全 文 ：冬虫夏草与亚香棒虫草的分子及化学指纹图谱鉴别
钟 欣 招淑燕 刘 昕
（中山大学生命科学学院 广州 510275）
摘 要 目的：从遗传本质和化学成分两个角度对冬虫夏草进行真伪鉴别。 方法：采用核糖体基因（rDNA）测序
和高效液相色谱（HPLC）指纹图谱对冬虫夏草、亚香棒虫草及市场中贩卖的所谓“冬虫夏草”样品进行检测。 结
果：冬虫夏草与亚香棒虫草的 rDNA 序列相似度为 80.5%~81.0%，HPLC 指纹图谱的相似度低于 47.9%，市场中
贩卖的所谓“冬虫夏草”，实质上是亚香棒虫草。
关键词 冬虫夏草 亚香棒虫草 rDNA HPLC
文章编号 1009-7848（2009）01-0175-08
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌[Cordy-
ceps sinensis（Berkeley）Saccardo]寄生在鳞翅目蝙
蝠蛾科蝠蛾属（Hepialus）幼虫上形成的虫生子囊
真菌，产于青藏高原高海拔区域，是我国传统的名
贵中药材。 由于冬虫夏草具有特殊的药理作用和
治疗功效， 市场上出现了许多与冬虫夏草形态相
似的伪品， 其中亚香棒虫草 （Cordyceps hawkesii
Gray）是最为常见的伪品。
亚香棒虫草又称霍克斯虫草， 其寄主为鳞翅
目蝙蝠蛾科棒蝠蛾属（Napialus）幼虫，分布于湖
南、江西、湖北、安徽、浙江、福建、广东等省山区及
丘陵低海拔区域。 亚香棒虫草与冬虫夏草在形态
上相似，常被不法商贩冒充冬虫夏草出售，但在遗
传本质、化学成分等方面两者有较大差别。
对于冬虫夏草的真伪鉴别和质量控制已有较
多的报道，如采用薄层色谱、气相色谱、高效液相
色谱等分析方法，检测的指标物有核苷、多糖、麦
角甾醇、甘露醇、多肽等化合物[1~2]。 但这些化合物
在冬虫夏草药理功效中的作用还不明确。 2005年
版《中华人民共和国药典》规定的腺苷（Adenosine）
及上述化合物单独作为指标物， 均不能客观评价
冬虫夏草的真伪优劣[1]。 迄今为止，结合分子生物
学和化学指纹图谱的方法对冬虫夏草进行真伪鉴
别的报道较少。 本文采用核糖体基因（ribosomal
DNA， rDNA）测序和高效液相色谱（High Perfor-
mance Liquid Chromatography，HPLC）指纹图谱鉴
别冬虫夏草和亚香棒虫草。
1 材料与方法
1.1 样品
冬虫夏草样品分别采自西藏那曲（Cs1）、青海
玉树（Cs2）；亚香棒虫草样品（Ch）采自湖南醴陵；
市场中贩卖的所谓“冬虫夏草”样品分别购于西藏
林芝地区松多镇商贩（S1）及广州某国际博览会展
位 （S2）； 对照蛹虫草 [Cordyceps militaris （L.）
Link]样品（Cm）购于广东省江门市新康虫草有限
公司。上述样品均由笔者采集及购买，经中山大学
生命科学学院古德祥教授鉴定， 保存于中山大学
食品与健康工程研究院。
1.2 rDNA测序分析
将样品 Cs1、Cs2、Ch、S1、S2、Cm 表面消毒后，
各取 50 mg 在液氮中研成粉末，用真菌 DNA 小量
提取试剂盒 （Fungal DNA Mini Kit，Omega 生物
技术公司）提取样品总基因组 DNA。 PCR 反应以
ITS5/ITS4 作引物（ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCG-
TAACAAGG -3；′ ITS4：5′ -TCCTCCGCTTATTGA
TATGC-3′）[3]， 以 10 ng总基因组 DNA作模板，退
火温度 58 ℃，共 30个循环。 PCR产物经琼脂糖凝
收稿日期： 2009-02-15
基金项目： 国务院扶贫办项目（2008-3A）；国家科技部
“十一五”科技支撑计划项目（2007BAI32B06）
作者简介： 钟欣，男，1983 年出生，博士生
通讯作者： 刘昕
Vol． 9 No． 1
Feb ． 2 0 0 9Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中 国 食 品 学 报第 9 卷 第 1 期
2 0 0 9 年 2 月
DOI:10.16429/j.1009-7848.2009.01.036
中 国 食 品 学 报 2009 年第 1 期
胶电泳后， 用 DNA 凝胶回收试剂盒 （DNA Gel
Extraction Kit， Axygen 科学公司） 回收扩增产
物 ， 将产物连接到 T-载体 （pMD-19T-vector，
TaKaRa）中，并转化到大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞中，挑单菌落，通过摇菌培养，经酶切及 PCR 鉴
定阳性转化子， 送往上海英骏生物技术有限公司
（Invitrogen）测序。 将测序结果输入基因序列数据
库 （GenBank）进行序列相似性检索 （Basic Local
Alignment Search Tool， BLAST），同时输入 DNA-
MAN序列分析软件，采用 Kimura[4]计算方法分析
序列相似度。
1.3 HPLC指纹图谱分析
将样品 Cs1、Cs2、Ch、S1、S2、Cm 表面清洁后
置烘箱中 45 ℃干燥至质量恒定， 分别研磨成粉
