　蕺菜材料的采集地 、染色体数目和生境
Table 1　The sources of the germplasm resources of genus Hout tuynia
材料号 来源地 生境
W01-86 四川峨眉山 中药校标本园栽培地
W01-9 四川井研王家乡 田埂 、野生
W01-22 四川宜宾市金平区 坡上草丛、野生
W01-48 四川内江市中区 坡上草丛、野生
W01-39 重庆彭水县汉邻区 坡上草丛、野生
W01-43 四川马尔康县马尔康镇 蔬菜大棚、人工栽培
W01-38 重庆黔江区咸丰区 坡上草丛、野生
W01-81 四川芸经县太湖寺 坡上林下、野生
W01-16 四川宜宾市宜宾县 田埂 、野生
W01-80 四川绵阳市槐树乡 坡上草丛、野生
W01-71 四川巴中市磨子乡 田埂 、野生
W01-76 四川盐亭富驿镇 公路边 、野生
W01-37 重庆县酉阳县中都区 水沟边 、野生
W01-59 四川剑阁剑门镇 河边 、野生
W01-18 四川高县尚武镇双河乡 田埂 、野生
W01-66 四川南江县沙河镇 河边 、野生
W01-45 四川汶川县漩口镇 路边坡上、野生
W01-46 四川都江堰紫坪 坡上草丛、野生
W01-98 四川雅安和龙乡 坡上草丛、野生
W01-83 四川南充嘉陵区 田埂 、野生
W01-99 四川资阳 田埂 、野生
W01-94 四川雅安望渔乡 坡上草丛、野生
W01-100 四川邛崃 坡上草丛、野生
1.2　方法
1.2.1　rDNA ITS 区扩增体系
针对模板 DNA 浓度 、Taq 酶的用量 、Mg2+浓度 、dNTP浓度 ,
分别设计如下梯度:模板 DNA 浓度设为10ng、20ng、30ng、40ng 4
个梯度;Taq 酶用量设为 0.25U、0.5U、0.75U、1U、1.25U和 1.5U
5 个梯度;Mg2+浓度为 1、1.5、2、2.5、3 和 4mmol L 6 个浓度梯
度;dNTP浓度设为 100、200、300 、400μmol L 4 个梯度;10×buffer
(Mg2+ free)取 2.5μL, 反应体系为 25μL , 不足体积用无菌的超
纯水补齐 ,用 ITS 引物对蕺菜 rDNA ITS 区进行扩增。每次 PCR
扩增除比较因素按上述浓度梯度变动外 ,其他反应因子相同。
通过反复对比试验找出最佳反应体系 , 并且每个因素 3 次重
复进行优化条件的检验。
1.2.2　rDNA ITS 区扩增反应程序
利用筛选后的最佳的 rDNA ITS 区扩增反应体系对扩增反
应程序进行优化 , 反应程序如下:94℃预变性 4min , 94℃变性
45s , 50℃～ 60℃复性 45s , 72℃延伸 2min , 循环 36 ～ 40 次 , 然后
72℃延伸 8min。其中 ,对温度和循环次数进行梯度试验 , 设置
的复性温度50℃～ 60℃之间 , PCR扩增仪上自动生成6 个温度
梯度为 50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃;循环次数设为 30 、
33 、36、40次 4 个梯度。
1.2.3　电泳检测
PCR扩增反应结束后 , 采用 0.5×TBE 电泳缓冲液 , 1%琼
脂糖凝胶(含 0.5%EB)电泳。 取 10μl扩增产物与 2μl电泳载
体缓冲液混匀 ,电压为 100V , 电泳产物在凝胶成像系统观察分
析。
2　结果与分析
2.1　模板 DNA浓度
试验设了 4 个梯度 , 从左到右分别是 10ng、20ng、30ng 、
40ng ,从图 1 中可见 ,模板 DNA浓度在 10～ 30ng 之间 , DNA 浓
度高低对 ITS-PCR扩增效果无明显影响 , 扩增条带均为亮且
清晰;而当模板 DNA浓度为 40ng ,扩增条带变弱。试验表明 ,
模板 DNA 浓度用量范围以 10～ 30ng 为宜 , 但考虑到带的强度
和清晰度 、节约试剂三方面 , 选择 10ng 模板 DNA浓度进行蕺
菜资源的 ITS 区扩增。
图 1　模板 DNA量对 ITS扩增效果的影响
Fig.1　The effect of DNA polymerase amount on the amplifi cation of ITS-PCR
M 为Marker П;泳道 1～ 4分别对应的模板 DNA 量为 10 、20 、30 、40ng。
M is markerП;1-4:The Taq DNA polymerase amount is 10, 20 , 30 , 40ng ,
respectively.
