全 文 ：桤木属宿主与弗兰克氏菌的共生关系研究
熊　智1 ,李　洁2 ,张成刚3
(1.西南林学院资源学院 ,云南 昆明 650224;2.云南大学教育部微生物资源重点实验室 ,
云南 昆明 650091;3.中国科学院沈阳应用生态研究所 ,辽宁 沈阳 110016)
摘要:用 RAPD-PCR方法对分布在云南省高黎贡山的尼泊尔桤木 , 分布在吉林长白山的色赤杨 、西伯利亚赤杨和东北赤杨
进行遗传多样性分析。结果发现分布在长白山的 3 种赤杨聚类关系较它们与尼泊尔桤木的关系更近 , 其中色赤杨和西伯
利亚赤杨有更近的聚类关系 ,与它们对应共生的 Frankia 菌居群亲缘关系表现相似的特征;高黎贡山的尼泊尔桤木遗传多
样性水平最高 ,其次是色赤杨和西伯利亚赤杨 , 东北赤杨最低。桤木属植物与对应共生的 Frankia 菌的遗传多样性水平也
一致。这些结果暗示着桤木属宿主植物和其 Frankia 菌共生物之间存在共进化关系。东北 3 种宿主植物与 Frank ia 菌之
间存在于种下基因型类群的共生搭配 ,表明共生关系的建立过程中可能存在基因型上的选择。 Alnus-Frankia 共生固氮体
系的建立可能是单起源的。
关键词:桤木属植物;Frankia;遗传多样性;共进化
中图分类号:Q943　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-7351(2008)01-0011-06
Correlations between host species of Alnus and endosymbiotic Frankia
XIONG Zhi1 , LI Jie2 , ZHANG Cheng-gang3
(1.School of Forestry Resources , Southwest Forestry College , Kunming , Yunnan 650224 , China ;
2.Key Laboratory for Microbial Resources of Education Ministry , Yunnan University , Kunming , Yunnan 650091 , China;
3.Institute of Applied Ecology , Chinese Academy of Sciences , Shenyang , Liaoling 110016 , China)
Abstract:Leaf samples of Alnus nepalensis were collected from Gao ligong Mountai·n , Yunnan P rovince , and samples of A.sibir-
ica , A .tinctoria and A .mandshurica were collected from Changbai Mountain , Jilin Province.The genetic diversity of Alnus
trees w as analyzed by RAPD-PCR.The dendrog ram of Alnus trees reflected the more genetic similarity among the populations oc-
cur ring in Nor th-east China than the popula tions of Alnus nepalensis.And A.sibirica and A .tinctoria had the closest relation-
ship.Their symbio tic Frankia strains presented the similar relationship with the host plants.The genetic diversity of A .nepalen-
sis was the highest , and the genetic diversity of A.sibirica and A.tinctoria were higher than that of A.mandshurica , while the
four populations of Frankia symbionts had the same series.Since the genetic pro ximity of hosts corresponded with Frank ia sym-
bionts , it w as suggested that co-evolution between the host plants with the microsymbionts Frankia strains have actual being , and
the evolutionary pattern may have some similarity.Different clusters of Frankia strains associating with different subgroups of host
plants suggested that the further genetic matching might be function in selectivity of this symbiotic association.And it is mo re likely
that the establishment of symbiotic relationship between Alnus plants and Frankia strains is single genesis.
