全 文 ：收稿日期: 2012 － 5 － 23; 修回日期: 2012 － 06 － 07
基金项目:贵阳市两湖一库典型地带植被恢复关键技术研究与示范［筑科农合同字 2010( 8 － 3) ］
作者简介:陈 业( 1985 － ) ，男，贵州毕节人，硕士研究生。研究方向:发育分子生物学。E － mail: chenye2133887@ 126． com
* 通讯作者:关 萍，博士，教授。E － mail: guanp508@ 163． com
兜兰属植物 ISSR － PCR反应体系的优化*
陈 业，张玉晶，李娅迪，沈文华，江 辉，关 萍*
( 贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)
摘 要:以兜兰为试材，用改进的 CTAB法提取总 DNA，采用正交试验设计，分析 Mg2 +浓度、dNTP浓度、引物浓度
和 Taq DNA聚合酶用量对 ISSR － PCR扩增的影响，并通过梯度 PCR确定最佳退火温度，最终建立兜兰 ISSR扩增
反应体系。最佳反应体系为: 25μL体系中，含 10 × PCR buffer 2． 5μL、1． 5 mmol / L Mg2 +、0． 15mmol / L dNTP、0. 6
μmol / L引物、1． 0 UTaq酶和 40 ng模板 DNA。反应程序为: 94℃ 5min，94℃ 30 s，56． 2℃ 45 s，72℃ 1min，共 40 个
循环; 72℃ 延伸 7 min。
关键词:兜兰属; ISSR － PCR;正交设计;优化
中图分类号: Q781 文献标识码: A 文章编号: 1008 － 0457( 2012) 04 － 0297 － 04
兜兰( Paphiopedilum) 又叫“拖鞋兰”、“仙履
兰”等，是兰科 ( Orchidaceae ) 兜兰属( Paphiopedi-
lum) 植物的统称。国家一级保护植物，具有极高的
观赏价值和经济价值，也是最奇特的观赏兰花［1 － 2］。
十几年来，由于人们对其过度的追逐而对野生资源
进行了毁灭性的采挖，造成野生兜兰的数量急剧减
少，不少种类已经到了灭绝的边缘［3］。现对兜兰属
植物的研究主要集中在种质资源及分布、保护生物
学、传粉生物学、细胞生物学、无菌播种和组织培养
等方面［4］，而关于分子系统方面的研究报道鲜见。
ISSR( Inter Simple Sequence Repeat，简单序列
重复间区) 分子标记是 Zietkiewicz 等［5］于 1994 年
提出的一种 DNA分子标记技术，为显性标记，并呈
孟德尔式遗传，其引物设计比 SSR 技术简单，又可
揭示比 RFLP、RAPD 和 SSR 更多的多态性，具有
DNA用量少、操作简单、快速灵敏、实验成本低等优
点［6］，已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定
位、遗传多样性、生物进化及分子生态学等方面的研
究［7］。本文对兜兰属植物 ISSR － PCR 反应体系进
行优化，旨在为兜兰属植物 ISSR分子指纹图谱的建
立及遗传多样性分析等工作奠定技术基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试材料 目前收集到中国兜兰属植物
23 个种，种植于贵州大学植物标本园。供试材料
名称及来源见表 1。
1． 1． 2 仪器与试剂 DYY － 4C 型电泳仪( 北京市
六一仪器厂) 、ZWF －2 型紫外透射分析仪( 上海金
达生化仪器厂) 、Eppendorf 离心机、Bio － Rad 梯度
PCR扩增仪、Bio － Rad 凝胶成像系统。2 × CTAB
提取液( 2% CTAB，2% PVP，100 mmol /L Tris － HCl
( pH8) ，8． 0 mmol /L EDTA，1． 4 mmol /L NaCl) 、β －
巯基乙醇、氯仿∶ 异戊醇( 24 ∶ 1 ) 、无水乙醇、Taq 聚
合酶( 2． 5 U /μL) 、反应缓冲液( 10 × PCR Buffer) 、
Mg2 + ( 25 mmol /L) 、dNTP( 2． 5 mmol /L) 。标准分子
量( Marker) 购自天根生化( 北京) 有限公司。所用
的引物系列参照加拿大哥伦比亚大学 UBC 公司公
布的第 9 套 ISSR 引物序列，由南京金斯瑞生物科
技有限公司合成。
