全 文 ：农业生物技术科学
ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.24No.32008March
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鼠尾草属(Salvia)为唇形科(Labiatae)一、二年生以
及常绿的多年生草本植物、亚灌木和灌木，全世界有
1000多种，主要分布于热带或温带地区[1]。鼠尾草属
植物花色鲜艳丰富，可做花坛、花径、花境、林缘材料，
美化环境[2]；其中的撒尔维亚(S.oficinalis)在欧洲、美
洲已作为高钾低钠、低铅，钙、镁、铁含量丰富的无公
害芳香调味蔬菜食用[3]；而且该属大多数植物可以入
药 [4~6]。随着人类对自然资源开发利用方式的不断增
加，鼠尾草属植物已广泛应用于医药、食品、香料、化
妆品工业及观赏领域[7]，具有较高的经济价值和开发
前景。
鼠尾草属植物分布广泛，种类品种繁多，且为异
花授粉植物[5]，变异性大，使得该属植物遗传关系复
杂，其系统分类、品种鉴定及资源利用一直十分混乱。
国内外对鼠尾草属植物的研究主要集中在化学成分
方面，而在探索该属的遗传变异与在分子水平对其进
行分类则研究得相对较少。随机扩增多态性 DNA
(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)是 1990
基金项目：教育部“新世纪优秀人才支持计划”（NCET－04－0905），国家自然科学基金（30671454），高等学校全国百篇优秀博士学位论文作者专项基金
（200253）。
第一作者简介：侯艳霞（1981-），女，山西交城人，博士。通信地址：625014四川雅安 四川农业大学林学园艺学院。Tel：0835-2882293；E-mail：yx-
hou2007@163.com。
通讯作者：汤浩茹（1963-），男，重庆市人，教授，博士生导师，四川省学术技术带头人，主要从事果树遗传育种与生物技术研究。通信地址：625014四川
雅安 四川农业大学林学园艺学院。Tel：0835-2882515；E-mail：htang@sicau.edu.cn。
收稿日期：2008-01-15；修回日期：2008-01-28。
鼠尾草属植物基因组DNA提取及
RAPD反应条件优化
侯艳霞,汤浩茹,董晓莉,谢王乙子,陈 清
(四川农业大学林学园艺学院，雅安625014)
摘 要:以鼠尾草属植物叶片为材料,提取基因组DNA,并对RAPD反应条件进行了系统优化。结果表
明,采用核DNA法提取的DNA质量较高,适宜于RAPD分析;RAPD扩增最佳反应体系为:20μl反应
体系中,10×bufer2.0μl,模板 DNA20ng,Mg2+浓度 2.0mmol/L,引物浓度 0.6μmol/L,dNTPs浓度 0.2
mmol/L,Taq酶1.0U。扩增反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸
2min;40个循环;72℃后延伸10min,4℃保存。
关键词:鼠尾草属;DNA提取;RAPD;反应条件优化
中图分类号:Q81 文献标识码:A
DNAExtractionfromSalviaandOptimizationofRAPDReactionCondition
HouYanxia,TangHaoru,DongXiaoli,XieWangyizi,ChenQing
(ColegesofForestryandHorticulture,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014)
Abstract:UsedfreshleavesofSalviaasmaterials.ThemethodofgenomieDNAextractionandtheoptimiza-
tionofRAPDreactionconditionwerestudiedinSalvia.Theresultshowedthatthehigh-qualitygenomieDNA
wasobtainedbythenuclearDNAmethodandwassutiableforRAPDstudy.TheoptimalPCRsystemforRAPD
analysiswasasfolows:totalvolume20μl,2.0μl10×bufer,20ngtemplateDNA,2.0mmol/LMg2+,0.6μmol/L
Primer,0.2mmol/LdNTPs,TaqDNA1.0U.Theprogramofamplifyingreactionwasasfolows:Afterpre-dena-
turingat94℃for5min,undertheconditionofdenaturingat94℃for1min,annealingat36℃for1min,ex-
tensionat72℃for2min,amplifyingfor40cycles,extensionat72℃for10minatlast,stopat4℃.