2.2　Taq 酶的用量
Taq 酶用量设为 0.25U、0.5U、0.75U、1U、1.25U 和 1.5U 5
个梯度。由图 2 可见 , Taq 酶用量对扩增结果影响较大 , 当
Taq 酶用量小于 0.75U时 , ITS 扩增结果除 800bp 出现一条明
亮的主带外 , 在 500bp 处还有一条非特异性的条带;Taq 酶用
量在 0.75U时扩增产物条带清晰 , 且重复性好;Taq 酶用量大
于 0.75U时 , 不能检测到与预期结果相应的条带。故在确保
试验结果稳定的情况下 , Taq 酶用量以 0.75U为宜。
图 2　Taq聚合酶用量对 ITS扩增效果的影响
Fig.2　The effect of Taq DNA polymerase amount on the amplifi cation of ITS
-PCR
M为 MarkerП;泳道 1 ～ 5 分别对应的 Taq DNA 聚合酶单量为 0.25、
0.75、1 、1.25 、1.5U。
M is markerП;1～ 5:The Taq DNA polymerase amount is 0.25 , 0.75, 1.0,
1.25 , 1.5U , respectively.
2.3　Mg2+的浓度
Mg2+浓度对 PCR反应的特异性和扩增效率有很大影响 ,
反应体系中的 Mg2+用量是决定 PCR扩增反应成败的关键因
素之一。在 25μL反应体系中设Mg2+浓度为 1、1.5、2 、2.5 、3 和
4mmol L 6 个浓度梯度对蕺菜 DNA 进行 ITS 扩增(图 3)。从图
3可见 ,Mg2+浓度在 1mmol L ～ 1.5mmol L 时扩增条带很弱 ,
Mg2+浓度在 2.0～ 3.0mmol L时扩增产物条带亮且清晰 , 没有
特异的扩增产物 ,在 Mg2+浓度大于 4.0mmol L 时扩增产物出
现两条扩增条带。实验结果表明 , Mg2+浓度范围以 2.0 ～
3.0mmol L为宜 , 但考虑到带的强度和清晰度 、节约试剂三方
面 , 选择 2.5mmol L Mg2+浓度进行蕺菜资源的 ITS 区扩增。
2.4　dNTP 的浓度
将 dNTP浓度设为 100、200、300、400μmol L 4 个梯度 , 以蕺
菜 DNA为模板 , 用 ITS引物对其进行 PCR扩增(图 4)。从图 4
可见 , 当 dNTP浓度在 100μmol L时扩增产物条带亮且清晰;
200～ 300μmol L 时扩增产物条带亮度变弱 , 可能与 dNTP过量
有关;dNTP浓度为 400μmol L 时 ,不能检测到与预期结果相应
的条带。实验结果表明 , 100μmol L的 dNTP浓度可满足反应的
412009 年 19(2)　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
要求。
图 3　Mg2+浓度对 ITS扩增效果的影响
Fig.3　The effect of Mg2+ concentration on the amplif ication of ITS-PCR
M为Marker П;泳道 1 ～ 6分别对应的 Mg2+浓度为 1 、1.5 、2.0 、2.5 、3 、
4mmol L 。
M is marker П;1～ 6:The Mg2+ concentration is 1, 1.5 , 2.0, 2.5 , 3 ,
4mmol L , respectively.