Key words:Alnus plant;Frankia;genetic div ersity;co-evolution
　　弗兰克氏菌是一类能与 8科 24属近 200种非豆科植物共生结瘤固氮的放线菌。受 Frankia 侵染后
形成根瘤的植物被称作放线菌根瘤植物(熊智等 ,2003)。Frankia 菌与宿主植物之间的关系是近年来的
研究热点。了解它们之间的关系 ,有利于揭示其共生起源 ,及进化上的特征 ,也会对内生菌的研究带来一
定的启示。目前有关 Frankia 菌与宿主植物的关系研究多集中在科属的水平上 ,鲜有在宿主植物种水平
上以及种下水平的报道。
桦木科(Betulaceae)植物包括 6个属 ,分别为桤木属(Alnus)、桦木属(Betula)、鹅耳枥属(Carpinus)、
榛属(Corylus)、铁木属(Ostrya)和虎榛子属(Ostryopsis),桤木属是现存桦木科植物最原始的属(陈之端 ,
　收稿日期:2007-07-23
　基金项目:国家重点基础研究发展项目(001CB1089)
　作者简介:熊　智(1965-), 男 ,重庆人 , 西南林学院资源学院副教授 ,博士 , 从事微生物资源和多样性研究。
第 35 卷 第 1 期
2 0 0 8 年 3 月
福 建 林 业 科 技
Jour of Fujian Forestry Sci and Tech
Vol.35　No.1
Mar., 2 0 0 8
1994),也是其中唯一的放线菌根瘤植物 。中国是桤木属的起源和分化中心 ,该属植物在中国境内分布广
泛(路安民 ,1999;Chen et al., 1999)。本研究中 ,分别以分布在中国西南部云南省的高黎贡山和东北吉林
省长白山的桤木属植物样品为对象 。高黎贡山具有特殊的地质历史 ,独特的气候条件和多样化的生态和
微环境 ,动植物资源极为丰富(李恒等 , 2000)。长白山的气候 、土壤和植被等均具有明显的梯度变化 ,并且
该区域生物多样性丰富(Hao et al.,2002)。故而它们是进行 Alnus-Frank ia共生关系研究的理想对象 。
Varghese 等(2003)研究认为宿主植物与弗兰克氏菌之间存在共进化 ,而这种共进化似乎暗示着一种
基因对基因关系的存在 。本文中对 42 个植物样品进行了 RAPD分析(Random Amplified Polymorphic
DNA),它们分别为尼泊尔桤木(Alnus nepalensis)、西伯利亚赤杨(Alnus sibirica)、色赤杨(Alnus tinctori-
a)和东北赤杨(A.mandshurica)。同时结合已获得的对应根瘤内 Frank ia 共生物的 RFLP(Restriction
Fragment Length Polymo rphism , RFLP)和 REP(Repetitive Extragenic Palindromic)分析结果 ,在种的水平
以及种下水平上对宿主与 Frankia 菌共生关系进行探讨。
1　材料与方法
1.1　样品
分别在高黎贡山和长白山不同海拔采集共 42
个赤杨叶样品。各物种样品数目和采集地见表 1 。
叶片经 70%乙醇表面消毒后 ,用无菌水冲洗干净 ,
表 1　实验样品
地点 样品 样品数目 海拔/ m
高黎贡山 尼泊尔桤木 A.nepalensis 21 1310 ～ 2400
长白山 西伯利亚赤杨 A.sibirica 5 755 ～ 1699
色赤杨 A.tinctorica 7 748 ～ 1700
东北赤杨 A.mandshurica 9 1270 ～ 2034
干燥后保存在 4℃备用 。
1.2　样品总 DNA 的提取
取少量 4℃保存的植物叶片用液氮研磨成粉 ,将粉末转入 1.5 ml离心管中 ,加入 1 m l预热的 2×
CTAB提取液(2%CTAB , 100 mM Tris[ pH 8.0] , 20 mM EDTA[ pH 8.0] , 1.4 M NaCl ,2%PVP)1 ml ,
于 65℃温育 1 h。离心取上清液后 ,用等体积酚 、氯仿和异戊醇(25∶24∶1)抽提 2 次。取上层水相 ,加入
1/10体积 3 M 的乙酸钠和 2倍体积冰乙醇沉淀 DNA 。DNA沉淀用 70%乙醇洗涤 2 ～ 3次 ,干燥后用去离
