全 文 ：收稿日期:2007-05-15初稿;2008-01-10二改稿
基金项目:上海市绿化管理局(林业局)项目资助(F040202)
作者简介:张冬梅(1970-),女 ,博士 ,高级工程师 ,主要研究方向:林木遗传育种。 E-mai l:zdm0512@sohu.com;T el:(021)54352793
上海农业学报　2008 , 24(1):51-54
Acta Agriculturae Shanghai
文章编号:1000-3924(2008)01-51-04
槭属树种 ISSR-PCR反应体系的确立
张冬梅1 ,魏华丽1 , 2 ,苏金乐2 ,钱又宇1
(1 上海市园林科学研究所 ,上海 200232;2 河南农业大学林学园艺学院 , 郑州 450002)
摘　要:采用改良 CTAB 法提取槭属树种总 DNA ,分析了 Taq 聚合酶 、样本浓度 、Mg2+浓度 、dNTP浓度以
及引物浓度对 ISSR-PCR扩增结果的影响 , 用四因素三水平正交法确定了 Taq 酶浓度 、引物浓度 、Mg 2+浓度 、
dNTP 浓度的最佳组合 ,并优化模板浓度 , 建立了稳定 、可重复的槭属树种 ISSR-PCR 最佳反应体系及 PCR扩增
参数。 ISS R-PCR的最佳反应体系为:在 10 μL 的反应体系内 , Taq聚合酶宜加入 0.25 U , dNTP 最适浓度为 0.3
mmo l/ L , 模板最适浓度为 4 ng/μL , 引物最适浓度均为 0.5 μmol/ L , 不同的引物有其各自合适的Mg2+浓度。槭
属树种 ISSR-PCR 引物筛选及反应体系的建立 , 为利用 ISSR 标记技术开展槭属树种的系统进化和亲缘关系研
究提供一个强有力的工具。
关键词:槭属树种;ISSR-PCR;反应体系
中图分类号:S792.35　　　文献标识码:A
The establishment of ISSR-PCR system of Acer trees
ZHANG Dong-mei1 , WEI Hua-li1 , 2 , SU Jin-le2 , QIAN You-yu1
(1Shanghai Garden Research Insti tute , S hanghai 200232 , China;2Collegeo f Forestry and Hort i-
culture , Henan Agricultural University , Zhengzhou 450002 , China)
Abstract:The to tal DNAs of Acer t rees w ere ex t racted by the improved CTAB method , and the
ef fects o f Taq enzyme concentrat ion , template concentrat ion , Mg 2+ concentration , dNTP concentration ,
and primer concentration on the result of ISS R-PCR amplif icat ion we re studied in order to establish a
stable and repeatable optimal ISSR-PCR sy stem and paramete rs of PCR ampli ficat ion.Through o rthogo-
nal comparisons of 4 factors and 3 levels i t w as concluded that under the 10 μL react ion system the ap-
propriate Taq polyme rase w as 0.25 U and the optimal concentrat ions w ere 0.3 mmo l/L dNTP , 4 ng/μL
template and 0.5 μmol/ L primer.And the appropriate Mg 2+ concentration depended on the used prim-
er.The establishment of the sy stem could provide a pow erful tool to study the sy stematic evolution and
kindred of Acer trees.