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA 的提取 参照改进的 CTAB
法［8］。取新鲜幼嫩叶片 0． 5 g 置于灭菌预冷的研钵
中，加适量的液氮快速研磨至粉末，迅速分装至 2. 0
mL灭菌冷冻的离心管中;加入 700μL的预热的 2 ×
CTAB提取液，10 μL 的 β －巯基乙醇，充分混匀后，
于 65℃水浴 1 h，每 10min上下颠倒数次; 12000 rpm
离心 10 min;取上清液加等体积的氯仿∶异戊醇( 24∶
1) ，混匀后 12000 rpm离心10 min，重复步骤 2 次;取
上清液加入 2倍体积的冰冻无水乙醇，轻轻混匀，有
白色絮状沉淀生成，6000 rpm离心 2 min，弃水相留沉
山 地农业生物学报 31 ( 4 ) : 297 ～ 300，2012
Journal of Mountain Agriculture and Biology
DOI:10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2012.04.020
淀;加 70%乙醇清洗 3次，使沉淀自然风干;加适量 的 1 × TE缓冲液溶解沉淀，于 － 20℃下长期保存。
表 1 植物材料及来源
Tab． 1 The origin of the materials
编号 物种 拉丁文名 标本来源 编号 物种 拉丁文名 标本来源
1 带叶兜兰 P． hirsutissimum 贵州望谟 13 飘带兜兰 P． parishii 云南文山
2 杏黄兜兰 P． armeniacum 云南碧江 14 格力兜兰 P． gratrixianum 云南文山
3 硬叶兜兰 P． micranthum 贵州荔波 15 白花兜兰 P． emersonii 云南马关
4 紫毛兜兰 P． villosum 云南文山 16 彩云兜兰 P． wardii 云南麻栗坡
5 紫纹兜兰 P． purpuratum 云南六库 17 海伦兜兰 P． helenae 云南文山
6 文山兜兰 P． wenshanense 云南文山 18 红旗兜兰 P． charlesworthii 云南文山
7 长瓣兜兰 P． dianthum 贵州兴义 19 小叶兜兰 P． barbigerum 云南麻栗坡
8 麻栗坡兜兰 P． malipoense 广西隆林县 20 汉氏兜兰 P． hangianum 云南文山
9 巨瓣兜兰 P． bellatulum 广西河池市 21 德氏兜兰 P． delenatii 云南富宁
10 亨利兜兰 P． henryanum 云南文山 22 根茎兜兰 P． areeanum 云南思茅
11 同色兜兰 P． concolor 贵州兴义 23 白旗兜兰 P． spicerianum 云南思茅
12 天伦兜兰 P． tranlienianum 云南文山
1． 2． 2 基因组 DNA的检测 用 0． 8%的琼脂糖凝
胶于 5 V /cm电压下电泳 40 min 左右，检测基因组
DNA的完整性并拍照保存。
1． 2． 3 ISSR － PCR 正交试验设计 为确定最佳
的 ISSR － PCR 反应体系，以硬叶兜兰( P． micran-
thum) 基因组 DNA 为模板，经初步筛选以 UBC －
835( AGAGAGAGAGAGAGAGYC) 为本次试验的固
定引物，用 L9 ( 3
4 ) 正交试验设计对 Mg2 + 浓度、
dNTP浓度，引物浓度和 Taq DNA 聚合酶用量进行
4 因素 3 水平优化。ISSR 扩增体系的正交设计试
验见表 2。共 9 个处理，每个处理 2 次重复，共 18
管。反应体系总体积为 25 μL，每管中还含有 10 ×
PCR buffer 2． 5 μL，模板 DNA 40 ng，其他各成分按
照表 3 加样，最后用 ddH2O补足。
1． 2． 4 PCR 扩增 PCR 扩增反应在 Bio － Rad 梯
度 PCR 扩增仪上进行，反应程序为: 94℃ 5 min，
94℃ 30 s，56． 2℃ 45 s，72℃ 1 min; 共 40 个循环;
72℃ 7min，4℃保存。反应结束后，用 2． 0%的琼脂
糖凝胶电泳检测扩增产物并拍照保存。
表 2 PCR各因素水平及正交试验设计［L9 ( 3
4)］
Tab． 2 PCR factors-levels and orthogonal design［L9 ( 3
4)］
编号 Mg
