全 文 ：文章编号:1001-4829(2009)04-1042-04
　　收稿日期:2009-04-22
　　基金项目:河北省自然科学基金 “梨属种质资源分子遗传连锁
图谱构建与遗传多样性分析 ”(303240)
作者简介:马艳芝(1977-),女 ,河北唐山人 , 硕士 ,讲师 , 主要
从事植物细胞工程及植物资源开发利用方面研究 , E-mail:may-
anzhiwxd@163.com, ＊为通讯作者。
梨属植物基因组 DNA提取部位对 RAPD扩增的影响
马艳芝 1, 2 ,张玉星1＊
(1.河北农业大学园艺学院 ,河北 保定　071001;2.唐山师范学院生命科学系 ,河北 唐山　 063000)
摘　要:中国梨属植物资源丰富 , RAPD技术已广泛用于梨资源遗传多样性研究。通过对不同部位提取的 DNA纯度进行测定 ,并
进行 RAPD扩增分析,为 RAPD技术在梨属种质资源中的应用提供参考。以鸭梨和杜梨为试验材料 ,利用 CTAB法对其幼叶 、老叶
及韧皮部等不同组织或同一组织的不同时期进行了基因组 DNA的提取,并对其进行了 RAPD反应的比较。所提取的鸭梨的幼嫩
叶片 、成熟叶片 、韧皮部 DNAOD260 /OD280的比值分别为 2.0、1.8、 1.7;杜梨幼嫩叶片 、成熟叶片 、韧皮部 DNAOD260 /OD280的比值
分别为 1.9、1.8、1.6。二者都能成功进行 RAPD扩增 ,且扩增结果基本一致。利用 CTAB法从鸭梨和杜梨的幼嫩叶片 、成熟叶片 、
韧皮部提取的 DNA均能成功进行 RAPD扩增 ,且结果基本一致。
关键词:梨属;不同部位;基因组 DNA;RAPD
中图分类号:S188　　　文献标识码:A
EfectofDiferentTissuesinPyrusL.forGenomeDNAExtractonRAPD
MAYan-zhi1 , 2 , ZhangYu-xing1＊
(1.ColegeofHorticulture, AgriculturalUniversityofHebei, HebeiBaoding071001, China;2.DepartmentofBiologicalScience, Tangshan
Teacher sColege, HebeiTangshan063000, China)
Abstract:RAPDtechniquewasappliedonstudyofgermplasmgeneticdiversity.InordertoprovideRAPDinformationtoapplicationof
Pyrusgermplasmicresources, YalipearandBetulaefoliaweretested.GenomeDNAofthepearswasextractedfromdiferenttissuesordifer-
entphasesofthesametissue, suchasnewleaves, oldleavesandphloembyCTABmethod, andcheckedbyRAPDamplification.There-
sultsshowedthatOD260 /OD280 oftheDNAbothfromleavesandphloemwereamong1.6-2.0, andalofthemcouldbeamplifiedsucces-
fulybyRAPDandwiththesameamplificationefect.
Keywords:PyrusL.;Diferentmaterials;GenomeDNA;RAPD
　　RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)技
术是建立于 PCR(PolymeraseChainReaction)基础
上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分
析的 DNA分子标记技术。基因组 DNA的提取是
RAPD扩增能否成功的关键[ 1 ～ 3] 。许多研究报道 ,
影响 RAPD扩增的 DNA杂质往往不是 RNA或蛋白
质这些大分子物质 ,而是多糖类和酚类等小分子物
质 。植物材料由于 DNase水平低 , 蛋白质水平也
低 ,其操作要点是要避免植物次生代谢物质 (如多
酚 、类黄酮等)。在木本植物中体内含有一些特殊
的次生物质 , 会影响提取的 DNA的质量 , 导致
RAPD分析的失败[ 4] ,因此 ,许多分子标记技术在提
取 DNA时都会选择幼嫩组织 ,尤以幼嫩叶片为主。
但是作为多年木本落叶植物来讲 ,这样就大大限制
了采样的时期 。
梨树是一种富含酚类 、单宁类物质的树种 ,而且
植物多糖与 DNA共存 ,这些物质使提取的 DNA质
量不高 ,难于用于 RAPD扩增 ,限制了 RAPD技术在
梨属植物分子生物学研究上的应用[ 5] 。关于梨的
DNA提取 ,前人从提取方法到提取材料均作过一些
研究 。最常见的 DNA提取方法为 CTAB和 SDS法。
人们认为 ,传统的 CTAB法很难用于较高质量的梨