Key words:Acer t rees;ISS R-PCR;Optimization of sy stem
槭属(Acer L.)植物叶色秀美 ,叶形多变 ,翅果雅致 ,具较高的观赏价值 ,作为园林绿化树种越来越受
到人们的亲睐。目前国内对槭属树种以鸡爪槭 、元宝枫 、秀丽槭等国内树种的研究居多 ,多集中在引种 、
栽培技术 、生理 、形态学以及分类等方面[ 1-3] ,鲜见利用分子水平对多种槭属树种进行系统研究。
简单重复间序列(Inter-Simple Sequence Repeat)是一种基于聚合酶链式反应的分子标记技术 ,目前
被广泛应用到春兰 (Cymbidium goeringi i)[ 4] 、长筒石蒜(Lycoris longi tuba)[ 5] 、落叶松(Lari x gmel i-
ni i)[ 6]等植物的研究中 。在槭属树种中 ,Zhao Linsen等[ 7] 利用 RAPD找到一些与复叶槭(A.negundo)
性别基因相关的标记;李珊等[ 8] 优化出庙台槭(A.miaotaiense)RAPD反应体系并对庙台槭自然居群的
遗传多样性进行了研究;TIAN Xin等[ 9] 在槭树科 41种(槭属 39种)植物的 t rnL-F 和 I TS序列的基础上
张冬梅 ,等:槭属树种 ISSR-PC R反应体系的确立
探讨了槭树科的系统发育 。目前 ,利用 ISS R标记对多种槭属树种的系统研究还未见报道。本研究旨在
通过对槭属树种 ISSR-PCR稳定反应体系的建立 ,为利用该技术开展槭属植物的亲缘关系 、遗传多样性
以及辅助育种等方面的研究奠定基础。
表 1　槭属 17个种及品种的采集地点
Table 1　Plant materials used for ISSR analysis
编号
Number
种名
Specif ic name
学名
Scient if ic nam e
采集地点
Site of col lection
1 秀丽槭 Acer elegantulum 陈行苗木基地
2 鸡爪槭 A.palmatum 同上
3 红花槭`夕阳红 A.rubrum`Red Sunset 鲁汇苗木基地
4 杂种槭`秋焰 A.rubrum`Autumn Blaze 同上
5 红花槭`十月光荣 A.rubrum`Octob er Glory 同上
6 挪威槭`红哨兵 A.p latanoides` Crismon S en try 同上
7 挪威槭`夕阳 A.p latanoides` Norw egian Sun set 同上
8 杂种槭`太平洋落日 A.p latanoides` Pacific S unset 同上
9 挪威槭`金色普林斯顿 A.P la tanoid es` Princeton Gold 同上
10 挪威槭`正红 A.p latanoides` Royal Red 同上
11 复叶槭`火烈鸟 A.negund o` Flamingo 同上
12 樟叶槭 A.cinnamomi f olium 上海市植物园
13 五角枫 A.mono 同上
14 三角枫 A.buerger ianum 同上
15 元宝枫 A.t runca tum 同上
16 青榨槭 A.davidi i 同上
17 复叶槭 A.negundo 同上
1　材料 与方 法
1.1　材　料
材料取自上海市园林科
学研究所苗木基地和上海市
植物园。用于总 DNA 提取的
材料共17个种(品种)(表 1)。
采取幼嫩叶片 , 置于冰盒中 ,
带回实验室。将叶片洗净 ,晾
干 ,剪去主脉 , 编号放于密封
袋中 ,放置于 -80 ℃冰箱中
保存备用 。
1.2　方　法
1.2.1　DNA提取和检测
植物总 DNA 提取采用改
良的 CTAB 法[ 10] 。用 1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA ,紫外分析装置拍照 。紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 ,根
据公式 OD=A 260 A 280和 DNA浓度(ng μL)=A2 60×50×稀释倍数 ,计算 OD值和浓度。
1.2.2　ISSR-PCR 扩增
PCR 扩增程序:94 ℃预变性 360 s ,然后94 ℃变性 70 s , 60 ℃复性(退火)100 s ,72 ℃延伸 70 s , 40个
循环;72 ℃延伸 390 s ,以保证延伸彻底。正交法优化反应体系[ 11] ;引物序列参照加拿大哥伦比亚大学
(UBC)设计 ,上海生工生物技术公司合成 。
图 1　槭树 17个种(品种)DNA 电泳图谱
F ig.1　The electr ophoresis of DNAs
f rom 17 maple species (var ie ties)
2　结果 与分 析
2.1　DNA提取方法
通过对槭属 17个种(及品种)总 DNA的提
取 ,OD 值为 1.7 ～ 2.0 ,样品中蛋白质和酚类物
质去除比较干净 。采用 1.0%的琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA 结果表明(图 1),条带清晰 ,没有
拖尾现象 。改良的 CTAB法能很好地去除多糖
多酚类次生代谢物 ,适于槭属植物 DNA 的提取。
表 2　四因素三水平正交设计表
Table 2　The orthogonal design of 4 factors and 3 levels for ISSR
组合编号
Combinat ion no.
