全 文 ：2014 年 9 月 第 16 卷 第 9 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Sep. 2014 Vol. 16 No. 9
研究开发
△［基金项目］ “十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAI28B02);国家自然科学基金项目(81160504)
*［通信作者］ 李旻辉，教授，研究方向:蒙药资源保护与利用;Tel: (0472)7167795，E-mail:li_ minhui@ aliyun. com
基于 ITS2 序列鉴定 6 种假龙胆属及 3 种近缘属植物△
李振华，龙平，朱虹，张春红，李旻辉*
(内蒙古科技大学 包头医学院，内蒙古 包头 014060)
［摘要］ 目的:基于 ITS2序列建立 6种假龙胆属植物的分子鉴定方法。方法:采集 6种假龙胆属植物和喉毛花属、
花锚属、龙胆属的植物各 1种，所有样品进行总 DNA提取，PCＲ扩增，并对扩增产物进行测序，用 MEGA 4计算其种间
遗传距离，最后利用 ITS2序列构建其系统发育树。结果:序列长度为 319 ～334 bp，GC含量为 58. 9% ～66. 2%。种与种之
间的遗传距离范围为 0. 051 ～0. 464，通过系统进化树进行的聚类分析可以将 6种假龙胆属植物有效地区分开。结论:ITS2
可以成功鉴别出 6种假龙胆属植物，可以作为假龙胆属植物的分子鉴定方法，具有重要的应用价值。
［关键词］ 假龙胆属;ITS2 序列;分子鉴定;系统发育树;遗传距离
Molecular Identification of Six Kinds of Gentianella Plants Based on ITS2 Sequence
LI Zhenhua，LONG Ping，ZHU Hong，ZHANG Chunhong，LI Minhui*
(Baotou Medical College，Baotou 014060，China)
［Abstract］ Objective:To establish molecular identification method for six kinds of Gentianella
plants based on ITS2 genes sequence. Methods:Total DNA of six kinds of Gentianella plants，one species
from Comastoma，one species from Halenia and one species from Gentiana were extracted; ITS2 gene
sequence amplified by PCＲ. PCＲ product was directly sequenced. The inter-specific distances of all species
were calculated，and phylogeny trees were constructed by MEGA 4. Ｒesults:The length of ITS2 sequence
region varied from 319 to 334 bp. The GC content of ITS2 was 58. 9% to 66. 2%. The inter-specific genetic
distances among 6 species of Gentianella was 0. 051-0. 464. Phylogeny trees reconstruction using NJ analysis
based on ITS2 nucleotide sequences can effectively authenticate Gentianella plants. Conclusion:ITS2 can
be used to correctly identify six kinds of Gentianella plants，and it will be a potential molecular identification
method for identifying Gentianella plants，with great application value.
