全 文 ：西北农业学报　２０１２，２１（８）：１５８－１６３
Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　Ｓｉｎｉｃａ
不同处理对柿属植物ＤＮＡ提取产率和品质的影响
＊
易庆平１，罗正荣２
（１．湖北省荆楚理工学院 生物工程学院，湖北荆门　４４８２００；２．华中农业大学，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉　４３００７０）
摘　要：基于ＣＴＡＢ法对鄂柿一号、前川次郎、君迁子３份材料进行ＤＮＡ提取纯化，探讨不同采样时期、不同
的纯化及沉淀方法对柿属植物ＤＮＡ产率和品质的影响。结果表明，不同时期采样对ＤＮＡ产率影响很大，随
叶片生长，ＤＮＡ产率不断下降，成熟叶片ＤＮＡ产率仅为幼嫩叶片的１６．７％～１９．４％；在苯酚氯仿法、高盐乙
醚法、ＣＴＡＢ沉淀法中以高盐乙醚法效果最好，可酶切，能有效去除多糖污染，产率较高；４种沉淀方法中，高
浓度的盐溶液有助于去除多糖、多酚等杂质，相比单纯的乙醇或异丙醇沉淀可获得更高品质的ＤＮＡ。另外，
不同材料间提取ＤＮＡ难度存在较大差异。
关键词：柿属植物；ＤＮＡ提取纯化；优化
中图分类号：Ｑ５５５　　　　文献标志码：Ａ　　　　　文章编号：１００４－１３８９（２０１２）０８－０１５８－０６
Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｏｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ　ｓｐｐ
ＹＩ　Ｑｉｎｇｐｉｎｇ１　ａｎｄ　ＬＵＯ　Ｚｈｅｎｇｒｏｎｇ２
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｉｎｇｃｈｕ　Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｎｇｍｅｎ　Ｈｕｂｅｉ　４４８２００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ
Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００７０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｍａｎｙ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｓ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ
ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐｏｌｙｐｈｏｎｅｓ，ｅｔｃ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＣＴＡＢ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，ｓｏｍｅ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｍｐｌｉｎｇ，ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔｏ　ｐｒｅｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ
ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｏｆ　Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ　ｓｐｐ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ａｓ　ｔｈｅ　ｔｉｓｓｕｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ，ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｅｎｄｅｒ　ｓｈｏｏｔｓ，ｔｈｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ
ｍａｔｕｒｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｗａｓ　１６．７％－１８．４％．Ａｍｏｎｇ　ｔｈｒｅｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｓａｌｔ／ｗａｔｅｒ－ｓａｔｕｒａｔｅｄ