Keywords:Salvia;DNAextraction;RAPD;Reactionconditionoptimization
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年Wilianms[8]和Welsh[9]建立起来的一种分子标记技
术，具有简单、快速和试验费用较低，不需预知研究对
象的基因组序列等优点，被广泛应用于生物多样性检
测、基因定位、遗传作图、QTL分析、标记辅助选择、种
间遗传分析及品种真实性检测等领域[10~11]。鼠尾草属
植物 RAPD研究较少，Khalil等[12]用RAPD技术分析
了3种鼠尾草属植物的遗传关系，郭宝林等[13]对丹参
主要居群的遗传关系进行了RAPD分析，田晔林等[14]
用RAPD分子标记技术分析了8个一串红品种（系）
DNA的多态性，但这些研究所用材料只限于一个或几
个种，所用的RAPD反应条件也都不同。而且RAPD
技术对反应条件比较敏感，重复性较差。因此，在进行
RAPD分析时，首先要摸清其在供试材料上的最佳反
应条件，建立起具有高度重复性的反应体系，以保证
RAPD结果的可靠性与重复性。本实验通过对鼠尾草
属植物基因组DNA的提取方法及RAPD反应条件的
优化，完善该属植物基因组DNA的RAPD研究，为进
一步对鼠尾草属植物遗传多样性、亲缘关系分析以及
系统学研究奠定实验基础。
1材料与方法
1.1材料和试剂
材料：本实验所用的25份鼠尾草属材料的序号、
物种名称、采集编号及来源列于表1（未标记田间材料
的都为组培苗）。其中，1～16号由美国国家植物种质
资源库(AmericanNationalPlantGermplasmSystem)提
供，凭证标本存于四川农业大学园艺植物生物技术研
究室；其余材料由四川省中江县科技局、西南交通大学
及四川农业大学提供。条件优化选取1、8、17和19号
四份材料，与2007年3月在四川农业大学园艺植物生
物技术研究室进行。
试剂：乙二胺四乙酸二钠 (ethylenediaminete-
traaceticacid，EDTA)、十六烷基三甲基溴化铵(cetyltri-
ethylammoniumbromide，CTAB)、氯化钠、无水乙醇、硼
酸、氯仿、异戊醇、醋酸钠、β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷
表1供试材料
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
物种名称
S.azureavar.grandiflore
S.azureavar.grandiflore
S.azureavar.grandiflore
S.azureavar.grandiflore
S.deserta
S.oficinalis
S.oficinalis
S.sclarea
S.sclarea
S.sclarea
S.sclarea
S.tesquicola
S.tesquicola
S.verbenaca
S.verticilata
S.viridis
S.miltiorhizaBge.cv.sativa
S.miltiorhizaBge.cv.foliolum
S.miltiorhizaBge.cv.silcestris
S.miltiorhizaBge.cv.sativa
S.miltiorhizaBge.cv.foliolum
S.miltiorhizaBge.cv.silcestris
S.miltiorhizaBge.cv.foliolum
S.miltiorhizaBge.cv.silcestris
S.splendens
编号
W617691
W617692
W617694
W617701
PI440647
Ames24592
W620659
PI212326
PI383839
W610103
W620660
PI440650
PI440651
PI420430
PI380930
PI383836
-
-
-
-
-
-
-
-
-
来源
UnitedStates,Missouri
UnitedStates,Kansas
UnitedStates,Kansas
UnitedStates,Iowa
Kazakhstan
Libya
Italy,Basilicata
Afghanistan
Yugoslavia
Kazakhstan
Italy,Basilicata
RussianFederation
RussianFederation,Stavro
Spain
Iran
Yugoslavia
四川中江(田间材料)
四川中江(田间材料)
四川中江(田间材料)
四川峨嵋(田间材料)
四川峨嵋(田间材料)
四川峨嵋(田间材料)
四川中江
四川中江
四川雅安(田间材料)
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酮(PVP)、抗坏血酸(Vc)等试剂为国产分析纯；脱氧核