子水溶解 ,储存在-20℃备用 。分别取 2 μL 进行琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量。
1.3　RAPD-PCR扩增
从 40个随机引物(上海博亚生物技术有限公司合成)中筛选了 6个扩增较稳定 ,重复性好 ,多态性较
好的引物 ,其编号为 Operon AG-01(5 -CTACGGCTTC-3 ),OperonAG-02(5 -CTGAGGTCCT -
3 ),Operon AG-04(5 -GGAGCGTACT -3 ),Operon AG-07(5 -CACAGACCTG-3 ), Operon AG
-10(5 -ACTGCCCGAC-3 ),Operon AG-12(5 -CTCCCAGGGT -3 )。
PCR扩增反应总体积为 20μL ,DNA模板约 10 ng ,Mg2+ 4 mmol·L-1 , dNTP 0.2 mmol·L-1 ,引物 1
μmol·L-1 , 10×PCR buffer 2 μL , Taq DNA 聚合酶 2.5 U(北京华美公司产品)。扩增反应在 Biometra 梯
度 PCR仪上进行 ,95℃预变性 5 min ,94℃变性 30 s ,33℃退火 1 min , 72℃延伸 1.5 min ,循环 45次 ,最后
在 72℃终延伸 10 min。每组反应都设有阴性对照 。
1.4　图谱分析
PCR产物用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测 ,胶片用 Labworks 4.6.00.0凝胶成像系统拍照 ,判读各条
带的分子量 ,并转化为二元性状编码矩阵 。利用 PopGene 1.31(Yeh et al., 1999)软件进行距离矩阵分析 ,
并计算 Nei s遗传多样性(h)以及 Shannon s遗传多样性指数(I)。利用 NTSYS-pc Version 2.1(Rohlf ,
2000)软件采用非加权配对算术平均法(unweighted pair g roupmethod w ith arithmetic averages , UPGMA)
进行聚类分析。
1.5　Frankia 菌与宿主植物的共生关系初步分析
进行各聚类分支 ,即依据基因差异区别的组之间的 Alnus-Frankia 搭配关系的明确 。针对二者的遗
传多样性指数的计算结果 ,以及相似程度分析彼此之间的关系。利用 MATLAB 统计分析软件初步进行
宿主基因型类群 、Frankia 菌基因型类群和海拔之间的相关性分析 。
·12· 福 建 林 业 科 技 第 35 卷
图 1　尼泊尔桤木 RAPD 指纹图谱
　左图为用引物 AG-1 扩增高黎贡山尼泊尔桤木的 RAPD
指纹图谱;右图为用引物 AG-2 扩增高黎贡山尼泊尔桤
木的 RAPD 指纹图谱;M 为宽范围的 DNA 分子标记(250
-15 000 bp)(宝生物)。
2　结果与分析
2.1　扩增结果检测
利用筛选出的 6个随机引物对各样品 DNA 进
行扩增 ,得到了重复性较好 ,稳定清晰的条带 ,部分
结果见图 1。
2.2　遗传相似性分析
根据 RAPD指纹分析 ,计算了宿主植物 4个居
群间的遗传相似度和遗传距离(表 2)。结果表明西
伯利亚赤杨和色赤杨的遗传相似性最高 ,而分布在
东北的 3个居群间的相似性比它们与尼泊尔桤木居
群的相似性要高 。聚类树状图也直观的反映了它们
之间的亲缘关系(图 2)。
　　代玉梅等通过对 nifD-ni fK 基因的 IGS 区域
的 PCR-RFLP 分析 ,对西伯利亚赤杨 、色赤杨 、东
北赤杨和尼泊尔桤木(样品同本文)的根瘤中共生
的 Frankia 菌居群的遗传多样性进行了研究(Dai
et al., 2005)。他们的研究表明侵染西伯利亚赤杨
和色赤杨的弗兰克氏菌有较近的亲缘关系 ,聚类存
在交叉;侵染东北赤杨 Frankia 菌的分支与侵染西
表 2　Nei s 无偏差遗传相似性指数(对角线以上)
和遗传距离(对角线以下)
群　体 东北赤杨 色赤杨 西伯利亚赤杨 尼泊尔桤木
东北赤杨 ＊＊＊＊ 0.9657 0.9500 0.9357
色赤杨 0.0349 ＊＊＊＊ 0.9718 0.9574
西伯利亚赤杨 0.0513 0.0286 ＊＊＊＊ 0.9447