ｅｔｈｅｒ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ　ｅａｓｉｌｙ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｙｉｅｌｄ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｄｄ　ｈｉｇｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｓａｌｔ　ｂｅｆｏｒｅ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｉｓ　ｈｅｌｐｆｕｌ　ｔｏ　ｒｅｍｏｖｅ　ｔｈｅ　ｉｍｐｕｒｉｔｙ，ｃｏｕｌｄ　ｇａｉｎ　ｈｉｇｈｅｒ－ｑｕａｌｉｔｙ　ＤＮＡ．
Ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｏｒｍ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｄｉｆｆｅｒｓ　ｍｕｃｈ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ　ｓｐｐ；ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｏｐｔｉｍｉｚｅ
　　由于高等植物组织的特异性和组分的复杂
性，不同来源的植物ＤＮＡ提取方法有很大的不
同。柿是一种多年生木本果树，其叶片和其他组
织中富含大量的多糖和单宁、多酚、类萜烯等多种
初生次生代谢产物，极大地影响ＤＮＡ提取的品
质，给下游工作带来不便。目前，关于植物ＤＮＡ
提取纯化的研究主要集中在 ＣＴＡＢ法［１－２］、ＳＤＳ
法［３］、高盐低ｐＨ 法［４］等几种方法的比较和改
良［５－６］，很少有详细定量的分析。本研究在前人研
究的基础上，探讨柿属植物不同采样时期、不同的
纯化及沉淀方法对ＤＮＡ产率和品质的影响，并
讨论去除多糖、多酚等杂质的方法，以期为植物
ＤＮＡ种质保存、分子生物学下游操作等提供技术
支持。
＊ 收稿日期：２０１１－１０－１４　　修回日期：２０１２－０５－０９
基金项目：国家自然科学基金（３０９００９７５）；高等学校博士学科点专项科研基金（２０１１０１４６１１００１８）。
第一作者：易庆平，男，硕士，讲师，研究方向为植物生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｍｙｉｑｉｎｇｐｉｎｇ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者：罗正荣，教授，研究方向为种质资源学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｏｚｈｒ＠ｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１　材料与方法
１．１　材 料
供试材料为君迁子、鄂柿一号、前川次郎
（表１），均采自华中农业大学标本园柿圃。取不
同发育时期无病虫叶片，液氮速冻后于－７０℃冰
箱保存，备用。
１．２　方 法
１．２．１　ＣＴＡＢ法粗提取ＤＮＡ　称取３～５ｇ样
品，加入０．５ｇ可溶性ＰＶＰ，于液氮快速研磨至细
粉状，转入预冷的５０ｍＬ离心管。加入２０ｍＬ预
热提取缓冲液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ　８．０，
１．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　８．０，
φ＝５％β－巯 基 乙 醇，ｗ ＝２％ＣＴＡＢ，ｗ ＝５％
ＰＶＰ），混匀，６５℃水浴９０ｍｉｎ，不时摇匀，取出离
心管，冷却至室温，加入等体积氯仿和异戊醇
［Ｖ（氯仿）∶Ｖ（异戊醇）＝２４∶１］，轻轻颠倒混匀，
２５℃、８　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。离心取上清液
转入另一５０ｍＬ离心管，加入与上清液等体积的
氯仿和异戊醇［Ｖ（氯仿）∶Ｖ（异戊醇）＝２４∶１］，
轻轻颠倒混匀１５ｍｉｎ，８　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；
取上清加等体积异丙醇过夜沉淀，φ＝７０％乙醇
漂洗２～３次、干燥，加 ３～４ ｍＬＴＥ 溶液 （１０
ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ＝８．０）