苷三磷酸(dNTPs)和10bp随机引物购自北京塞百盛
公司；核糖核酸酶A溶液(RnaseA液)、TaqDNA聚合
酶(TaqDNApolymerase)和琼脂糖购自天根生化科技
（北京）有限公司。
1.2DNA提取
采用李志真等的核DNA法[15]，略作改进，提取鼠
尾草属植物基因组DNA。其提取步骤如下：(1)取0.5g
鼠尾草属植物叶片，在加了少许PVP(聚乙烯吡咯烷
酮)与Vc的研钵中，加液氮迅速研磨成粉末转入3个
1.5ml离心管中。(2)加入 600μl核分离缓冲液(200
mmol/LTris-HCl、50mmol/LEDTA、0.05mol/LNaCl)
和2%β-巯基乙醇，在0℃下放置10min。(3)6000
rpm离心10min(4℃)，弃上清液，收集沉淀。(4)在沉淀
中加入 65℃预热的 CTAB裂解液 (100mmol/L
Tris-HCl、20mmol/LEDTA、1.4mol/LNaCl、2%CTAB)
和2%β-巯基乙醇，65℃水浴1h，其间轻轻摇动4~6
次。(5)8000rpm离心10min(4℃)，吸上清液于另一
1.5ml离心管中。(6)加入等体积的氯仿:异戊醇(V:
V=24:1)，轻摇萃取10min，直到氯仿相溶液变色，8
000rpm离心10min(4℃)。(7)将上清液转入新的1.5
ml离心管中，重复(6)2～3次。(8)将上清液转入新的
1.5ml离心管中，加入 2/3体积经 -20℃预冷的异丙
醇，上下颠倒几次至白色絮状物产生(若无絮状沉淀产
生，则放入-20℃冰箱1h后取出，4℃下5000rpm离
心5min，收集沉淀)。(9)将白色絮状物挑出转入新的
1.5ml离心管中，用70%乙醇泡洗2～3次(洗涤其间
泡10～20min)，再用无水乙醇清洗一次，置于通风处
过夜风干。(10)待DNA完全干燥后，加适量TE溶解，
加入终浓度为10mg/ml的RNAase，37℃水浴1h，部
分样品用于检测DNA浓度、纯度和完整性，其余置于
-20℃冰箱保存备用。
1.3DNA质量检测
将提取的DNA样品适当稀释，在核酸蛋白质分
析仪上检测 260nm、280nm处的吸收值，OD260/OD280
及DNA的浓度；采用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，EB
染色，在凝胶成像系统下拍照检测DNA的降解程度
和RNA消化情况。
1.4RAPD-PCR初始反应体系及其优化条件
PCR扩增反应在 Eppendorf热循环仪上进行，初
始反应程序为：94℃预变性 5min，94℃变性 1min，
37℃退火1min，72℃延伸2min；35个循环；72℃后延
伸10min，4℃保存。初始反应体系（总体积20μl）：10×
bufer2.0μl，模板 DNA30ng，Mg2+2.5mmol/L，引物
0.6μmol/L，dNTPs混合液0.2mmol/L，Taq酶1.5U。
PCR反应条件优化，主要包括反应体系组成和热
循环状态。本试验在其它因子保持不变的情况下，按一
定梯度变化单一因子，筛选出最优条件，各因子浓度梯
度处理见表 2。优化体系所用引物为 G6（GTGCC-
TAACC）和V6（ACGCCCAGGT）。
2结果与讨论
2.1DNA提取分析
鼠尾草属植物叶片含有较多的酚类、多糖、精油等
物质，使DNA常受到严重污染，造成DNA沉淀物难
以溶解或DNA的降解，难以得到适用于RAPD的高
质量DNA。本试验采用核DNA法来提取鼠尾草属植
物基因组 DNA，25份鼠尾草属植物叶片提取得到的
DNA得率都较高，DNA颜色均为近白色，OD260/OD280
在1.8左右，表明DNA质量较高；其基因组DNA电泳
如图1所示，从图中可看出，除9号和19号点样孔有
较少的多糖残留及轻微拖尾外，其余样品的DNA电
泳条带都较整齐、清晰，说明提取的DNA样品纯度较
高，完整性较好，可用于RAPD扩增。
2.2反应成分对RAPD扩增的影响
有关RAPD体系优化在许多物种中均有报道，但不
同植物RAPD最佳反应体系的差别较大，甚至同一种植
表2RAPD反应条件的优化
实验因子
实验因子处理
1
10
1.0
0.2
0.10
0.5
34
45
30
2
20
1.5
0.4
0.15
1.0
35
60
35
3
30
2.0
0.6
0.20
1.5
36
90
40
4
40
2.5
0.8
0.25
2.0
37
120
45
5
50
3.0
1.0
0.30
2.5
38
-
-
DNA模板浓度 (ng)
Mg2+浓度(mmol/L)
引物浓度(μmol/L)
dNTPs浓度(mmol/L)
Taq酶浓度(U)
退火温度(℃)
退火时间(s)
循环次数 (cycles)
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物在不同的实验室做也有较大的差别。本试验主要分析