Taq酶
U
dNTP
mmol· L -1
Mg2+
mmol· L -1
Primer
μmol · L-1
1 0.25 0.2 1.5 0.4
2 0.25 0.4 2.0 0.6
3 0.25 0.3 2.5 0.5
4 0.50 0.2 2.0 0.6
5 0.50 0.3 2.5 0.4
6 0.50 0.4 1.5 0.5
7 0.75 0.2 2.5 0.5
8 0.75 0.3 1.5 0.6
9 0.75 0.4 2.0 0.4
2.2　ISSR-PCR反应体系优化
2.2.1　正交法优化四因素组合
选取形态上差异较大的红花槭`夕阳红
和复叶槭`火烈鸟品种作模板 ,模板浓度稀释
至 50 ng μL ,用 L34 正交表(表 2),每个组合
2次重复 。
根据 2个模板正交设计电泳图谱(图 2 ,
3)的综合表现 ,确定最佳组合为 No.3:10 μL
反应体系中 , Taq 酶 0.25 U , dNTP 浓度
0.3 mmol L ,Primer 浓度 0.5 μmol L ,Mg2+
浓度为 2.5 mmol L 。
52 24 卷　
上　　海　　农　　业　　学　　报
　　M 为 marker , 1～ 18分别为正交设计的 9个组合 ,每个组合 2个重复(图 3同)。
M is m ark er;1～ 18 are respectively 9 combinat ions of orthogonal design and each combination repeats once.
图 2　以红花槭`夕阳红 为模板的正交产物扩增凝胶图谱
Fig.2　Gel electrophoresis of orthogonal product ampl ification
by using A.rubrum` Red Sunset as template
图 3　以复叶槭`火烈鸟 为模板的正交产物扩增凝胶图谱
Fig.3　Gel electrophoresis of orthogonal product amplification
by using A.negundo` Flamingo as template
2.2.2　模板浓度的确定
根据正交设计出的四个因素最佳组合 , 采用单因素梯度法 , 设置 5 个模板浓度水平:1 、2 、3 、4 、
5 ng μL ,根据凝胶中条带数目的多少以及清晰度和表现的稳定性 ,确定最佳模板浓度 。
在红花槭`夕阳红 上 ,随着模板浓度的增加 ,条带逐渐清晰 ,数目逐渐增多 , 4 、5 ng μL 表现较好;在
复叶槭`火烈鸟 上 ,随着模板浓度的增加 ,条带数目则逐渐减少 ,1 ng μL 条带不够清晰 , 2 、4 ng μL 表现
较好 。根据 2个模板的综合表现 ,确定最佳模板浓度为 4 ng μL (图 4)。
2.2.3　最佳退火温度的筛选
从图 5看出 ,在 50 ～ 65 ℃范围内 ,退火温度较低时 ,条带模糊 ,弥散现象严重;退火温度较高时 ,条带
数目少或无。根据条带的清晰度和数目 ,17 、18泳道表现最好 ,确定引物 881的最佳退火温度为 62.7 ℃。
2.2.4　引物筛选
表 3　不同引物的镁离子浓度
Table 3　The concentration of Mg2+ for di fferent primers
引物编号
Primer n o.