溶解即为ＤＮＡ粗提液。
１．２．２　不同 ＤＮＡ 纯化方法　从粗提液中取
０．５ｍＬ　ＤＮＡ溶液分装至２ｍＬ离心管，采用不
同的ＤＮＡ纯化方法进行纯化。
高盐乙醚法（参照文献［７］的方法）：加入等体
积的苯酚、氯仿和异戊醇［Ｖ（苯酚）∶Ｖ（氯仿）∶
Ｖ（异戊醇）＝２５∶２４∶１］，轻轻颠倒混匀１０～１５
ｍｉｎ，１０　０００ｒ／ｍｉｎ离心１２ｍｉｎ，取上清液加入１／２
体积５．０ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＣｌ和等体积水饱和乙醚，
充分混匀１５ｍｉｎ，１０　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。弃上
层乙醚，用２０μＬ枪头挡住离心管管口内侧，用力
下压枪头，使枪头和管壁间形成一狭缝，让下清液
从缝中流入另一２ｍＬ离心管中，加入等体积异
丙醇沉淀，φ＝７０％乙醇漂洗、晾干，２００μＬ　ＴＥ
溶解。
苯酚氯仿法：加入等体积的苯酚、氯仿和异戊
醇［Ｖ（苯酚）∶Ｖ（氯仿）∶Ｖ（异戊醇）＝２５∶２４∶
１］，轻轻颠倒混匀１０～１５ｍｉｎ，８　０００ｒ／ｍｉｎ离心
１２ｍｉｎ，取上清液转入另一离心管，加入等体积氯
仿和异戊醇［Ｖ（氯仿）∶Ｖ（异戊醇）＝２４∶１］，轻
轻颠倒混匀１０～１５ｍｉｎ，８　０００ｒ／ｍｉｎ离心１２
ｍｉｎ，取上清液加入等体积异丙醇沉淀，φ＝７０％
乙醇漂洗、晾干，２００μＬ　ＴＥ溶解。
ＣＴＡＢ沉淀法：加入１／１０体积的６５ ℃的
ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ（含０．７ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）溶液，颠倒混
匀，加入等体积氯仿和异戊醇［Ｖ（氯仿）∶Ｖ（异戊
醇）＝２４ ∶１］，轻轻颠倒混匀 １０～１５ ｍｉｎ，
１０　０００ｒ／ｍｉｎ离心１２ｍｉｎ，取上清液加入等体积
的ＣＴＡＢ沉淀液，颠倒混匀，去上清，用高盐 ＴＥ
缓冲液重悬沉淀于６５℃保温３０ｍｉｎ，重复上述
步骤，直到所有或大部分沉淀溶解，加入等体积异
丙醇沉淀，φ＝７０％乙醇漂洗、晾干，２００μＬ　ＴＥ溶
液溶解。
１．２．３　不同沉淀方法　对常规ＣＴＡＢ法－苯酚
氯仿法纯化得到的上清液用４种沉淀方法处理。
沉淀方法１：加０．２５体积的无水乙醇和０．１１
体积５ｍｏｌ／Ｌ醋酸钾，离心，上清液加预冷的２倍
体积乙醇沉淀；沉淀方法 ２：加 １／２ 体 积 的
５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，混匀，然后加等体积－２０℃异丙
醇沉淀；沉淀方法３：加等体积异丙醇沉淀；沉淀
方法４：加２倍体积乙醇沉淀（含１／１０体积醋
酸钾）。
１．３　ＤＮＡ品质检测
１．３．１　紫外吸收与琼脂糖凝胶电泳　对 ＤＮＡ
样品作适当稀释后，采用紫外分光光度计测定
ＤＮＡ在波长２６０ｎｍ 与２８０ｎｍ 处的吸光度，根
据 ＯＤ２６０／ＯＤ２８０判断 ＤＮＡ 的纯度，Ａ２６０／Ａ２８０为
１．７～１．９、Ａ２６０／Ａ２３０≥２．０时ＤＮＡ品质好，含杂
质少。并通过ＯＤ２６０计算出ＤＮＡ产量。
采用８ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶［含０．５ｍｇ／Ｌ溴化
乙锭（ＥＢ）］电泳检测母液ＤＮＡ分子大小及降解
程度。
表１　所用材料
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
样品名称
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎａｍｅ
学名
Ｌａｔｉｎ　ｎａｍｅ
染色体数目
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｎｕｍｂｅｒ
类型
Ｔｙｐｅ
原产地
Ｏｒｉｇｉｎ
君迁子 Ｄａｔｅ　ｐｌｕｍ　 Ｄ．Ｌｏｔｕｓ　Ｌ　 ２　Ｎ＝２ｘ＝３０ 中国Ｃｈｉｎａ
鄂柿一号Ｅｓｈｉ　Ｎｏ．１　 Ｄ．ｋａｋｉ　Ｔｈｕｎｂ　 ２　Ｎ＝６ｘ＝９０ 完全甜柿ＰＣＮＡ 中国Ｃｈｉｎａ
前川次朗 Ｍａｅｋａｗａ－Ｊｉｒｏｕ　 Ｄ．ｋａｋｉ　Ｔｈｕｎｂ　 ２　Ｎ＝６ｘ＝９０ 完全甜柿ＰＣＮＡ 日本Ｊａｐａｎ
·９５１·８期　　　　　　　　　　易庆平等：不同处理对柿属植物ＤＮＡ提取产率和品质的影响
１．３．２　ＰＣＲ扩增　在ＰＴＣ－１００型ＰＣＲ仪上进
行随机引物 ＲＡＰＤ扩增和ＳＳＲ［８］特异性扩增。
其中ＲＡＰＤ引物序列为Ｓ６：５′－ＴＧＣＴＣＴＧＣＣＣ－
