全 文 ：第 18卷 第 3期 化　学　研　究 Vo .l 18　No. 3
2007年 9月 CHEM ICAL　RESEARCH Sep. 2007
岩白菜素与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱研究
罗红斌 1 , 张 静 2 ,陈敬华 1* ,李光文 1 ,林小燕 1
(1.福建医科大学药学院 ,福建福州 350004;2.福建卫生职业技术学院 ,福建 福州 350101)
收稿日期:2007 - 05 - 10.
基金项目:福建省教育厅科研基金资助项目(2005K051);福建省卫生厅青年科研基金资助项目(2005123).
作者简介:罗红斌(1963 -),女 ,研究方向:主要从事药物分析研究. *通讯联系人 , E-m ai l:cjh_huaxue@126. com.
摘　要:应用荧光光谱研究了岩白菜素与牛血清白蛋白(BSA)分子间的相互作用. 结果表明 , 岩白菜素对 BSA
内源荧光的猝灭机制属于形成化合物所引起的静态猝灭 , 猝灭常数 K sv为 1. 905×104 L m o l- 1;岩白菜素与
BSA反应的结合常数为 2. 083×104 , 结合位点数为 1. 由热力学参数确定了岩白菜素与牛血清白蛋白的结合作
用主要为静电作用. 实验还发现随着岩白菜素的加入 , BSA的猝灭值与岩白菜素浓度在 1. 5×10- 5 ～ 1. 5 ×10- 4
m o l L - 1的范围内呈良好的线性关系 ,检出限 2. 0×10- 6 m ol L - 1 ,可用于岩白菜素的测定.
关键词:荧光光谱;岩白菜素;牛血清白蛋白
中图分类号:O 657 文献标识码:A 文章编号:1008 -1011(2007)03 - 0087 - 04
Investigation of the Interaction Between Bergenin and
Bovine Serum A lbum in by F luorescence Spectrum
LUO Hong-bin1牞ZHANG Jing2牞CHEN Jing-hua1*牞LIGuang-wen1牞LIN X iao-yan1
牗1. Depa rtm en t of Pharm aceut ica lAna lysis牞Fu jianM ed ica lUn iversity牞F uzhou 350004牞Fu jian牞Ch ina牷
2 Fu jian Co llege o fMedica lO ccupat ion and Techno logy牞Fuzhou 350001牞F ujian牞Ch ina牘
Abstrac t牶The mechanism of interaction be tw een bergen in牗BER牘 and bov ine serum album in牗BSA牘
was investiga ted w ith fluo rescence spectrome try. The expe riments show ed that the selected be rgenin
strongly quenched the fluorescence o f prote in牞and this fluorescence quenching could be interpre ted in
term s of statistic quenching. W ith fluorescence quenching method牞the quenching constantK was found
to be 1. 905×104 L爛mo l-1牞the binding constant w as found to be 2. 083 ×104牞 and the numbe r of
binding site n was 1. 0. The interaction between BER and pro tein w as a ttribu ted to the sta tic e lec tricity
grav itation wh ich w as also confirmed by the ca lculation resu lts o f enthalpy and entropy fo r these reac-
tions. Adding bergenin in to the BSA so lution resu lts in the decrease of fluorescence intensity. The de-
crease o f fluorescence in tensity is proportiona l to BER concentration from 1. 5×10- 5 ～ 1. 5×10-4mg
爛L - 1. The lim it o f the de tection is 2. 0×10- 6 mol爛L -1. Thisme thod can be app lied to the de term ina-
tion of BER.
Keywords牶fluo rescence spectrome try牷bergenin牷bovine serum album in
　　血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白 ,药物进入血浆后 ,首先与血清白蛋白结合 ,然后再被
运送到身体的各部位. 随着药代动力学及临床药理学的迅猛发展 ,关于药物与蛋白质结合对药代动力学的
影响 ,人们又有了更深刻的认识. 因此 ,研究药物与血清白蛋白的相互作用有重要意义 [ 1] . 荧光光谱法是研
究生物大分子 ,特别是蛋白质与各种有机小分子 、离子或无机化合物相互作用的重要手段. 通过对荧光光谱
DOI牶牨牥牣牨牬牥牥牪牤j牣hxya牣牪牥牥牱牣牥牫牣牥牪牱
88　 化　学　研　究 2007年
法的研究 ,可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类 、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息 ,同时
还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据.
图 1　岩白菜素的结构式
F ig. 1　The structu re of bergen in
岩白菜素(bergenin, BER)为白色疏松的针状晶体 ,主要来
源于虎耳草科岩白菜属药用植物岩白菜和原叶岩白菜中 ,结构
见图 1. 岩白菜素具有镇咳 ,祛痰等功效. 临床主要用于治疗慢
性支气管炎和慢性胃炎 ,对胃和十二指肠溃疡等亦有疗效 [ 2] .