［Key words］ Gentianella; ITS2 gene sequence; Molecular identification; Phylogeny trees;
Genetic distances
doi:10． 13313 / j． issn． 1673-4890． 2014． 09． 004
假龙胆属(Gentianella Moench)，隶属于龙胆科
(Gentianaceae)，曾经长期被置于龙胆属，但是该属
植物在性状上与龙胆属有明显的不同:花冠裂片间
无褶，萼管里面无膜状小囊，子房基部无柄，并且
花瓣上有蜜腺。Gillet 早在 1957 年就详细论述了该
属成立的理由及分类历史，Pringle［1］和 Ho 等［2］均先
后赞成该属应当独立为单属。随着对假龙胆属胚胎
学和分子系统学方面的深入研究［3-4］，结果也表明假
龙胆属应为一单系属。而在最新关于龙胆科分类的
研究中，龙胆属被归入了龙胆亚族，而假龙胆属则
被置于 Swertiinae亚族下［5］。董剑利等［6］通过利用模
糊数学方法对甘肃扁蕾属、喉毛花属和假龙胆属分
类进行了初探，分析结果倾向于喉毛花属和假龙胆
属应当独立为属。假龙胆属在全世界分布约有 250
个种，主要分布在欧亚大陆的高山地区，非洲西北
部、中美、北美和南美地区，澳大利亚及新西兰等
温带地区。而中国有 9 种，主要分布于东北、西北
及西南地区［7］。假龙胆属中传统记载可作为药用的
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植物有新疆假龙胆、黑边假龙胆、矮假龙胆、尖叶
假龙胆和紫红假龙胆，却并未被 《中国药典》2010
年版收录，但这些药用植物在我国民族药(藏、蒙药
等)中应用广泛。例如，新疆假龙胆 Gentianella
turkestanorum全草入维药，维吾尔族人民用其全草泡
茶治疗感冒、发热等症［8］;黑边假龙胆 Gentianella
azurea全草入藏药，具有清热解毒、去除肝胆之火的
功效［9］;尖叶假龙胆 Gentianella acuta 全草入蒙药，
是蒙医用于治疗黄疸性肝炎、头痛、发烧的主药［10］。
中国假龙胆属药用植物作为传统民族药的常用
药材，因为其生长条件苛刻等原因，目前还没有出
现大面积的栽培。近年来，大量的野生药材被大肆
采挖，造成了严重的供应短缺，市场上经常出现混
伪品，这给人民的用药安全带来了严重隐患。因此，
亟待建立一种快速准确的鉴定方法。
目前，假龙胆属药用植物鉴别主要是依靠传统
的形态学、解剖学、孢粉学、染色体特征、植物化
学特征鉴定的方法［7］，这些方法存在主观性较大、
特异性不强、通用性差、对观察者经验的要求高等
不足，不利于药材规范化、标准化方法的建立及普
及。DNA条形码(DNA barcoding)技术具有操作简
易、可重复性强、通用性强等优点。因此，DNA
条形码技术被应用在假龙胆属药用植物鉴定研究
中，将有利于实现民族药药材鉴定客观化、规范
化、标准化，对推动民族药的发展具有重大意义。
陈士林等［11］通过使用 ITS2 序列对藻类、真菌和高
等植物进行了分析，发现 ITS2 在种级水平上的分辨
成功率可以达到 92. 7%，为此建议 ITS2 可作为真菌
和绿色植物的一种新的 DNA 条形码。此外，使用
ITS2序列对中药材羌活、秦艽、薄荷等以及其相应混
伪品进行分析，结果表明上述药材与其混伪品的 ITS2
序列具有明显差异，为快速、准确鉴定中药材提供科
学依据［12-14］。本研究利用 ITS2 序列来鉴别 6 种假龙
胆属植物以及 3种近缘属植物，笔者采用分子手段对
中国地区假龙胆属的大部分植物进行鉴定研究，为假
龙胆属植物的鉴定提供分子依据，并为假龙胆属药用
植物进一步开发利用奠定基础。
1 仪器与材料
1. 1 仪器
5332 PCＲ仪(德国 Eppendorf)，DYY-12 电泳系
统(北京市六一仪器厂)，5810 Ｒ 低温冷冻离心机