３′，反应组分包括：模板ＤＮＡ　３０ｎｇ，Ｂｕｆｆｅｒ×１，
Ｍｇ２＋１．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ　０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ
ＤＮＡ酶１．２５Ｕ，引物０．３μｍｏｌ／Ｌ，总体积为
２５μＬ。ＳＳＲ引物序列为５′－ＣＡＴＣＴＡＣＴＧＣＧＴ－
ＧＣＴＴＧＴＧＴ－３′／５′－ＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＡＴＴ－
ＧＣＴＣ－３′，反应组分包括：模板ＤＮＡ　３０ｎｇ，Ｂｕｆｆ－
ｅｒ×１，Ｍｇ２＋ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ　０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，
Ｔａｑ　ＤＮＡ酶１Ｕ，引物０．３μｍｏｌ／Ｌ，反应总体积为
２０μＬ。扩增产物用 １５ｇ／Ｌ 琼脂糖凝胶（含
０．５ｍｇ／Ｌ　ＥＢ）进行电泳，用ＳＹＮＧＥＮＥ凝胶成
像系统观察。
１．３．３　限制性酶切　向一定量的ＤＮＡ 中加入
限制性内切酶 ＨｉｎｄⅢ或ＥｃｏＲⅠ至４～５Ｕ／μｇ
ＤＮＡ，３７℃消化过夜，用０．５×ＴＢＥ、８ｇ／Ｌ琼脂
糖凝胶、１．５Ｖ／ｃｍ电泳４ｈ进行检测。
２　结果与分析
２．１　同一植物不同材料ＤＮＡ提取纯化的比较
不同材料之间所含的化学物质的种类和多少
不同，导致ＤＮＡ提取的难度不同，所得的ＤＮＡ
产量和品质存在较大的差异。“君迁子”为２倍体
野生近源种，叶片被灰色细毛，组织中多酚多糖含
量高，在研磨叶片时极易氧化变褐，所得ＤＮＡ品
质略差、产率低。“前川次郎”的成熟叶片常出现
块状褐斑，造成ＤＮＡ提取不便。在实际操作中，
ＤＮＡ提取难易程度依次为：君迁子＞前川次郎＞
鄂柿一号。
２．２　不同采样时期对ＤＮＡ产率的影响
对在４月６日、４月１３日、４月２０日、５月８
日、５月１８日、５月２６日、６月６日７个不同采样
时期的“鄂柿一号”叶片进行ＤＮＡ提取。随着叶
片发育时期的增长，ＤＮＡ产率不断下降，以幼嫩
组织所提取的ＤＮＡ产率和品质较高，成熟叶片
中ＤＮＡ产率仅为幼嫩叶片的１６．７％～１９．４％
（图１）。原因在于幼嫩组织处于生长旺盛期，同
等质量的叶片所含细胞数量多，ＤＮＡ含量较高且
代谢产物低。随着叶片的生长，光合作用产生的
代谢产物多糖和单宁、多酚、类萜烯等积累，干扰
ＤＮＡ提取，产率降低。
２．３　不同纯化方法对ＤＮＡ产率和品质的影响
不同纯化方法的 ＤＮＡ 产率存在一定的差
异，在去除杂质能力、异丙醇沉淀效果、ＴＥ溶解
情况、ＤＮＡ产量及外观等方面也有较大的差异
（表２）。在品质上以高盐乙醚法纯化的效果最
好，能够有效地去除多糖污染，得到的ＤＮＡ颜色
纯净、易溶于ＴＥ溶液，产率较苯酚氯仿法略低。
苯酚氯仿法去除多糖能力较差，常产生携带多糖
的凝胶状透明沉淀，这种含有多糖的ＤＮＡ 沉淀
难溶于 ＴＥ，含量高时影响限制性酶切。ＣＴＡＢ
沉淀法利用差异性沉淀多糖的原理，但在沉淀多
糖的同时会损失一部分ＤＮＡ。因此，在用ＣＴＡＢ
法进行植物ＤＮＡ提取时，用高盐水饱和乙醚法
纯化最为合适，但是高盐乙醚法对操作者要求较
高，不熟练者易降低产量。
２．４　不同沉淀方法对ＤＮＡ产率和品质的影响
用常规ＣＴＡＢ提取法（苯酚氯仿法纯化）对
“前川次郎”、“君迁子”叶片提取纯化，再对上清液
用４种方法进行沉淀（表３）。结果表明，方法２
在上清液中加入高浓度的 ＮａＣｌ溶液，在高盐缓
冲条件下异丙醇或乙醇优先沉淀ＤＮＡ，能有效去
除糖、多酚等杂质。而方法１中用低浓度的乙醇
图１　甜柿“鄂柿一号”品种不同采样时期ＤＮＡ产率比较
Ｆｉｇ．１　ＤＮＡ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ　ｐｅｒｉｏｄｓ　ｉｎ　ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ　ｃｕｌｔｉｖａｒ“Ｅｓｈｉ　Ｎｏ．１”
·０６１· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１卷
和醋酸钾来沉淀多糖，再用乙醇沉淀ＤＮＡ虽能
去除部分多糖，但会损失ＤＮＡ产量。异丙醇沉
淀的产率略高于乙醇。４种沉淀方法中，高浓度
的盐溶液有助于去除多糖、多酚等杂质，相比单纯
的乙醇或异丙醇沉淀获得更高品质的ＤＮＡ。这
与王龙龙等［９］在传统 ＣＴＡＢ法基础上对花生
ＤＮＡ作５种沉淀方法改良和何雪娇等［１０］应用改
良ＣＴＡＢ法提取野牡丹科７种植物沉淀时加入