基因组 DNA提取 ,需对其进行改良 ,即在提取 DNA
时加入 PVP、Vc、BME等物质[ 6 ～ 8] ,而对于 SDS法同
样需要改良[ 9 ～ 10] 。石蕊以不同梨品种为材料 ,分别
1042
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2009年 22卷 4期
Vol.22　　No.4
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2009.04.006
采用改良 CTAB法 、改良 SDS法 、SDS-CTAB和高盐
低 pH值法对梨基因组 DNA进行了提取 ,认为:采
用改良 CTAB法在提取各种梨基因组 DNA过程中
表现最好且纯度最高;SDS法提取的基因组 DNA产
率最高 ,但纯度较低;高盐低 pH值法产率和纯度均
最低[ 11] 。除此 ,人们还对成熟叶片 、新梢 、嫩芽和幼
叶的提取结果进行扩增和分析。刘遵春等认为 ,利
用改良 CTAB法从成熟叶片 、嫩叶和幼芽提取得
DNA均能用于 RAPD扩增 [ 12] 。张永明等研究发
现 ,利用 SDS法从幼叶和芽中提取的 DNA可直接
用于 RAPD分析 ,而成熟叶片虽能提取到基因组
DNA,但不能直接用于 RAPD分析 [ 4] 。利用枝条的
韧皮部提取 DNA进行 RAPD扩增还不多见 [ 13] 。鉴
于此 ,以白梨系统的鸭梨和沙梨系统的杜梨为材料 ,
利用改良 CTAB法从其幼嫩叶 、成熟叶和韧皮部提
取基因组 DNA,通过对 3种处理提取的 DNA进行
电泳检测 、纯度比较及其对 RAPD扩增结果的影响
进行研究 ,旨在为梨属植物进行 RAPD分析的采样
提供新的途径和理论依据 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验于 2002年 4月至 2003年 4月进行。供试
材料采自河北农业大学标本园。 RAPD扩增在河北
农大园艺学院实验室进行。鸭梨与杜梨不同组织
(叶片和韧皮部),同一组织的不同生长时期(幼嫩
叶与成熟叶)用于提取 DNA。叶片采集在生长期进
行 ,而韧皮部取自 1年生枝条。
1.2　试验方法
1.2.1　DNA提取　基因组 DNA的提取及 RAPD
扩增参照马艳芝等的方法 [ 8] 。具体步骤:①称取 3g
左右样品 ,迅速液氮研磨成细粉末 ,转入 50mL离心
管中;②加入 15 mL经 65 ℃预热的提取缓冲液 ,涡
漩混匀;③65℃水浴 30 min,期间不时颠倒混匀;④
加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),来回颠倒混匀
后 , 4000 r/min离心 15 min,取上清;⑤加入等体积
的氯仿 ∶异戊醇(24∶1),来回颠倒混匀后 , 4000 r/
min离心 15 min,取上清;⑥再加入 0.6×冰冻异丙
醇 ,颠倒混匀 ,可见成团 DNA;⑦钩出白色絮状 DNA
沉淀 ,放入 1.5mL离心管中 ,用 70%乙醇清洗沉淀
2次;⑧风干后 ,加入 700 μl×TE溶解充分后 ,贮存
于 4 ℃冰箱中备用;⑨DNA质量和浓度的检测:提
取的 DNA的质量和浓度采用琼脂糖凝胶电泳和紫
外分光光度计测定。在 U2001紫外分光光度计上
测定 OD280和 OD260的值 ,以 OD260 /OD280比值检测核
酸纯度 。核酸浓度按以下公式计算:DNA浓度 =
OD260 ×50×稀释倍数(ng/μl)。然后按 DNA浓度
值将所提取样品均稀释至 20ng/μl备用。
CTAB法提取缓冲液:100 mmol/LTris-HCl(pH
9.0), 1.4 mmol/LNaCl, 20 mmol/LEDTA(pH8.0),
2% CTAB, 2 % β -巯基乙醇;另外加入了抗氧化
剂:1%抗坏血酸 , 2 % PVP-40, 2 % Na2S2O5。各
缓冲液的配制均按照 《分子克隆实验指南 》第二版
进行 [ 14] 。重复 3次。
1.2.2　RAPD扩增 　RAPD扩增反应在 Whatman
Biometra型热循环仪上进行 ,采用马艳芝等[ 8]的方
法 ,即在 25 μl的反应体系中含有 2.0 mmol/L
Mg2+ , 200 μmol/LdNTPs, 0.4 μmol/L引物 , 40 ng
模板 DNA, 1.5 UTaqDNA聚合酶;扩增程序:94 ℃
预变性 3 min;94℃变性 1 min,退火 1 min, 72 ℃延
伸 1.5 min, 43个循环;72 ℃保温 10 min,最后 4 ℃
保温 。
1.2.3　RAPD扩增产物检测　RAPD扩增产物用
1.5 %琼脂糖凝胶(含 0.5 μg/mLEB)电泳分离 ,电
泳缓冲液为 0.5×TBE,电泳于 DYY-Ⅲ稳压电泳仪
上进行(电压 3.5V/cm)。根据扩增片段的大小 ,适
时停止电泳。电泳结果在紫外透射仪上观察 ,照相。
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA的提取和检测