2 +
( mmol /L)
dNTP
( mmol /L)
Primer
( μmol /L)
Taq
( U)
1 1． 0 0． 10 0． 2 1． 0
2 1． 0 0． 15 0． 4 1． 5
3 1． 0 0． 20 0． 6 2． 0
4 1． 5 0． 10 0． 4 2． 0
5 1． 5 0． 15 0． 6 1． 0
6 1． 5 0． 20 0． 2 1． 5
7 2． 0 0． 10 0． 6 1． 5
8 2． 0 0． 15 0． 2 2． 0
9 2． 0 0． 20 0． 4 1． 0
1． 2． 5 引物退火温度的确定 在确定最佳反应体
系的基础上，用 Bio － Rad 梯度 PCR 扩增仪对本次
试验所用引物的退火温度进行优化筛选。设定退
火温度为 50 ～ 60℃。扩增仪自动生成 8 个梯度，
即 60. 0、59． 3、58. 0、56. 2、54. 0、52． 1、50. 8、
50. 0℃，所得的 PCR产物用 2． 0%琼脂糖凝胶电泳
检测并拍照保存。
2 结果与分析
2． 1 基因组 DNA的提取及检测
采用改进的 CTAB 法提取兜兰叶片的基因组
DNA。用 0． 8%的琼脂糖凝胶电泳，在 Bio － Rad凝
胶成像系统下观察并拍照保存( 图 1) 。结果表明，
基因组 DNA呈现一条明亮清晰的条带，无拖尾和
降解。说明所提取的 DNA 样品完整性好，样品量
较大，效果较好。各个点样孔均无亮点出现，说明
DNA 纯度较高，无蛋白质和其他次生代谢物质的
污染。经检测，所提取的兜兰属植物基因组 DNA
符合后续试验的质量要求。
注: 1 ～ 8，处理编号同表 1
图 1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测
Fig． 1 The detection with DNA agarose gel electrophoresis
2． 2 ISSR － PCR正交试验设计
由图 2 可知，正交试验的 9 个处理组合中，除
第 1 组合外，其他组合的扩增结果都能获得一定数
892 山地农业生物学报 2012 年
量的条带，多数条带较为清晰，便于计数。但由于
参试因素浓度不同，各处理之间的扩增结果存在明
显的差异。
注: M为 Marker; 1 ～ 9，处理编号同表 2
图 2 正交设计 ISSR-PCR反应体系的扩增结果
Fig． 2 The amplified pattern of ISSR-PCR
as revealed by orthogonal design
第 6、8 组合扩增出的条带多态性很低，其原因
可能是引物浓度( 0． 2 μmol /L) 较低，影响了扩增片
段的产率，扩增条带数量相应减少，使得这两个组
合能得到清晰的谱带，但是谱带数不多; 第 4、7 组
合条带具有较丰富的多态性，但条带明亮度较暗，
可能是 dNTP 浓度 ( 0． 10 mmol /L) 较低，使反应无
法充分完成，导致扩增产物减少。第 7 组合背景有
弥散现象，可能与 Mg2 +浓度( 2． 0 mmol /L) 过高有
关。第 4 组合条带的明亮度很低;第 9 组合中可能
是过高的 dNTP( 0． 20 mmol /L) 浓度抑制了 Mg2 +的
作用，相应的减弱 Taq 聚合酶的活性，使原本 Taq
聚合酶浓度较低的反应体系更加无法充分完成反
应，导致扩增产物减少，所以条带明亮度低。第 2、
3 组合重复性不好，说明反应体系不稳定; 第 1 组
合几乎看不清楚条带，可能与 dNTP 浓度 ( 0． 10
mmol /L) 和引物浓度 ( 0． 2 μmol /L ) 均较低有关。
在 9 个处理组合中，第 5 组合的电泳结果呈现出的
较高的多态性，且条带比其他组合更清晰明亮，两
次重复的稳定性好，是本次试验的最佳组合。
2． 3 引物退火温度确定
在 PCR扩增中，不同物种、不同引物的最佳退
火温度不同。退火温度过低会有非特异性扩增，过
高会影响引物与模板 DNA 的结合而降低扩增效
率。如图 3 所示，退火温度为 60 ～ 58℃时 PCR 产
物丰度低，54 ～ 50℃时扩增特异性差，试验最终确
定引物 UBC －835 的最适退火温度为 56． 2℃。
2． 4 最佳反应体系验证
用引物 UBC － 835 对 23 种兜兰属植物进行
ISSR扩增，检测优化出的兜兰 ISSR － PCR 反应体
系及参数的可靠性和稳定性。如图 4 所示，扩增背