０．６倍体积预冷异丙醇、１／２倍体积５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ、２倍体积无水乙醇时的结果类似。
２．５　总 ＤＮＡ电泳检测及ＥｃｏＲⅠ限制性酶切
结果
３种纯化方法得到２１份鄂柿一号总基因组
ＤＮＡ，在８ｇ／Ｌ的凝胶电泳上对其进行检测。图
２表明，ＤＮＡ品质良好，点样口少杂质，电泳条带
集中、不拖尾，分子大小约２０ｋｂ。高盐乙醚法和
ＣＴＡＢ沉淀法纯化的ＤＮＡ能够较好地用于限制
性酶切，呈弥散状。而苯酚氯仿法纯化的 ＤＮＡ
酶切不完全，点样孔含较多杂质，但也能够进行
ＰＣＲ扩增。
２．６　ＤＮＡ　ＰＣＲ扩增结果
用ＲＡＰＤ引物和ＳＳＲ引物对４种沉淀方法
所获总基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，结果见图３
和图４，均获得清晰的扩增图谱，扩增效果良好，
可见ＰＣＲ反应对 ＤＮＡ品质要求不高。对于柿
属植物而言，应用ＣＴＡＢ法初步提取的ＤＮＡ都
能用于品质要求不高的ＰＣＲ反应，进一步纯化后
扩增图谱效果更佳。
３　讨 论
３．１　影响植物ＤＮＡ提取产率和品质的因素
不同物种、品种甚至同一植物不同组织、不同
发育时期之间ＤＮＡ及代谢产物的含量存在很大
的差异。植物组织本身特性如生长环境、倍性水
平、生长期、基因表达水平等影响ＤＮＡ提取纯化
的难易和产率。由于ＤＮＡ提取步骤较为复杂、
耗时较长，不同采样时期、储藏方法、ＤＮＡ提取纯
化方法等操作细节也会对ＤＮＡ提取造成很大的
影响。不同研究目的对ＤＮＡ 的纯度和产量要求
不同。以ＰＣＲ为基础的遗传分析，要求ＤＮＡ的
量能使用１００次以上［１１］；在品质上，酶切反应要
求较高，而ＰＣＲ扩增要求相对较低。有些简化
的ＤＮＡ提取方法甚至不经过纯化直接用于ＰＣＲ
扩增［１２］，但是未纯化或多糖多酚等杂质含量较多
的ＤＮＡ不能用于酶切。
表２　不同方法纯化“鄂柿一号”ＤＮＡ的效果比较
Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ“Ｅｓｈｉ　Ｎｏ．１”
ＤＮＡ纯化方法
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ
ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
去除杂质能力
Ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆ
ｉｍｐｕｒｉｔｙ
沉淀效果
Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
ＴＥ溶解情况
Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ
ｉｎ　ＴＥ
ＤＮＡ产量及外观
ＤＮＡ　ｙｉｅｌｄ
ａｎｄ　ａｐｐｅａｒａｎｃｅ
苯酚氯仿法
Ｐｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ
有效去除蛋白质，去多糖能力差
Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐｏｏｒ
ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ
冻胶团状
Ｊｅｌｙ　ｇｌｕｅ　ｐａｓｔｅ
较难溶
Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ
ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ
产率高，透明、白色沉淀
Ｈｉｇｈ　ｙｉｅｌｄ，ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ，
ｗｈｉｔｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
高盐乙醚法
Ｈｉｇｈ　ｓａｌｔ／Ｗａｔｅｒ－ｓａｔｕｒａｔ－
ｅｄ　ｅｔｈｅｒ
有效去除多糖、蛋白质杂质
Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，
ｐｒｏｔｅｉｎ
纤维状
Ｆｉｂｒｏｕｓ
易溶
Ｅａｓｉｌｙ　ｓｏｌｕｂｌｅ
产率较高，纯白色沉淀
Ｈｉｇｈ　ｙｉｅｌｄ，ｐｕｒｅ　ｗｈｉｔｅ
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ
ＣＴＡＢ沉淀法