末，过 150目筛。称取 0.1 g样品粉末，分 2次共加
入 10 mL 超纯水 （Millipore Milli -Q Advantage
A10），室温超声振荡提取 3 h，10 000 r/min 离心 5
min， 取上清， 过 0.45 μm 滤膜， 滤液上样 HPLC
（Waters 2515 and PDA 2996）进行色谱分析。 核
苷及其碱基标准品（Sigma-Aldrich 化学公司）包括
尿苷（Uridine）、肌苷（Inosine）、腺嘌呤（Adenine）、
腺苷 （Adenosine）、 鸟苷 （Guanosine）、 虫草素
（Cordycepin）。 色谱条件：色谱柱为安捷伦 C18 柱
（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18， 250 mm×
4.6 mm， 5 μm）， 保护柱芯为安捷伦 C18 保护柱
（Agilent Eclipse XDB -C18，12.5 mm ×4.6 mm，5
μm）；流动相：A 溶液为磷酸钠溶液（含 20 mmol/L
磷酸二氢钠和 20 mmol/L 磷酸氢二钠， 广州化学
试剂厂），B 溶液为色谱纯甲醇（Sigma-Aldrich 化
学公司）； 梯度洗脱条件：t=0～10 min，0% B；t=10～
30 min，0%～8%B；t=30～60 min，8%～60%B （t 为时
间）；检测波长 260 nm；流速 1.0 mL/min；进样体积
20 μL；柱温 30℃。方法的精密度和重现性以保留
时间和峰面积计，RSD均小于 5％，样品测试 3次。
色谱数据输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统
A 版（国家药典委员会 2004 年版）进行相似度分
析。
2 结果与分析
2.1 rDNA序列比对结果
通用引物 ITS5/ITS4 获得的 PCR 产物序列长
591~680 bp，包括 rDNA 基因小亚基（Small sub-
unit RNA， SSU）的部分序列，转录间隔区 1（In-
ternal Transcribed Spacer1， ITS1）、5.8S rDNA 和
转录间隔区 2（ITS2）的全序列以及大亚基（Large
subunit RNA， LSU）的部分序列。
将 Cs1、Cs2、Ch、Cm 的测序结果与 GenBank
登录的冬虫夏草、 亚香棒虫草、 蛹虫草 rDNA 序
列[5~9]进行 BLAST比对，结果显示，Cs1、Cs2 与冬虫
夏草相似度均在 97%以上，Ch 与亚香棒虫草序列
的相似度高于 95%，Cm 与蛹虫草序列相似度在
96%以上。
样品序列比对情况见图 1。 对于序列相似度
高于 99%的样品，只列出其中一个样品的序列。样
品序列相似度见表 1。 Cs1、Cs2 与 Ch、Cm 之间的
相似度在 80.5~81.3%之间，S1、S2 与亚香棒虫草
rDNA序列相似度高于 99.7%。
Cs1 * 99.2 80.5 80.6 80.6 80.8
Cs2 * 81.0 81.1 81.1 81.3
Ch * 99.7 99.9 82.7
S1 * 99.9 82.9
S2 * 82.9
Cm *
Cs1 Cs2 Ch S1 S2 Cm
样品
样品间序列相似度/%
表 1 冬虫夏草等样品 rDNA 基因 ITS5/ITS4 间序列相似度
Table 1 The similarities of rDNA sequence between primers ITS5/ITS4 from Cordyceps samples
176
第 9 卷 第 1 期 冬虫夏草与亚香棒虫草的分子及化学指纹图谱鉴别 177
中 国 食 品 学 报 2009 年第 1 期
注：“.”比对需要引入的空隙；“-”相同的碱基。
图 1 冬虫夏草等样品 rDNA 基因 ITS5/ITS4 间序列比对
Fig.1 Sequence alignment of rDNA between primers ITS5/ITS4 from Cordyceps samples
2.2 HPLC指纹图谱比对结果
HPLC指纹图谱相似度分析结果见表 2。样品
Cs1与 Cs2 的相似度为 95.5%；Cs1、Cs2 与 Ch、Cm
之间的相似度均低于 47.9%，其中 Ch 与 Cm 相似
度仅 18.6%； 样品 Cs1、Cs2 与 S1、S2 的相似度为
71.9%~88.2% ； 而 S1、S2 与 Ch 的相似度仅为
43.3%。
Cs2 * 46.6 71.9 78.0 41.3
Ch * 43.3 43.3 18.6
S1 * 89.7 50.1
S2 * 42.7
Cm *
Cs1 * 95.5 47.9 80.6 88.2 47.7
样品
样品指纹图谱相似度/%
Cs1 Cs2 Ch S1 S2 Cm
表 2 冬虫夏草等样品 HPLC 指纹图谱相似度比较
Table 2 The similarities of HPLC fingerprint from Cordyceps samples
178
第 9 卷 第 1 期
Cs1Ur
Gu
A
In
Ad
0.015
0.010
0.005
0.000
吸
光
值
/A
U