景清晰，谱带明亮，多样性丰富，稳定性较好，说明
所建立的 PCR扩增体系能够满足兜兰属植物 ISSR
扩增的要求。
注: M为 Marker; 1 ～ 9 依次为 60. 0、59． 3、58. 0、
56． 2、54. 0、52． 1、50． 8、50. 0℃
图 3 退火温度对 ISSR反应的影响
Fig． 3 The effect of annealing temperature
on ISSR amplification
注: M为 Marker，1 ～ 23，处理编号同表 1
图 4 不同兜兰品种的 PCR扩增结果
Fig． 4 Electrophoresis result of different
paphiopedilum cultivars
3 讨 论
ISSR是基于 PCR 反应的一种分子标记技术，
具有 DNA用量少、操作简单、快速灵敏、实验成本
低等优点，但其结果也会受到 Mg2 +浓度、dNTP 浓
度、引物浓度、TaqDNA 聚合酶用量和退火温度等
多种因素综合影响［9 － 10］。体系的变化会直接影响
ISSR分析的准确性和稳定性。近年来，正交设计
开始用于各种 PCR 反应体系的优化中，可在一次
实验中了解各因素之间的内在规律，较快地得到最
优的水平组合，是优化 ISSR － PCR 反应体系较为
理想的方法［11］。Mg2 + 是 TaqDNA 聚合酶的激活
剂，不仅影响 Taq 酶活性，还能与反应体系中的
dNTP、模板 DNA及引物结合，影响引物与模板的结
992第 4 期 陈 业，等:兜兰属植物 ISSR － PCR反应体系的优化
合效率、模板与引物的解链温度、产物的特异性及引
物二聚体的形成［12］。dNTP浓度对 PCR扩增条带的
数量及强弱有较大的影响。本试验中，第 4 组合的
dNTP浓度( 0． 10 mmol /L) 最低，扩增产物量减少，明
亮度降低。Mg2 +浓度对扩增结果也有重要的影响，
第 7、9组合中 Mg2 +浓度( 2． 0 mmol /L) 最高，扩增背
景有弥散现象，第 3 组合浓度( 1． 0 mmol /L) 最低，
特异性强，但条带强度弱，第 5 组合( 1． 5 mmol /L)
呈现出较高的多态性且条带清晰明亮。ISSR 扩增
反应除了受到Mg2 +浓度和 dNTP浓度的影响外，还
受到 TaqDNA聚合酶用量和引物浓度的影响。引
物浓度过高，易引起碱基错配和产生非特异性扩
增，形成引物二聚体，引物浓度过低，与 DNA 模板
结合位点少，扩增产量下降［13］。本研究中，第 1、6、
8 组合引物浓度最低( 0． 2 μmol /L) ，扩增出的条带
多态性很低。
本试验通过 ISSR － PCR 扩增体系的正交优
化，获得兜兰属植物最佳 ISSR － PCR 扩增反应体
系为:总体积 25 μL，10 × PCR buffer 2． 5 μL、Mg2 +
浓度 1． 5 mmol /L、dNTP 浓度 0． 15 mmol /L、引物浓
度 0． 6 μmol /L、Taq 酶用量为 1． 0 U、模板 DNA 40
ng。反应程序为: 94℃ 5 min，94℃ 30 s，56． 2℃
45 s，72℃ 1 min; 共 40 个循环; 72℃ 7 min，4℃保
存。利用此反应体系能够扩增出背景清晰，谱带明
亮，多态性丰富的条带，说明所建立的 ISSR － PCR
扩增体系能够满足兜兰属植物 ISSR扩增的要求。
参 考 文 献:
［1］ BRAEM G，CHIRON G． Paphiopedilum［M］． Paris: Tropicalia，1988．
［2］ CRIBB P． The Genus Paphiopedilum( Second Edition) ［M］． Borneo: National History Publications，1998: 22 － 30．
［3］ 刘仲健，张建勇，茹正忠，等． 兰科紫纹兜兰的保育生物学研究［J］． 生物多样性，2004，12( 5) : 509 － 516．
［4］ 龙 波，龙春林． 兜兰属植物及其研究现状［J］． 自然杂志，2006，28( 6) : 341 － 344．
［5］ ZIETKIEWICZ E，RAFSLSKI A，LABUDA D． Genome Fingerprinting by simple sequence repeat ( SSR) -nchored polymerase