RAPD体系中的5种主要成分对PCR扩增的影响。
2.2.1DNA模板浓度对RAPD扩增的影响
模板DNA浓度对 RAPD扩增结果影响较小，一
般在10~100ng范围内均有较好的扩增，但含量过高
会出现非特异性扩增条带甚至抑制扩增，过低则得不
到所需的扩增产物[16~17]。本实验设置了10、20、30、40、
50ng5个DNA浓度梯度，比较了不同模板浓度对扩
增的影响。结果表明（图2）：10~40ng扩增出的带型基
本相同，扩增效率高，50ng时出现了非特异性带，在
PCR扩增中，常用的模板浓度为 20ng[17~19]，故本实验
以20ng为最终浓度。
2.2.2Mg2+浓度对RAPD扩增的影响
Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活剂[20]，对 PCR扩
增的特异性和产量有显著影响，而且在PCR反应中，
Mg2+还对引物与DNA模板的结合效率、模板与产物
的解链温度、产物的特异性和引物二聚体的形成有影
响，是一个非常重要的因子。本试验设了5个浓度梯
度，结果表明(图2)：在试验浓度范围内都能扩增，但
Mg2+浓度为1.0mmol/L时，条带很弱，仅产生一些小
的非特异性片断，稳定性较差；随着浓度的的增加，特
异性结合增强，扩增条带越来越清晰，在Mg2+浓度在
2.0~3.0mmol/L之间均能获得清晰稳定的条带，但在
重复性试验中发现，Mg2+浓度为 2.5mmol/L和 3.0
mmol/L时，条带稳定性不及2.0mmol/L的体系，且高
浓度的Mg2+会使引物的错配频率增加，影响扩增的
特异性。因此，本试验确定的 Mg2+浓度为 2.0
mmol/L。
图125份鼠尾草属植物DNA电泳图
2.2.3引物浓度对RAPD扩增的影响
引物浓度关系到扩增产物的质量，浓度过低，引物
与模板DNA接触机会降低，可能会造成多态性位点
的遗漏，不能进行有效扩增；随浓度的增加，带型逐
渐清晰稳定；但浓度过高时，可能会引发碱基错配，
还会导致引物二聚体的形成，并与靶序列竞争 DNA
聚合酶和底物 dNTPs，从而使靶序列的扩增量降低
[21]。试验所设 5个梯度的电泳结果显示(图 2)，浓度
为 0.2mmol/L和 0.4mmol/L时，扩增条带有却失，
而浓度为0.6mmol/L、0.8mmol/L和 1.0mmol/L时，
扩增结果基本一致，条带清晰且完整，其中，尤以 0.6
mmol/L时条带质量最好，故本试验采用此引物浓
度。
dNTPs浓度对RAPD扩增的影响
2.2.4dNTPs是PCR的原料,其用量不当将影响 PCR
扩增效果。
当dNTPs浓度过高时，会螯合大量的Mg2+，使实
际反应中的Mg2+浓度下降而影响聚合酶的活性，最终
图2不同反应成分对RAPD-PCR扩增的影响(引物G6)
M.Marker;泳道1~5.DNA(材料19)10、20、30、40、50ng;泳道6~10.Mg2+(材料8)1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mmol/L;泳道11~15.引物(材料17)
0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L;泳道16~20.dNTPs(材料1)0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/L;泳道21~25:Taq酶(材料8)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5U
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 1314 1516 17 1819 20 2122 2324 25
M 1 23 4 5 M 6 7 8 910M 1112131415 M1617181920M2122232425
4000
2200
1400
1000
600
400
200
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将导致扩增量减少，甚至整个反应失败；但过低的
dNTPs浓度，又会影响合成效率[22]。本试验结果显示
（图2），当dNTPs浓度为0.10mmol/L和0.15mmol/L
时，条带较弱；浓度为0.30mmol/L时，条带缺失严重，
只有 0.2和 0.25mmol/L的浓度适合鼠尾草属植物
RAPD反应，但 0.2mmol/L的浓度效果最好，故取
dNTPs浓度为0.2mmol/L为最佳。
2.2.5TaqDNA聚合酶浓度对RAPD扩增的影响
TaqDNA聚合酶是PCR反应中最为重要的因子，
其用量受到反应体积、酶活性、酶的耐热性及反应程序
等因素的制约。用量过低扩增反应不完全；而用量过高
时，不但提高成本，还会导致非特异性产物增加。本试
验设置了0.5U、1.0U、1.5U、2.0U、2.5U5个梯度，由