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
（a）
时间/min
Cs2Ur
Gu
A
In
Ad
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
（b）
时间/min
吸
光
值
/A
U
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
Ch
Ur
Gu
A
Ad
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
（c）
时间/min
吸
光
值
/A
U
0.040
0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
S1
Ur Gu
Ad
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
（d）
时间/min
吸
光
值
/A
U
0.050
0.040
0.030
0.020
0.010
0.000
冬虫夏草与亚香棒虫草的分子及化学指纹图谱鉴别 179
中 国 食 品 学 报 2009 年第 1 期
Ur
Gu
Ad
吸
光
值
/A
U
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
（e）
时间/min
S20.08
0.06
0.04
0.02
0.00
Ur
Gu
Ad
吸
光
值
/A
U
时间/min
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
（f）
A
Co C0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
注：Ur： 尿苷 A： 腺嘌呤 In： 肌苷 Gu： 鸟苷 Ad： 腺苷 Co： 虫草素。
图 2 冬虫夏草等样品水提取液的 HPLC 色谱图
Fig.2 Chromatograms of water-soluble components from Cordyceps samples
3 讨论
检测结果表明， 冬虫夏草与亚香棒虫草的
rDNA 序列相似度在 80.5%~81.0%之间，HPLC 指
纹图谱的相似度低于 47.9%， 采用 rDNA 测序和
HPLC指纹图谱均可区分冬虫夏草与亚香棒虫草。
rDNA 的 ITS 区为高变区域， 据前人对真菌 rDNA
序列 ITS 区的研究结果， 同一个生物种序列间核
苷酸的相似度若低于 90%， 通常作为不同种或不
同属处理[10~14]。样品 S1、S2的测序结果与亚香棒虫
草的序列相似度高于 99.7%， 证实市场中贩卖的
所谓“冬虫夏草”S1、S2 是亚香棒虫草。 但分子检
测无法反映样品 S1、S2 在化学成分上与亚香棒虫
草之间的差异。 HPLC 指纹图谱结果显示， 样品
S1、S2与亚香棒虫草的相似度仅 43.3%，根据国家
药典委员会对 “中药色谱指纹图谱相似度评价系
统 A 版（2004 年）”的说明，同种药材的 HPLC 指
纹相似度应高于 90%， 提示样品 S1、S2 的水溶性
成分组成与亚香棒虫草有差异， 推测可能是不法
商贩在加工过程中进行了水洗、 浸泡、 染色等处
理，导致样品 S1、S2 的某些色谱峰增加或缺失（图
2c、图 2d、图 2e）。
笔者从湖南醴陵采集的亚香棒虫草呈灰白
色，表面颜色与冬虫夏草有较大区别。从西藏林芝
地区松多镇商贩及广州某国际博览会展位购买的
所谓“冬虫夏草”S1、S2 的表面颜色和外形均与冬
虫夏草十分相似，普通百姓不易分辨。作者将样品
S1、S2 经电感耦合等离子体质谱 （Inductively
Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）分析
重金属元素含量， 发现样品 S1、S2 的重金属铅
（Pb）含量最高达 3 492.0 mg/kg，最低达 245.0 mg/
180
第 9 卷 第 1 期
kg（据我国外经贸部制定并颁布《药用植物及其制
剂进出口绿色行业标准》规定，中药材中铅的允许
限量为≤5.0 mg/kg），疑是违法使用工业染料铅铬
黄（PbCrO4）等物质染色，而正常未染色的亚香棒
虫草样品 Ch 重金属铅（Pb）含量仅为 3.2 mg/kg。
这类在亚香棒虫草中违法添加非食用物质的危害
公众健康的行为， 长期以来未能进入食品安全监
管部门的监管视线。
采用分子生物学与化学指纹图谱对中药材的
遗传本质和化学成分进行真伪鉴定和品质评价，
是中药生产质量控制的现代化及标准化行之有效
的方法。 化学指纹图谱从化学成分群的角度来评
价药材样品的品质优劣， 是控制中成药及天然药
物质量的有效方法之一[15~16]。但由于药材的化学成
分易受破坏和干扰，用化学指纹图谱检测、鉴定生
物类药材时得出的数据仅适合作为参考。 而分子
生物学检测从中药材的 DNA 角度进行分析，其特
点是不受外界因素及生物体发育阶段的影响，具
有准确性高、重现性好等特点[17]。 在对冬虫夏草等
样品序列分析的过程中， 设计了冬虫夏草相关特
异性引物，结合巢式 （Nested）PCR、降落 （Touch-
down）PCR 等方法， 鉴别效果优于直接 PCR 的鉴
别方法，可用于冬虫夏草药材的真伪鉴别（另文发