ＣＴＡＢ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
差异性沉淀多糖，会损失部分ＤＮＡ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃ－
ｃｈａｒｉｄｅ，ｌｏｓｓ　ｓｏｍｅ　ＤＮＡ
团状、絮状
Ｃｌｕｓｔｅｒ，ｆｌｏｃｃｕ－
ｌｅｎｔ
较易溶
Ｓｏｌｕｂｌｅ
产率低，白色沉淀
Ｌｏｗ　ｙｉｅｌｄ，ｗｈｉｔｅ　ｐｒｅｃｉｐｉ－
ｔａｔｅ
表３　不同沉淀方法下“前川次郎”、“君迁子”的ＤＮＡ品质和产率
Ｔａｂｌｅ　３　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｙｉｅｌｄ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＤＮＡ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ“Ｄａｔｅ　ｐｌｕｍ”ａｎｄ“Ｍａｅｋａｗａ－Ｊｉｒｏｕ”
材料
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎａｍｅ
沉淀方法
Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ Ａ２６０
／Ａ２８０ Ａ２６０ Ａ２８０ Ａ２３０ ＤＮＡ
产率／（μｇ／ｇ）
ＤＮＡ　ｙｉｅｌｄ
前川次朗 １　 １．８１６　６　 ０．２８０　３　 ０．１５４　３　 ０．１４９　０　 ３３７．４７
Ｍａｅｋａｗａ－Ｊｉｒｏｕ　 ２　 １．８５７　１　 ０．３２２　２　 ０．１７３　５　 ０．１６８　８　 ５８１．８７
３　 １．６９４　３　 ０．４１３　１　 ０．２４３　８　 ０．２８８　３　 ７４５．９７
４　 １．６１５　０　 ０．３８２　６　 ０．２３６　９　 ０．２３２　２　 ６９０．９５
君迁子 １　 １．７３０　６　 ０．２４５　２　 ０．１４１　７　 ０．１２４　８　 １６８．９２
Ｄａｔｅ　ｐｌｕｍ　 ２　 １．７６２　６　 ０．３１８　５　 ０．１８０　７　 ０．１４０　５　 ２０７．４１
３　 １．６９４　２　 ０．３７７　８　 ０．２２３　０　 ０．２７５　９　 ２４６．０３
４　 １．６４８　７　 ０．３２３　８　 ０．１９６　４　 ０．１７０　４　 ２１０．８６
·１６１·８期　　　　　　　　　　易庆平等：不同处理对柿属植物ＤＮＡ提取产率和品质的影响
　　Ｍ．ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；ａ为高盐乙醚法，ｂ为苯酚氯仿法，ｃ为ＣＴＡＢ沉淀法，１、２、３、４、５、６、７分别对应４月６日、４月１３日、４月２０日、５
月８日、５月１８日、５月２６日、６月６日７个不同采样时期的“鄂柿一号”叶片材料　Ａ　ｒｅｆｅｒｓ　Ｈｉｇｈ　ｓａｌｔ／Ｗａｔｅｒ－ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｅｔｈｅｒ，ｂ　ｒｅｆｅｒｓ
Ｐｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，ｃ　ｒｅｆｅｒｓ　ＣＴＡＢ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ．１，２，３，４，５，６，ａｎｄ７ａｒｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ　ｗｉｔｈ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｌｅａｆ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｓａｍｐｌｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄａｔｅ　ｏｆ　４／
６，４／１３，４／２０，５／８，５／２６，ａｎｄ　６／６
图２　３种纯化方法纯化柿基因组ＤＮＡ的电泳和限制性酶酶切
Ｆｉｇ．２　Ａｇａｒｏｓｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＥｃｏＲⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ　ｂｙ　ｔｈｒｅｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ
　　Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１，２，３，４分别表示４种淀淀方法　１，２，３，４ａｒｅ
ｆｏｕｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ；图４同 Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　Ｆｉｇ．４．
图３　不同沉淀方法的ＲＡＰＤ扩增
Ｆｉｇ．３　ＲＡＰＤ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ
ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ
图４　不同沉淀方法的ＳＳＲ扩增
Ｆｉｇ．４　ＳＳＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ
ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ
３．２　去除多糖、多酚等杂质的方法
植物组织通常会含有一些会影响ＤＮＡ提取
的物质。例如多酚就是一种很强的氧化因子并能
够不可逆地同ＤＮＡ结合，生成褐色凝胶状物；高
水平的多糖也可以使ＤＮＡ形成粘性沉淀而难以
处理［１３］。为避免酚类物质氧化造成的褐化，在样
品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子鏊合剂
ＰＶＰ（聚乙烯吡咯烷酮）以及提取缓冲液中加入
巯基乙醇、抗坏血酸等巯基试剂［１４］。佟兆国等［１５］
采用改良ＣＴＡＢ法对桃、苹果、葡萄等８种果树
秋季成熟叶片ＤＮＡ进行提取，在提取缓冲液中
加入φ＝５％β－巯基乙醇和ｗ＝３％可溶性ＰＶＰ，
有效抑制酚类物质氧化作用，去除多酚类物质对
ＤＮＡ提取的干扰。柿属植物本身具有高含量的
多酚、类萜烯等酚类物质，故本试验加大提取液缓
冲液中抗氧化剂和鏊合剂的含量，使质量分数均
达到５％，有效地防止多酚污染。
经典的ＣｓＣｌ梯度离心能有效地除去植物多
糖，但梯度离心设备昂贵，操作不便且ＤＮＡ得率
很低。近年国内外有一些去除多糖的方法，Ｆａｎｇ
Ｇ等［１６］认为在１．０～２．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的高盐ＴＥ
中，用无水乙醇沉淀ＤＮＡ能除去多糖。Ｐｏｒｅｂｓｋｉ
Ｓ　Ｌ等［１］在沉淀粗提ＤＮＡ 时，将ＮａＣｌ的浓度提
高至２．５ｍｏｌ／Ｌ以除去多糖。徐志祥等［１７］将
ＤＮＡ沉淀重悬于φ＝３０％乙醇中４℃放置过夜，
离心，上清加乙醇至φ＝８０％重新沉淀ＤＮＡ，能
去除多糖和其他杂质。Ｃａｎｄｅｌａｒｉｏ　Ｍ　Ｊ等［１８］通过
·２６１· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１卷
调节材料取样时期、使用量，在氯仿处理后加含
φ＝２％ＣＴＡＢ的分离缓冲液，并延长离心时间的
方法来有效去除仙人掌植物的多糖。Ｃｈｅｎｇ　Ｙ　Ｊ
等［７］先用水饱和乙醚和１．２～１．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ溶
液将大部分多糖去除，再用２倍乙醇沉淀ＤＮＡ
可大大提高效率。Ｍｉｃｈｉｅｌｓ　Ａ等［１９］用生长２～４
月的幼苗转移到暗室暗化处理四周的黄化叶提取
ＤＮＡ，能有效防止多糖污染，同时发现２５℃下异
丙醇过夜沉淀ＤＮＡ能减少杂质污染且大大提高
产率。Ｇｈｏｓｈ　Ｒ等［２０］采用更大体积的提取缓冲
液和１ｍｏｌ／Ｌ高盐 ＮａＣｌ溶液溶解粗ＤＮＡ的方
法可有效去除多糖干扰。在柿属植物ＤＮＡ提取
中，高盐乙醚法纯化去除多糖效果较好，在异丙醇
沉淀之前加高浓度的ＮａＣｌ溶液有助于减少杂质
污染。
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ＤＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｅｇｏ－
ｍｏｖｉ－ｒｕｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｊｕｔｅ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｕｓ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．
Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，１５９：３４－３９．
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