(德国 Eppendorf)，GBOXHＲ 紫外凝胶成像分析仪
(英国 Syngene)，MM400 混合型球磨仪 (德国
Ｒetsch)，KQ-500DE数控超声波清洗器，微量移液
器(德国 Eppendorf)。
1. 2 试剂
2 × CTAB 提取液，1 × TAE 缓冲液，琼脂糖
(Promega公司)，溴化乙锭(Fluka 公司)，DNA Taq
聚合酶(Takara公司)，2 000 bp DNA Markar(Takara
公司)，三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分
析纯。
1. 3 材料
实验材料均为硅胶干燥的叶片，种名、采集地
点、标本号等信息详见表 1。所有样品均经内蒙古
科技大学包头医学院王振旺老师鉴定。
表 1 6 种假龙胆属及 3 种近缘属植物材料信息表
种名 采集地点 标本号 民族药用 功效
新疆假龙胆 Gentianella turkestanorum 新疆伊犁地区 BTMG-XJ01
BTMG-XJ02
维药 清热解毒，利湿消肿
矮假龙胆 Gentianella pygmaea 青海达日县 BTMG-Ai01
BTMG-Ai02
藏药 清热解毒，舒肝利胆
异萼假龙胆 Gentianella anomala 四川木里 BTMG-YE01
BTMG-YE02
未知 未知
黑边假龙胆 Gentianella azurea 青海达日县 BTMG-HB01
BTMG-HB02
藏药 清热解毒，去除肝胆之火
紫红假龙胆 Gentianella arenaria 青海达日县 BTMG-ZH01
BTMG-ZH02
藏药 清热利湿，解毒消肿
尖叶假龙胆 Gentianella acuta 内蒙古根河 BTMG-JY01
BTMG-JY02
蒙药 清热，利湿
花锚 Halenia corniculata 内蒙古根河 BTMG-HM01
BTMG-HM02
蒙药 清热解毒，凉血止血;清热利湿，平肝利胆
滇龙胆 Gentiana rigescens 云南大理 BTMC-DLD01
BTMC-DLD02
彝药，佤药，
拉祜药，白药
治急性黄疸型肝炎，咽喉肿痛，痢疾
喉毛花 Comastoma pulmonarium 内蒙古阿拉善盟 BTMC-HMH1
BTMC-HMH2
蒙药 祛风除湿，清热解毒
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2 方法
2. 1 总 DNA的提取
取适量样品(约 0. 03 g)，研磨成细粉，采用改
良的 CTAB法［15］提取总 DNA，于 － 20 ℃保存备用。
2. 2 引物设计及 DNA扩增
选择目前国际上推荐的通用引物 ITS2(ITS2F /
Ｒ)。 F: 5 ’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 ’; Ｒ:
5 ’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 ’ 为 扩 增 引
物［16］。PCＲ 反应体系总体积为 20 μL，包括 10 ×
buffer 缓冲液 2 μL。dNTP 1. 6 μL，引物各 0. 5 μL，
EX Taq 酶 0. 2 μL，DNA 0. 5 μL。反应条件:解链温
度 95 ℃，时间5 min，退火温度56 ℃，时间30 s，复
性温度72 ℃，时间1 min 40 s，延伸温度72 ℃，时间
为 7 min，循环次数为 35个，最后 4 ℃保存。
2. 3 测序
经过 PCＲ扩增后，PCＲ产物由北京睿博兴科生物
技术有限公司测序部测序，各样品均采用正向测序。
2. 4 序列分析
将 9 种植物的 18 个个体进行序列比对分析，所
得 DNA序列用 CONTIG软件同源对齐，并辅以人工
校对，以尽量减少排列所缺失的数目;排序后的序
列使用 BioEdit 分析软件进行分析处理。用 MEGA