尼泊尔桤木 0.0665 0.0436 0.0569 ＊＊＊＊
伯利亚赤杨和色赤杨的 Frank ia菌分支更近;同时也有 3个基因类群的侵染尼泊尔桤木的 Frankia 菌与
侵染西伯利亚赤杨和色赤杨的聚在一支 。结合上文中宿主植物遗传相似性分析结果比较发现 ,宿主植物
亲缘关系的远近与其对应 Frankia 菌的关系远近基本一致 。
图 2　东北和高黎贡山居群宿主植物的聚类图
As 01～ 05 表示西伯利亚赤杨 , At 01～ 07 表示色赤杨 , Am 01～ 09 表示东北赤杨 , An 01～ 21 表示尼泊尔桤木。
·13·第 1 期 熊　智 ,等:桤木属宿主与弗兰克氏菌的共生关系研究
2.3　遗传多样性比较
PPB , Nei s 遗传多样性指数和 Shannon s遗传多样性指数 3个参数的计算结果表明高黎贡山的尼
泊尔桤木有最大的值 ,即遗传多样性水平最高;西伯利亚赤杨和色赤杨居中;东北赤杨的遗传多样性水平
最低(见图 3左图)。
图 3　遗传多样性比较
左图为高黎贡山 、长白山宿主植物的遗传多样性比较;右图为相应 Frank ia 菌居群遗传多样性的比较
(Dai et al., 2005);PPB 为多态性;h 为 Nei遗传多样性指数;I 为 Shannon s 遗传多样性指数。
结合代玉梅等对高黎贡山 、长白山宿主植物根瘤内 Frankia 菌居群遗传多样性的研究(Dai et al.,
2005),由图 3的比较发现 ,宿主植物和其对应共生 Frankia 菌 ,各居群遗传多样性水平的高低表现一致 。
具体表现为高黎贡山的尼泊尔桤木及其根瘤内 Frankia 菌种群的遗传多样性水平最高;东北的西伯利亚
赤杨和色赤杨及其根瘤内 Frankia 菌种群的多样性水平居中;东北赤杨及其根瘤内 Frank ia 菌的遗传多
样性水平最低。结合 4种宿主植物不同的进化地位及其共生 Frankia 菌居群遗传多样性水平的差异 ,可
以认为 Frankia 菌居群遗传多样性水平与其宿主植物的进化地位密切相关 ,越古老的宿主植物拥有遗传
多样性水平越高的 Frankia菌种群 。
2.4　东北不同宿主植物与 Frankia 菌的共生特征分析
结合唐晓萌等(2004)对长白山 3种赤杨样品对应根瘤内 Frankia 共生菌的 REP 分析的结果 ,在图中
标出按基因差异分组的宿主植物和 Frankia 菌之间的搭配关系(见图 4)。从图 4可以看到 ,西伯利亚赤
杨和色赤杨的共生体系中 ,在相同海拔处存在部分混乱;东北赤杨共生体系中的 Frankia 基因型类群均单
独分支;同种宿主 ,相同海拔的 Frankia 菌基本聚在同一分支。同时可以看出同种宿主植物中的各亚组(即
种下不同的基因型类群)也对应着一些特定基因型类群的 Frankia菌 ,这也就是说这种宿主植物和 Frankia
菌彼此间的选择性体现在了基因型水平上。而且 ,
各不同基因型类群的 Frankia 菌的共生侵染能力
以及对宿主的专一性程度有差别。
共生频率的计算结果表明(表 3),东北赤杨
Frankia 菌居群的宿主专一性比西伯利亚赤杨和
色赤杨Frankia 菌更强 ,西伯利亚赤杨和色赤杨共
生体系的模式显得更贫乏 ,其中的交叉现象可能与
它们亲缘关系较近及进化地位相当有关 ,或是某些
环境因子的作用 。
利用 MATLAB 统计分析软件 ,对宿主植物 、
Frankia 菌基因型类群及海拔 3者彼此之间的相
关系数进行了计算(表 4)。结果显示 ,在共生体系
中宿主植物种的类别和 Frankia菌基因型类群间 、
海拔与宿主植物 、以及海拔与 Frankia 菌之间存在
　　表 3　东北不同宿主植物与不同基因型
类群弗兰克氏菌的共生频率 单位:%
宿主 弗兰克氏菌Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
东北赤杨 A.mandshurica 0 33.3 0 44.4 22.2
色赤杨 A.tinctoria 100 0 0 0 0
西伯利亚赤杨 A.sibirica 60 0 40 0 0
＊:Ⅰ Ⅱ Ⅲ ⅣⅤ表示在唐晓萌等的研究结果中 , 弗兰克氏
菌的分组情况(唐晓萌等 , 2004)。
表 4　3 因素相关系数矩阵
因　子 宿主植物 Frankia 类群 海　拔
宿主植物 1.0000 0.5723 0.5261