图 4　dNTP浓度对 ITS扩增效果的影响
Fig.4　The effect of dNTP concentration on the amplifi cation of ITS-PCR
M为Marker П;泳道 1 ～ 4 分别对应的 dNTP 浓度为 100 、200 、300 、
400μmol L 。
M is marker П;1～ 4:The dNTP concent ration is 100 , 200, 300 , 400μmol
L , respectively.
2.5　PCR扩增的复性温度
将退火温度设为 6 个梯度:50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、
60℃。如图 5所示 , 退火温度为 60℃时 ,扩增产物仅有一条条
带 ,条带亮且清晰 , 无非特异性条带。而其他温度时 , 均有非
特异性条带出现。故退火温度应以 60℃为宜。
图 5　退火温度对 ITS扩增效果的影响
Fig.5　The effect of annealing temperature on the amplification of ITS-PCR
M为Marker П;泳道 1～ 6分别对应的复性温度为 50 、52、54 、56 、58 、60℃
M is marker П;1～ 6:The annealing temperature i s 50 , 52, 54 , 56 , 58, 60℃,
respectively
2.6　PCR扩增的循环数
试验将循环数设为 30 、33 、36、40 次 4 个梯度(图 6), 试验
结果表明 , 循环数为 36 ～ 40 次时 , PCR扩增效果最好 , PCR产
物为一条亮而清晰的条带 ,无非特异性条带 , 经过多次重复试
验 ,其稳定性好。故循环数最佳范围为 36 ～ 40次。
图 6　循环数对 ITS扩增效果的影响
Fig.6　The effect of the number of cycle on the amplification of ITS-PCR
M 为Marker П;泳道 1～ 4分别对应的循环数为 30 、33 、36、40次。
M is marker П;1～ 4:The number of cycle is 30 , 33 , 36 , 40 , respectively.
2.7　优化条件组合的 PCR扩增结果
随机选取 5 份材料(W01-9、W01-39、W01-83、W01-86
和W01-100),以优化条件组合对其进行 PCR扩增 , 每个处理
重复 3 次 , PCR 产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测 , 在约
800bp 处有一明亮的 DNA带(见图 7),与预期大小一致。表明
所建立的 PCR扩增优化条件可以满足蕺菜的 ITS 扩展的要
求。
图 7　ITS-PCR反应体系的结果
Fig.7　The result of Houttuynia Thunb ITS-PCR system
M 为Marker П;泳道 1～ 15分别对应的材料为 W01-9 、W01-39、W01
-83 、W01-86和 W01-100。
M ismarker П;1～ 15:The number of accession is W01-9 ,W01-39 ,W01-
83 ,W01-86和 W01-100 , respectively.
3　讨论
对 ITS 区的扩增条件的研究 , 在莲[ 7] 、珍珠菜[ 8] 、地黄
属[9] 、紫苏属[ 10]等也有报道 ,但已有的反应体系和扩增条件不
适合蕺菜 rDNA ITS 区。 PCR扩增反应中的变性 、复性 、延伸的
温度和时间 , 反应过程的循环次数 ,以及 PCR扩增条件中模板
DNA 量 、Taq 聚合酶量 、Mg2+浓度 、dNTP 浓度等均会影响 PCR
扩增结果 , 从而影响扩增产物重复性[11] 。因此 , 要保证蕺菜
rDNA ITS 扩增实验结果的稳定性 、重复性和可信性 , 必须针对
各自的仪器设备 、不同来源的试剂以及影响 PCR扩增的主要
因子进行适当地调整 、筛选和优化。本研究通过对各因素的
不同梯度比较 , 确定了蕺菜 rDNA ITS 区的PCR扩增最优条件:
即 25μL 反应体系中 , 模板 DNA 用量为 10ng , Mg2+浓度为
2.5mmol L、Taq 酶用量为 0.75U、dNTP 浓度为 100μmol L、引物
对浓度为 1.2μmol L。利用此反应体系的最适扩增程序为在
94℃下预变性 4min , 然后进行 36个循环(94℃变性 45s , 60℃退
火 50s , 72℃延伸 90s), 最后在 72℃延伸 8min。可得到预期大
小的 ITS 基因片段 , 经过多次重复 ,结果均一致 , 说明所建立的
反应体系和优化的扩增条件是适用于蕺菜 rDNA ITS 区的 PCR
扩增。
据 Baldwin B G等(1995)统计 ,被子植物核 rDNA 的 ITS 区
包括 5.8S rDNA 在内的总长度为 600～ 700bp ,其中 ITS1 和 ITS2
的长度比较保守均小于 300bp , 但核苷酸序列变化较大 , 可以