4. 0 作遗传距离分析并采用邻接法(NJ 法)和非加权
平均法(UPGMA 法)分别构建系统发育树，并以
Bootstrap作 1 000 次可信度分析。
3 结果
3. 1 DNA提取质量及测序峰图质量分析
电泳检测结果表明 9 种植物 18 个个体的 DNA
均有清晰可见的 DNA 条带，表明该 DNA 的浓度足
以进行 PCＲ反应，其 PCＲ产物经电泳后均可显示出
明亮条带。其次，测序峰图经 CONTIG 软件以及人
工校对，去除低质量序列及引物区，以满足序列数
据分析要求。
3. 2 种内及种间遗传距离分析
9 种植物 18 个样本的序列长度为 319 ～ 334 bp，
G + C含量为 58. 9% ～66. 2%。9 种植物中只有滇龙
胆和新疆假龙胆存在种内变异，其种内遗传距离分
别为 0. 048，0. 175。根据 K-2-P 参数遗传距离模型
计算得到序列间遗传距离，假龙胆属种间遗传距离
最远的两个种是新疆假龙胆和黑边假龙胆，遗传距
离值为 0. 439，而其种间最近的是尖叶假龙胆与紫红
假龙胆，遗传距离值为 0. 065。6 种植物种间平均
K-2-P遗传距离为 0. 315。矮假龙胆与其他样品的种
间遗传距离为 0. 139 ～ 0. 432;黑边假龙胆为0. 083 ～
0. 439;异萼假龙胆为 0. 139 ～ 0. 410;紫红假龙胆为
0. 065 ～ 0. 425。喉毛花与假龙胆属中的尖叶假龙胆
的遗传距离为 0. 051，是 3 种近缘属植物中遗传距离
最近的，而龙胆属的滇龙胆与假龙胆属中的矮假龙
胆遗传距离为 0. 464，是 3 种近缘属植物中遗传距离
最远的。9 种植物的种间遗传距离详见表 2。
表 2 假龙胆属与近缘属植物间的遗传距离
种名 滇龙胆 新疆假龙胆 矮假龙胆 黑边假龙胆 异萼假龙胆 紫红假龙胆 尖叶假龙胆 花锚 喉毛花
滇龙胆
新疆假龙胆 0. 445
矮假龙胆 0. 464 0. 360
黑边假龙胆 0. 177 0. 439 0. 432
异萼假龙胆 0. 418 0. 297 0. 139 0. 410
紫红假龙胆 0. 160 0. 421 0. 425 0. 109 0. 375
尖叶假龙胆 0. 146 0. 397 0. 409 0. 083 0. 367 0. 065
花锚 0. 157 0. 405 0. 445 0. 132 0. 399 0. 128 0. 097
喉毛花 0. 143 0. 413 0. 436 0. 098 0. 386 0. 087 0. 051 0. 109
3. 3 聚类分析
本实验根据 ITS2 序列特征，采用了 NJ 法和
UPGMA法分别构建了 6种假龙胆属植物以及 3种近缘
属植物的系统发生邻接(NJ)树和 UPGMA树(图 1、2)。
2种方法均采用 K-2-P 距离，并以 Bootstrap 作 1 000
次可信度分析，以评价分支的统计学意义和可靠性。
由 NJ树(图 1)结果所示，聚类主要分为两支，尖叶
假龙胆、喉毛花、紫红假龙胆、黑边假龙胆、花锚和
滇龙胆聚为一大支，其中假龙胆属的尖叶假龙胆和喉
毛花属的喉毛花聚为一支。新疆假龙胆、矮假龙胆、
异萼假龙胆聚为一大支，矮假龙胆和异萼假龙胆聚为一
支。从 NJ树图可以看出，9 种植物均可以相互区分。
而 UPGMA树(图 2)结果和 NJ树结果类似，都可以将
这 9种植物相互区分开来。
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图 1 基于 ITS2 序列构建的 6 种假龙胆属及 3 种近缘属植物的 NJ树
图 2 基于 ITS2 序列构建的 6 种假龙胆属及 3 种近缘属植物的 UPGMA树
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4 讨论
4. 1 系统发育树分析
通过构建 ITS2 系统发育树，笔者可以很清楚地
分析各个物种之间的亲缘关系。由此可见，ITS2 序