试验利用 CTAB法成功进行了梨不同部位(叶
片和韧皮部)和同一组织(幼嫩叶和成熟叶)的不同
时期基因组 DNA的提取 ,提取的 DNA多呈透明无
色状 ,且易溶于 1×TE中 ,经过 0.7 %琼脂糖凝胶
电泳检测呈一亮带 ,结果见图 1[ 8] 。基因组 DNA的
提取是 RAPD扩增能否成功的关键 。许多研究表
明 ,影响 RAPD扩增的 DNA杂质往往不是 RNA或
蛋白质这些大分子物质 ,而是多糖类和酚类等小分
子物质[ 15 ～ 16] 。本试验中各样品的 OD260 /OD280的比
值(表 1)均在 1.6 ～ 2.0之间 。一般认为 , OD260 /
OD280比值为 1.5以上即可进行 RAPD分析 ,而试验
所提样品比值达 1.6 ～ 2.0,表明蛋白质等杂质均
图 1　基因组 DNA的电泳检测结果
Fig.1　ElectrophoreticproductsfrommaterialsofPyrus
10434期 　　　　　　马艳芝等:梨属植物基因组DNA提取部位对 RAPD扩增的影响
1、4:幼叶;2、5:老叶;3、 6:韧皮部
1, 4:newleaf, 2, 5:oldleaf, 3, 6:phloem
图 2　不同提取组织对 RAPD扩增的影响
Fig.2　EfectofdiferenttissuesonRAPDamplification
少 , DNA纯度较高。同时 ,由于梨叶片中含酚类物
质较多 ,一些抗氧化剂(PVP-40, VC, Na2S2O5)的加
入有效的抑制了 DNA的氧化 ,为 RAPD扩增结果的
可靠性奠定了基础。
2.2　不同部位提取的基因组 DNA对 RAPD扩增的
影响
试验利用 CTAB法成功的从梨成熟叶片 、幼嫩
叶片及韧皮部中提取了 DNA,并分别进行了扩增 ,
结果如图 2所示。可见 ,在反应条件一致的情况下 ,
鸭梨和杜梨均能成功进行 RAPD扩增(泳道 1 ～ 3,
鸭梨;4 ～ 6,杜梨)。除此 ,还对经 RNA酶处理的和
未经 RNA酶处理的 DNA分别进行了扩增 ,电泳结
果如图 3所示(泳道 1 ～ 2,鸭梨;3 ～ 4,杜梨)。可见
扩增带型基本一致 ,说明基因组中少量的 RNA对扩
增结果没有太大的影响。
3　结论与讨论
(1)梨树是一种富含酚类 、单宁类物质的树
种 [ 9, 17] 。在 DNA提取时 , CTAB法有较好的效果 ,因
其能够更有效地沉淀多糖类物质。以前人们认为 ,
CTAB法成本高 ,毒性大 ,操作繁琐 ,且往往用在需
DNA量较大的 RFLP等的分析中采用 ,而 SDS法对
于模版质量要求不严的 RAPD分析采用较多 [ 9] 。
近年来 CTAB法(或改良 CTAB法)已被广泛应用到
棕榈[ 18] 、金发藓[ 19] 、猕猴桃 [ 20]等多种植物多种技术
中 。试验中在提取 DNA的过程中加入的抗氧化剂
物质有效地抑制了酚类物质的氧化 ,更有效地抑制
了 DNA的氧化 ,保证了高质量 DNA的提取成功 。
表 1　不同部位基因组 DNA的 OD260 /OD280
Table1　TheOD260 /OD280 ofthegenomicDNAfromdiferenttissues
材料名称
Name
OD260 /OD280
幼嫩叶片
Youngleaf
成熟叶片
Oldleaf
韧皮部
Phloem
鸭梨 Yalipear 2.0 1.8 1.7
杜梨 Betulaefolia 1.9 1.8 1.6
1、3:去RNA;2、4:未去 RNA
1, 3:treatedwithRNase, 2, 4:NottreatedwithRNase
图 3　RNA酶处理对 RAPD扩增的影响
Fig.3　EfectofRNasetreatmentonRAPDamplification
　　(2)无论是嫩芽 、幼叶 、新梢还是成熟叶 ,对于
多年生落叶植物梨来说 ,材料的获得必须是植物生
长期 ,但是作为韧皮部来讲 ,可在任何时期获得(包
括休眠期),因其来源于枝条 ,这就打破了采样时期
的限制 ,无限期的延长了采样的时间。关于利用
CTAB法从韧皮部中提取 DNA进行 RAPD扩增还
未见报道 。CTAB法也广泛用于植物种子提取 DNA
的研究中 [ 21 ～ 22] ,本试验也曾利用此法从种子来提取
DNA但未取得成功 ,提取出的物质呈现白色细颗粒
状 ,而不是形成无色透明絮状物 ,原因需要进一步探
讨。
(3)许多研究者认为 , RNA的有无和带有少量
的蛋白质不会影响 RAPD扩增 [ 23] 。本试验利用
CTAB法成功地从梨属植物的幼嫩 、成熟叶片和韧
皮部提取出了 DNA,而且不用 RNA酶处理获得的
基因组 DNA也能得到稳定一致的扩增结果 ,说明
DNA模板中含有较少量的 RNA不影响 RAPD扩增
结果 。这与 TengYuanWen等的研究报道一致 [ 24] 。
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(责任编辑　王丽丽)
10454期 　　　　　　马艳芝等:梨属植物基因组DNA提取部位对 RAPD扩增的影响