但迄今为止尚未见有关岩白菜素与蛋白间相互作用的报道. 因
此 ,作者通过荧光光谱技术 , 研究岩白菜素与牛血清白蛋白
(BSA)间的相互作用 ,探讨岩白菜素与 BSA作用的机制 ,测定
其荧光猝灭常数 ,测定岩白菜素与 BSA作用的结合常数和结合
位点数.
1　实验部分
1. 1　试剂与仪器
牛血清白蛋白(S igma公司 ),岩白菜素对照品(中国药品生物制品检定所 ),三羟甲基氨基甲烷 、盐酸 、氢
氧化钠等均为分析纯 ,二次蒸馏水. M 2850型荧光分光光度计(日本日立公司 ), pHS210A数字酸度 /离子计
(上海雷磁仪器厂 ),可调式移液器(0. 5 ～ 10μL,美国 Thermo公司).
1. 2　实验方法
配制 0. 05mo l L -1 Tris缓冲液(内含 0. 01mo l L- 1 NaC l, pH =7. 0). 分别用该 Tris缓冲液配制浓度为
2. 5×10 -6 mo l L -1 BSA溶液和浓度为 3. 0×10- 3 mol L - 1的岩白菜素溶液.
移取 2mL 2. 5×10- 6 mo l L -1的 BSA于 1 cm石英比色池中 ,用可调式移液器逐次加入 2 , 4, 8, 10, 16,
20 , …, 100μL的岩白菜素溶液进行荧光滴定 ,每次加入溶液后混合均匀 ,在 30 ℃下作用 10 m in,以 292 nm
为激发波长 ,在 M2850型荧光分光光度计上记录 300 ～ 500 nm波长范围内的发射光谱.
[ BSA] =2. 5×10 - 6 m ol L- 1;[ BER] = 3. 0×10 - 3m o l L- 1
Vo lum e of bergen in:a, 0;b, 10 μL;c:20μL;d, 30μL;
e, 40μL;f, 50μL;g, 60μL;h, 100 μL
图 2　 (A)岩白菜素对牛血清白蛋白的荧光猝灭作用;
(B)荧光猝灭值和岩白菜素浓度的线性关系图
F ig. 2　 (A) Effect of bergenin on fluo rescence spec tra o f BSA;
(B) The linear re lationship betweenΔF and c(BER)
2　结果与讨论
2. 1　岩白菜素对 BSA荧光猝灭的机理
由于蛋白质中存在色氨酸和酪氨酸 ,使其具有
内源荧光 ,当固定 BSA的量不断增加岩白菜素的浓
度时 , BSA内源荧光(其 346 nm处的荧光发射峰 )强
度有规律的降低 ,而荧光光谱发射峰的峰位不变 ,见
图 2A. 由图 2可知岩白菜素对 BSA的荧光有猝灭作
用. 实验还发现其猝灭值与岩白菜素的浓度在 1. 5
×10-5 ～ 1. 5×10-4 mo l L -1的范围内呈良好的线
性关系 (图 2B):ΔF =13. 628c + 84. 473, R =
0. 992 4,检出限 2. 0×10-6 mo l L -1. 同时这种方法
也可用于岩白菜素的测定.
若将岩白菜素溶液对 BSA荧光的猝灭归因于分
子碰撞引起的动态猝灭 ,按照 S te rn-Vo lmer方程
F 0 /F =1 +K qΓ0 [Q ] =1 +K sv[Q ] (1)
式中 K q为双分子猝灭过程速率常数 , Γ0为不存在猝
灭剂时物质的荧光寿命 ,K sv为动态猝灭常数 , [ Q ]
为猝灭剂的浓度 ,显然有 K sv=K qΓ0. 由于滴定时 ,岩白菜素的累积体积为 100 μL,远小于 2 mL BSA的体
积 ,可忽略滴定过程中的体积变化. 以 F0 /F对 [Q ]绘图 ,得到图 3.
曲线方程为:F 0 /F =0. 190 5[Q ] +0. 872, R =0. 998 2. 可以求出K sv=1. 905×104 L mo l- 1 ,由于生物
大分子荧光平均寿命大约为 10-8 s[ 3] ,因而可以求得K为 1. 905×1012(L mo l-1) s-1 ,而各类猝灭剂对生
第 3期 罗红斌等:岩白菜素与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱研究 89　
物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为 2. 0×1010(L mo l-1) s- 1[ 3] . 显然 ,岩白菜素对 BSA荧光猝灭的过
程速率远大于扩散控制的 K q ,由此可以推断 ,猝灭过程为形成化合物所引起的静态猝灭 ,不是由于分子碰撞
所引起的动态猝灭.