chain reaction amplification［J］． Genomics，1994，20( 2) : 176 － 183．
［6］ 李牡丹，石 旭，张玉晶，等． 粗毛淫羊藿 ISSR － PCR体系的正交优化［J］． 山地农业生物报，2009，28( 6) : 501 － 504．
［7］ 王建波． ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用［J］． 遗传，2002，24( 5) : 613 － 616．
［8］ 张玉晶，李牡丹，石 旭，等．珙桐基因 DNA的提取及 ISSR-PCR体系的优化［J］．山地农业生物学报，2011，30( 3) : 211
－ 214．
［9］ LIU G F，DONG J Y，JIANG Y，et al． Analysis of genetic relationship in 12 species of Section Strobuswith ISSR markers［J］．
Journal of Forestry Research，2005，16( 3) : 213 － 215．
［10］ 白锦军，魏安智，王 佳，等． 仁用杏 ISSR分析体系的正交优化［J］． 分子植物育种，2009，7( 6) : 1 237 － 1 224．
［11］ 陈大霞，钱 敏，李隆云，等． 正交试验优化黄连 ISSR反应体系的研究［J］． 重庆中草药研究，2006，1( 2) : 4 － 7．
［12］ 王彦华，侯喜林，徐明宇． 正交设计优化不结球白菜 ISSR反应体系研究［J］． 西北植物学报，2004，24( 5) : 899 － 902．
［13］ BRUNO W S． High output genetic mapping of polyploids using PCR-Generated junkers［J］． Theor． Appl ． Genet，1993，
86: 105 － 112．
Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Paphiopedilum*
CHEN Ye，ZHANG Yu-jing，LI Ya-di，SHEN Wen-hua，JIANG Hui，GUAN Ping* ( College of Life Science，
Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China)
Abstract: The genomic DNA of Paphiopedilum was extracted with improved CTAB method，consequently，the
effects of Mg2 +，dNTP，and primer concentrations，as well as the usage of Taq DNA polymerase on ISSR-
PCR amplification were optimized using an orthogonal experimental design． The optimal anneal temperature of
primer were determined by gradient PCR． The 25 μL ISSR-PCR cocktail contained 2． 5 uL 10 × PCR buffer，
1． 5 mmol /L Mg2 +，0． 15mmol /L dNTP，0． 6 umol /L primer，1． 0 U Taq polymerase and 40 ng template DNA
gave the best amplification result． PCR procedures were described as follows: 94℃ for 5 min，followed by 40
cycles of denaturing at 94℃ for 30 s，annealing at 56． 2℃ for 45 s，and extending at 72℃ for 1 min，finally
an extension at 72℃ for 7 min．
Key words: Paphiopedilum; ISSR-PCR; Orthogonal design; Optimization
003 山地农业生物学报 2012 年