Frankia 类群 0.5723 1.0000 0.4790
海　拔 0.5261 0.4790 1.0000
·14· 福 建 林 业 科 技 第 35 卷
图 4　长白山宿主植物与 Frankia 菌共生搭配关系
左图为长白山 3 种赤杨根瘤内 Frankia REP-PCR 分析的聚类图;右图为长白山 3 种赤杨宿主植物的 RAPD-
PCR分析聚类图;As 01 ～ 05 表示西伯利亚赤杨 , At 01～ 07 表示色赤杨 , Am 01～ 09 表示东北赤杨。
较显著的正相关关系 。说明在确定的共生体系中 ,宿主植物与 Frankia基因型类群间有着较为密切的联
系。但仅依据此结果并不能确定哪个因素在共生关系建立中起决定性的作用。
3　讨论
本文对 4种宿主植物亲缘关系的分析得到了前人研究结论的支持。陈之端(1994)研究认为桤木属可
分为 4个组 ,包括蒙自桤木组(Sect.Clethropsis)、桤木组(Sect.Alnus)、单序组(Sect.C remastogyne)、桦桤
组(Sect.Alnobetula)。从进化上来看蒙自桤木组和单序组是最古老的组 ,其次是桤木组 ,桦桤组是分化时
期最近的组。从形态分析上认为西伯利亚赤杨和色赤杨都属于桤木组 ,故二者亲缘关系较近;尼泊尔桤木
属于蒙自桤木组 ,东北赤杨属于桦桤组(Dai et al., 2005)。此外 ,研究发现宿主植物亲缘关系的远近与其
对应 Frankia菌的关系远近基本一致 , Frankia 菌居群遗传多样性水平与其宿主植物的进化地位密切相
关 ,东北 3种宿主植物与 Frankia 菌在基因型水平上的共生特异性存在差异 ,由此推测宿主植物与
Frankia 菌之间存在共进化 ,而且它们在形成共生体系之后的进化模式可能相似 。
有学者在宿主属的水平上确定了宿主与 Frankia 菌之间存在牢固关系(Murry et al.,1997;Rouvier et
al.,1996)。本文研究还发现宿主植物与 Frankia 菌彼此间的选择性可能发生在基因水平上 ,并且表现出
了一些较明显的特异性 ,相关系数的计算结果也在一定程度上支持了这一结论。这种遗传上的匹配可能
对于共生关系的建立起重要作用。代玉梅等(2004)对高黎贡山尼泊尔桤木 Frank ia 菌 RFLP 分析中 ,也
发现侵染同种宿主植物的 Frankia 菌有不同长度的电泳片段 ,这似乎也暗示在种的水平上这种共生体系
中存在基因型类型上的识别。由此推测 ,基因对基因的识别可能是共生体系建立过程中的重要因素。
吴少惠等(2001)的研究发现东北地区的色赤杨和西伯利亚赤杨根瘤 Frankia 菌享有相同的 ARDAR
图谱;通过 RFLP 和 REP 的分析也发现色赤杨和西伯利亚赤杨 Frankia 菌有相似的图谱 ,并且尼泊尔桤
木的 Frankia 菌也有部分与前二者相似的图谱(Dai et al.,2005;唐晓萌等 ,2004)。我们对这些宿主植物
的遗传特征进行研究 ,也发现宿主植物色赤杨和西伯利亚赤杨亲缘关系较近 ,而进化分析的结论认为尼泊
·15·第 1 期 熊　智 ,等:桤木属宿主与弗兰克氏菌的共生关系研究
尔桤木是较它们更古老的种(陈之端 ,1994),其对应共生的 Frankia 菌也表现出丰富的遗传多样性 ,而且
其共生 Frankia 菌与色赤杨和西伯利亚赤杨共生Frankia 菌基因类群上存在交叉 。这就表明很有可能在
桤木属植物分化之前 ,它们的共同祖先已经与 Frankia 菌建立共生 ,随后分化的种则由于这种较为古老的
侵染 ,从而形成新的共生体系 。也就是说 Alnus-Frankia 共生固氮体系的建立是单起源的 ,而尼泊尔桤木
以及其共生 Frankia 居群因其进化地位古老 ,有可能成为这个共生体系中的祖先。熊智等(2006)研究认
为高黎贡山的 Frankia菌可能作为种储备库 ,为其它地区的宿主植物提供了祖先菌株 ,而且第四纪冰河时
期后 ,尼泊尔桤木及其共生 Frankia 菌逐渐演化或改造成新的物种 ,并扩散到其它地区 。然而 ,上升到宿
主植物科的水平上 ,这种共生固氮起源是单一的还是在被子植物分化后的多起源 ,还有待更多的论证。
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