列可以很好地鉴定出这 6 种假龙胆属植物。系统发
育树结果表明，本实验所选物种主要聚为两大支，
新疆假龙胆、矮假龙胆和异萼假龙胆聚为一大支，
可见异萼假龙胆和这两种药用植物关系较近，但是，
目前异萼假龙胆是否具有药效作用还未见报道，同
时异萼假龙胆是否有和新疆假龙胆、矮假龙胆的类
似药用功效有待进一步研究。同属植物尖叶假龙胆
和喉毛花属喉毛花首先聚为一支，再和紫红假龙胆
聚为一支，之后再与黑边假龙胆聚为一支，而后再
与花锚属花锚聚为一支，最后与龙胆属的滇龙胆聚
为一大支，以上结果表明喉毛花与假龙胆属植物尖
叶假龙胆相比于其他植物的亲缘关系最近;而形态
学上，喉毛花属花冠喉部具有流苏状副花冠，尖叶
假龙胆则是假龙胆属中唯一一个花冠喉部具有流苏
状副花冠的植物，只不过流苏体是具维管束的。因
此，本实验结果与二者在形态学上非常相似的事实
相一致［17］。进化树还表明，假龙胆属药用植物中的
紫红假龙胆、尖叶假龙胆、黑边假龙胆与 3 种近缘
属植物的亲缘学关系较近。本课题组［10］调查了假龙
胆属药用植物的传统疗效，并采用传统疗效指数来
评价本属植物在疗效方面的倾向性，最终发现尖叶
假龙胆、黑边假龙胆、紫红假龙胆、矮假龙胆和新
疆假龙胆的传统疗效都有清热解毒作用，但是清热
解毒疗效倾向性大的分别是尖叶假龙胆、黑边假龙
胆、紫红假龙胆。笔者可以通过树图发现，这 3 种
假龙胆属药用植物也正好和近缘属喉毛花、花锚、
滇龙胆聚为一大支，在临床应用中，花锚和尖叶假
龙胆都可入“地格达”类蒙药，具有清热解毒、凉
血消肿愈伤的功效，可见，本实验结果可能对这种
等同入药提供一定的科学依据。
4. 2 分子鉴别中国假龙胆属植物的意义
假龙胆属植物在世界范围分布广泛，该属许多
物种都有强烈的苦味，传统医药常用来治疗食欲不
振、胆囊炎和发烧等疾病［18］。国外对假龙胆属的研
究已经相对深入，本属植物 Gentianella nitida 和
Gentianella nevadensis为南美传统的药物，通过现代
药理研究表明，G. nitida 具有促进毛鬓生长、抗菌、
清除自由基等方面的作用［19-20］;G. nevadensi 具有抗
抑郁和抗感染等作用［21］。但是对于中国假龙胆属植
物的研究，目前只有对尖叶假龙胆展开了广泛的调
查研究，发现尖叶假龙胆被大兴安岭地区的鄂仑春
族猎民长期用于治疗心律失常等疾病，疗效极为显
著。通过对其化学成分研究，发现主要含有三萜类、
黄酮类和 酮类成分［22-24］，同时对其药理作用的研
究表明，其中的雏菊叶龙胆酮成分具有抗心律失常
的作用［25］，这也是其他假龙胆属植物并未被发现的
功效［10］;新疆假龙胆药理作用表明其具有治疗关节
炎的作用，但是其化学成分的研究并未有报道［26］;
黑边假龙胆对其胚胎学［3］和化学成分进行了研究，
共分离到了 1 个 酮，3 个环烯醚萜苷等 9 个化合
物［27］，但其药理作用并未见报道;而其他假龙胆属
植物的研究就相对更少。总之，中国假龙胆属植物
的研究还是相对较少，所以有必要加大对该属植物
的研究，这样将有利于新药的开发。
本研究利用 ITS2 序列对我国 6 种假龙胆属植物
进行鉴定，这是首次采用分子技术对中国地区的假
龙胆属药用植物进行鉴定研究。结果表明在龙胆科
假龙胆属植物样品中，ITS2 序列通用性较好，变异
度适合，提供的遗传信息充足，鉴定能力较强，可
以有效地将几种中国假龙胆属药用植物鉴定开来。
采用 DNA条形码鉴定方法对我国假龙胆属植物进行
鉴定，对假龙胆属药用植物正本清源，对保证药材
安全及植物资源合理利用具有重要意义。同时，本
研究将为假龙胆属植物的进一步研究奠定基础，进
而为民族医药的研究提供更广阔的新思路。
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(收稿日期 2014-02-27)
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