提供丰富的系统学信息[ 12] 。本试验对产自四川 、重庆的蕺菜
材料 rDNA ITS 区进行扩增 ,经过多次筛选扩增条件均可获得
清晰的 、单一条带 ,大小约 684bp(图 8)。回收条带并进行克隆
42　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 19(2)
测序 ,将测序结果与 Genebank 里蕺菜属材料 rDNA ITS 进行同
源性比对 ,得出其与 Genebank 中 Hsieh C 等报道的蕺菜 rDNA
ITS 序列有最大的相似性(99%)。目前在此方法上 , 我们已成
功克隆测序了 17 份蕺菜材料(含 1 份峨眉蕺菜)的整个 ITS 区
(包括 ITS1、5.8SrDNA 和 ITS2)序列共 108 条 , 均已在 GenBank
中登记注册(EU329190-EU329298)。
图 8　W01-9的 ITS序列
Fig.8　Alignment of ITS sequence from W01-9
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崔静 ,胡接力 ,张文露 ,王媛媛 ,李毅 ,黄爱龙＊(重庆医科大学病毒性肝炎研究所 ,感染性疾病分子生物学教育部重点实验室 ,重庆 400016)
摘要:目的:建立化学发光法检测体外 HBV复制水平的方法 , 研究其灵敏度和稳定性。方法:用 HBV DNA 重组质粒 pCH9 转
染到人肝癌细胞株 HepG2 和Huh7中 , 5d后收集细胞并抽提其HBV 复制中间体 DNA , 转印后以地高辛标记 HBV DNA为探针进行
杂交 , 用化学发光法检测杂交结果 , 同时进行探针灵敏度的检测。结果:转染后 HepG2 和 Huh7 细胞提取 HBV DNA 中检测出较
强的复制中间体的信号 , 分别为松散环状 DNA(rcDNA), 双链线性 DNA(dslDNA), 单链 DNA(ssDNA),探针检测的灵敏度可达到
1pg , 接近同位素法检测的灵敏度。整个实验重复 3 次获得同样结果。结论:成功建立了稳定的化学发光法检测体外 HBV复制
水平的方法。
关键词:HBV DNA;化学发光法;复制
中图分类号:R512.6+2　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2009)02-0044-03
Analysis of Hepatitis B Virus Replication in Vitro by
Chemiluminescent Detection Method
CUI Jing , HU Jie-li , ZHANG Wen-lu , WANG Yuan-yuan , LI Yi , HUANG Ai-long＊
(Institute for Viral Hepatitis , Key Laboratory Molecular Biology on Infectious Diseases ,
Ministry of Education , Chongqing Medical Universi ty , Chongqing 400016, China)
Abstract:Objective:To develop a chemiluminescent detection method for analysis of hepatitis V virus(HBV)replication level in vitro , and ob-
serve its stability and sensitivity.Method:HBV recombinant plasmid(pCH9)was transfected into human hepatoma cell lines HepG2 and Huh7.
Cells were harvested 5 days posttransfection and intracellular HBV replication intermediates were extracted.Southern blot assays for HBV replica-
tion intermediates were performed by digoxigenin-labeled probe and chemiluminescent detection.Result:High levels of HBV replication inter-
mediates DNA were detected by Southern blot in the HepG2 and Huh7 cell lines respectively.The digoxigenin-labeled probe showed a sensitivity
near to that of radiolabeled probe , detecting as little as 1 pg of HBV DNA.Conclusion:A stable chemiluminescent detection method for analysis
of HBV replication level in vitro is successfully established.