碱基序列
Base sequence
Mg2+浓度 mmol· L-1
C on cen t rat ion of Mg2+
807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 1.5
808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 1.5
810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 1.5
811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 2.0
812 GAG AGA GAG AGA GAG AA 1.5
813 CTC TCT CT C TCT CTC T T 3.0
825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 1.5
827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 3.0
864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG 3.0
881 GGG TGG GGT GGG GTG 2.5
899 ACT T CC CCA CAG G TT AAC ACA 3.0
　　利用秀丽槭 、红花槭`夕阳红 、
杂种槭`秋焰 和复叶槭`火烈鸟 4
个品种的 DNA 为模板 ,从 33个引
物中筛选出 11个适于 17 个槭属树
种PCR扩增的引物 ,从 1.5 、2.0 、2.
5 、3.0 mol L 中确定每个引物的最
佳 Mg 2+浓度(表 3)。
2.2.5　扩增 17个种及品种
经过扩增条件和反应体系的
优化 , 可得到最适 的槭属 树种
ISS R-PCR反应体系为:dN TP 为
53　1期
张冬梅 ,等:槭属树种 ISSR-PC R反应体系的确立
0.3 mmol L ,样本 DNA 为 40 ng , Taq DNA 聚合酶为 0.25 U ,引物为 0.5 μmol L , 10×PCR Buffer
1μL ,Mg2+浓度如表 3所示 ,ddH 2O补足 10 μL 。用筛选出来的 11条引物 ,进行 17个种及品种的 PCR
扩增 ,图 6为引物 881对 17个槭树树种的 PCR扩增电泳图。
图 6　引物 881对 17个槭树树种 PCR 扩增产物的凝胶电泳图谱
Fig.6　ISSR-PCR amplificat ion of 17 map le species with primer 881
3　结论 与讨 论
槭属植物中 , 次生代谢物质含量较
高 , 特别是多糖多酚类等物质含量较
多[ 8] ,在 DNA 提取过程中易与 DNA 共
沉淀 ,形成粘稠的胶状物 ,难以溶解或产
生褐变[ 12] 。CTAB-free 提取液洗去一部
分多糖 ,并且提高 CTAB含量至 4%以达
到有效去除多糖的目的。通过试验 ,改良的 CTAB法适合槭属植物的 DNA 提取 ,能获得纯度高并杂质
少的 DNA 样本 。
研究分析了 Taq聚合酶 、样本浓度 、Mg2+浓度 、dNTP 浓度以及引物浓度对 ISSR-PCR扩增结果的影
响 ,先用四因素三水平正交法确定 Taq酶浓度 、引物浓度 、Mg2+浓度 、dNTP 浓度的最佳组合 ,再优化模板
浓度 ,筛选出扩增条带清晰 、多态性丰富的 ISSR引物11个 ,建立了稳定的 、可重复的槭属植物 ISSR-PCR
最佳反应体系及 PCR 扩增参数。最后确立了槭属树种 ISSR-PCR的最佳反应体系为:在 10 μL 的反应
体系内 , Taq 聚合酶宜加入 0.25 U ,dNTP 最适浓度为 0.3 mmol L ,模板的最适浓度为 4 ng μL ,单引物
的最适浓度均为 0.5 μmol L ,不同的引物有其各自合适的 Mg2+浓度 。PCR 扩增程序:94 ℃预变性
360 s;94 ℃变性 70 s ,退火温度(引物 881的最佳退火温度为 62.7 ℃)复性 100 s , 72 ℃延伸 70 s ,40个循
环;72 ℃延伸 390 s。
统计利用所选 11个引物 ,对槭属 17个品种的总 DNA 进行提取并进行了 ISSR-PCR扩增 ,通过 6%
的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测 ,每对引物扩增产物在 200 ～ 2 000 bp之间的等位谱带数最大为15 ,最小
为 2 ,不同槭属树种的 DNA 谱带多态性丰富。利用该方法 ,为槭属树种及品种的亲缘关系和系统进化研
究奠定基础。
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