2. 2　确定结合常数和结合位点数
小分子与血清中蛋白质分子存在非共价键作用 ,这种作用多采用位点结合模型解释. 根据此模型[ 4 - 5] ,
有:
r =nK [ S] /(1 +K [ S] ) (2)
式中:r为平均结合数 ,K为结合常数 , n为结合位点数 ,即一个生物大分子能结合小分子的数目 , [ S]为溶液
中小分子物质的游离浓度. 上式可改写成:
r /[ S] =Kn - K r (3)
式 (3)即为著名的 Scatchard方程[ 6] . 在所考虑的波长范围内 ,若体系的荧光仅由 BSA产生 ,那么有:
F 0 /F =[ Pt ] /[ P ] (4)
按 r的定义 ,则有:
r =([ S t] - [ S] ) /[ Pt ] =n([ Pt] - [ P] ) /[ Pt] =n(F0 - F) /F 0 (5)
上述式子中 , [ S t]表示体系中小分子的总浓度 , [ Pt]表示 BSA的总浓度 , [ P]为游离蛋白质 (BSA)的浓度 , F 0
和 F分别表示不加入和加入小分子物质的 BSA的特征峰发射强度. 从式 (3)和式(5),可以得到:
F0 /F =K [ S t]F 0 /(F 0 - F) - nK [ P t] (6)
固定 BSA的总浓度 [ Pt ] ,改变岩白菜素的浓度 [ St ] ,根据式 (6),以 F 0 /F为纵坐标 ,以 [ St ]F0 /(F 0 -F)为横
坐标 ,可以得到线性回归图 (图 4),由直线的斜率和截距即可确定结合常数 K和结合位点数 n[ 6] .
[ BSA] =2. 5×10 -6 mo l L- 1 , 30℃, pH =7. 0
[ Q] =0, 1. 5, 3. 0, 4. 5, 6. 0, 7. 5, 9. 0, 15. 0×10- 5m ol L -1
图 3岩白菜素对 BSA荧光猝灭的 S tern-Vo lme r图
F ig. 3　Stern-Vo lmer plo ts of fluorescence
quenching of BSA by BER
图 4　岩白菜素对 BSA荧光
猝灭的 Scatcha rd图
F ig. 4　Scatcha rd p lo ts fluo re scence quench ing
o f BSA by bergenin
　　在上面的岩白菜素猝灭 BSA荧光实验中 ,可以忽略滴定过程中 BSA的浓度变化. 从图 2可以看出 ,岩
白菜素的加入使 BSA的荧光有规律地猝灭 ,而荧光的最大发射峰位置未发生明显的位移. 用公式 (6)处理
λm ax (346 nm)处的荧光强度 , 得到图 4. 该一元线性回归方程为:F 0 /F =0. 208 3 [ St ] F0 /(F 0 -F ) -
0. 511 9,相关系数为 0. 998 2,从直线的斜率和截距求出 , 30 ℃时 ,岩白菜素与 BSA作用的结合常数 K =
2. 083×104 ,结合位点数 n为 0. 98,即存在一个结合位点.
2. 3　蛋白质与岩白菜素主要作用力的确定
药物与大分子的作用力类型[ 7]包括氢键 、范德华力 、疏水作用力和静电引力等. 当温度变化不大时 ,反
应的焓变 ΔH可以看作一个常数 ,根据热力学参数方程:ln(K 2 K/ 1)=ΔH /R (1 /T1 - 1 /T2), ΔG =ΔH -TΔS ,
ΔG =-RT lnK ,可以求得 ΔH和 ΔS. 本实验求得 20℃, 30 ℃时 K值分别为 2. 833×104和 2. 083×104 ,岩白
菜素与 BSA的 ΔH、ΔS分别为 - 22. 70 kJ mo l- 1 , 7. 75 J mo l-1 K -1. 岩白菜素与蛋白质的焓变 ΔH <0,
熵变 ΔS >0. 根据热力学参数与作用力的关系 ,可知岩白菜素与 BSA结合的作用力类型主要是静电引力[ 3] .
3　结论
实验结果表明 ,岩白菜素对牛血清白蛋白的荧光产生猝灭 ,且猝灭过程是由形成化合物而引起的静态猝
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灭. 通过对岩白菜素与牛血清白蛋白作用的热力学参数的计算 ,发现二者主要为静电作用力结合 ,为研究和
了解生物大分子与药物小分子作用的化学本质提供了依据. 实验还发现其猝灭值与岩白菜素的浓度在 1. 5
×10-5 ～ 1. 5×10-4 mo l L -1的范围内呈良好的线性关系 ,检出限 2. 0×10-6 mo l L - 1. 有望建立岩白菜素
含量测定的荧光分析新方法.
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