Key words:HBV;chemiluminescence;replication
收稿日期:2008-12-15;修回日期:2009-02-18
基金项目:国家自然科学基金项目资助(No.30600520)
作者简介:崔静(1982-),女 , 在读硕士 ,从事 HBV 临床病毒学研究;
＊通讯作者:黄爱龙(1964-),男 , 教授 ,博士生导师 ,研究方向:乙型
肝炎的分子病毒学和临床病毒学研究 , Tel:023-68486780 , Email:
ahuang1964@yahoo.com.cn。
　　由于乙型肝炎病毒(HBV)缺乏体外细胞培养系统 ,目前绝
大多数与HBV 相关的体外研究都采用转染 HBV DNA 重组质
粒到肝癌细胞系 , 如 HepG2 和 Huh7 细胞[ 1 , 2] 。由于这两种细
胞转染效率较低 ,只有应用 Southern Blot方法才能直观地检测
出HBV 复制中间体的类型和含量[ 3 , 4] , 从而反应 HBV 复制水
平。目前经典的方法是:用同位素标记探针检测 Southern Blot
结果 ,然后通过检测放射信号的强弱判断目的核苷酸的含
量[ 5 , 6] 。尽管同位素法的敏感性和特异性都较高 , 但存在许多
缺点 , 如半衰期短 、对人体和环境有较高的危害性 ,对实验设
备和人员均有较高的要求等 , 因此非同位素法的发展越来越
受到关注[ 7] 。另外 , 由于 HBV复制中间体 DNA 的抽提得到的
量很少 ,因此建立稳定的高灵敏非同位素法检测体系显得尤
为重要。我们用地高辛标记探针 ,以化学发光法检测 Southern
Blot杂交结果 , 建立了稳定的化学发光法检测体外 HBV 复制
水平的方法。
l　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　质粒和细胞
人肝癌细胞系 HepG2 细胞和 Huh7 细胞由本实验室保存。
HBV DNA 重组质粒 pCH9由西南医院兰林博士惠赠 , 该质粒含
1.1 倍 HBV 全基因组基因(ayw 亚型),并由 CMV 启动子起动
转录。
1.1.2　引物
F1073:5 -TACAAGCAAAACAGGCT-3 ;R803:5 -GTAA-
CAGCGGCATAAAG-3 ;F1654:5 -ATAAGAGGACTCTTGGA -
3 ;R2286:5 -GGAGTGCGAATCCACACT-3 , 由上海英俊生物
技术有限公司合成。
1.1.3　试剂
NP-40、DNaseⅠ 、Proteinase K、RNase A购自 Promega公司;
LipofectamineTM 2000 Reagent购自 Invitrogen 公司;化学发光检测
试剂盒(DIG Luminescent Detection Kit for Nucleic Acids)和地高辛
标记试剂 DIG-High Prime 购自 Roche公司;6 孔细胞培养板购
自 Corning公司;胎牛血清购自 Hyclone 公司;PrimeSTAR 购自
Takara公司 , 胶回收试剂盒购自 QIAGEN 公司 , 其他常规试剂
按《分子克隆实验指南》(3 版)配制。
1.1.4　仪器
Mastercyler PCR仪(德国 Eppendorf公司);DYY-6C电泳仪
(北京六一仪器厂);Bio-imaging system 凝胶成像系统(英国
Syngene公司);HZ-3211K 恒温振荡器(江苏省太仓市科技器
材厂)。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养 、转染
用含有 10%FBS MEM 培养基在 37℃、含 5% CO2 培养箱
中培养 HepG2 细胞 ,用含有 10%FBS DMEM 培养基在 37℃、含
5% CO2 培养箱中培养Huh7细胞 ,生长状态较好时以 1×105
孔接种细胞于 6 孔细胞培养板中 ,培养 16h , 分别转染 pCH9 质
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