结果可见(图2)，浓度为0.5U时，扩增强度较弱，且条
带缺失；浓度为1.0U、1.5U、2.0U时扩增的带型和强
度都较好，但随着酶量的进一步增加，在浓度为2.5U
出现了非特异性扩增。从试验效果和节约费用的角度
考虑，经重复比较试验确定，最终选用TaqDNA聚合
酶的用量为1.0U，这与王凌晖等[23]对何首乌RAPD条
件优化的研究结果一致。
2.3反应程序对RAPD扩增的影响
根据上述各因子比较试验的结果，可以确定鼠尾
草属植物RAPD-PCR最佳反应体系，但反应程序中变
性、退火、延伸的温度与时间、循环的周期数也会影响
PCR反应结果。本试验主要分析了退火温度、退火时
间、循环次数的影响。
2.3.1退火温度对RAPD扩增的影响
不同材料对 RAPD-PCR反应中退火温度的要求
不同，但差异不大，一般在35～38℃之间。本试验分别
在34℃、35℃、36℃、37℃、38℃5种退火温度条件下
进行扩增（图 3），得到的带型相似，除了 34℃条带较
弱，其它温度下条带都清晰完整。这表明，35～38℃的
退火温度对鼠尾草属植物的RAPD-PCR反应都比较
合适。本试验选用36℃，因为退火温度较低，能保证引
物与模板的稳定配对，同时允许适当的错配，以扩大引
物在基因组DNA中配对的随机性。
2.3.2退火时间对RAPD扩增的影响
本试验对退火时间设置45、60、90和120s4个处
理（图3），发现各处理间扩增带型差异明显。较短时间
(45s)的谱带清晰度和数量不如较长时间的好；但时间
过长(120s)，不利于 TaqDNA聚合酶的活性，条带也
不完整，而且浪费时间。60s和90s时扩增带形清晰完
整，适合鼠尾草属植物RAPD-PCR扩增，为节约时间，
本试验选择60s为最佳。
2.3.3循环次数对RAPD扩增的影响
PCR反应循环次数影响RAPD扩增产物量。最适
循环次数主要取决于靶序列的初始浓度，循环次数太
少，反应不完全，不能获得充足的扩增产物；次数太多，
达到反应平衡后，以后的循环不会使产物量增加，反而
可能引起非特异性扩增[24]。本试验将循环次数设计为
30、35、40和45次4个水平（图3），发现当循环数为
30时，扩增条带模糊；循环数为45时，扩增条带较亮，
但循环次数增多，大小相近的条带区分不开，使条带却
失，如在碱基600～800bp之间，应该有两条带，当循
环数为45时，只表现为一条带。循环数为35和40时，
引物的扩增条带较多，带型清晰，主带明显，但35次循
环虽可达到要求，就谱带的强度和稳定性而言，应以
40次循环为佳。
2.3.4RAPD的扩增结果
采用优化后的 RAPD扩增体系和程序对鼠尾草
属的25份材料进行扩增，图4的扩增结果表明，该体
系在25份材料中均能扩增出清晰的带型，扩增出的条
图3不同反应程序对RAPD-PCR扩增的影响(材料17)
M.Marker;泳道1~5.退火温度(引物V6)34、35、36、37、38℃;泳道6~9.退火时间(引物V6)45、60、90、120S;泳道10~13.循环次数(引物G6)
30、35、40、45cycles
M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 M 10 11 12 13
4000
2200
1400
1000
600
400
200
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带较亮，多态性较好。
3小结
1.本试验采用核DNA法提取鼠尾草属植物基因组
DNA，该方法首先利用破壁和低速离心步骤，将细胞
核初制剂分离出来，可将细胞质中的多糖等干扰物质
先除去，减少了 DNA污染；而且，试验所用材料大多
为无菌的组培苗，叶片新鲜，积累的次生物质少，同时
又在提取液中加入抗氧化剂如PVP、β-巯基乙醇、Vc，
从而有效地避免了酚类物质氧化、蛋白质污染、糖类和
色素等物质干扰，提取的DNA质量较高。
2.通过对比优化试验，建立了重复性好，稳定的鼠
尾草属植物RAPD反应体系，即20μl反应体系中，
10×PCRBufer2.0μl，模板 DNA20ng，Mg2+2.0
mmol/L，引物0.6μmol/L，dNTPs混合液0.2mmol/L，
Taq酶1.0U。
3.鼠尾草属植物RAPD最佳反应程序为94℃预变
性5min，94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸2
min；40个循环；72℃后延伸10min，4℃保存。
参考文献
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4000
2200
1400
1000
600
400
200
bp
图4引物V6对供试材料的扩增结果
(M.Marker;1~25序号代表的材料编号同表1)
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