表）。关于冬虫夏草菌中的中国被毛孢（Hirsutella
sinensis X.J. liu 等）与伴生菌相互间的关系，伴生
菌的生物学、生态学、分子检测及化学指纹图谱等
研究已取得重大进展（另文发表）。
参 考 文 献
1. Li S.P.， Yang F.Q.， Tsim， et al. Quality control of Cordyceps sinensis， a valued traditional Chinese medicine [J].
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2006，41（5）：1 571~1 584.
2. Jia J.M.， Ma X.C.， Wu C.F.， et al. Cordycedipeptide A， a new cyclodipeptide from the culture liquid of Cordyceps
sinensis （BERK.） SACC[J]. Chem. Pharm. Bull.， 2005，53（5）：582~583.
3. White T. J.， Bruns T.， Lee S.， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylo-
genetics[M]. In： PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications， New York： Academic Press， Inc.，1990. 315~
322.
4. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions [J]. Molecular Evolution，1980，16：
111~120.
5. 赵锦， 王宁， 陈月琴， 等. 冬虫夏草无性型的分子鉴别[J]. 中山大学学报·自然科学版，1999，38（1）：121~123.
6. Jiang Y.， Yao Y. J. Names related to Cordyceps sinensis anamorph[J]. Mycotaxon， 2002， 84：245~254.
7. 蒋毅， 姚一建. 虫草属分子系统学研究现状[J]. 菌物研究， 2004，2（1）：58~67.
8. Chen Y.Q.， Wang N.， Qu L.H.， et al. Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis
of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S [J]. Bionchemical Systematics and Ecology，2001，29：597~
607.
9. Liu Z.Y.， Liang Z.Q.， Liu A.Y.， et al. Molecular ecidence for teleormorph connections in Cordyceps based on ITS-5.
8s rDNA sequences[J]. Mycological Research，2002，106：1 100~1 108.
10. Gerbi S. A. The evolution of eukaryotic ribosomal DNA [J]. Biosystems，1986，19：247~258.
11. Hillis D. M.， Dixon M. T. Ribosomal DNA： molecular evolution and phylogenetic inference [J]. Quart. Rev.，Biol.，
1991，66：411~453.
12. Hibbett D. S. Ribosomal RNA and fungal systematic[J]. Trans. Mycol. Soc. Jpn，1992， 33： 533~556.
13. Moncalvo J. M. Phylogenetic relationships in ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25S Ribo-
somal DNA sequences [J]. Mycologia，1995，87：223~238.
14. 屈良鹄， 陈月琴. 生物分子分类检索表-原理与方法[J]. 中山大学学报·自然科学版，1999，38（1）：1~6.
15. 易伦朝， 吴海， 梁逸曾. 色谱指纹图谱与中药质量控制[J]. 色谱， 2008， 26（2）：166~171.
冬虫夏草与亚香棒虫草的分子及化学指纹图谱鉴别 181
中 国 食 品 学 报 2009 年第 1 期
16. 谢培山. 中药色谱指纹图谱[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2004.
17. 曹晖， 张英. DNA 分子标记技术在中药品质与标准化方面的研究概况[J]. 中医药现代化， 2003，5（1）：38~47.
Identification of Cordyceps Sinensis and Cordyceps Hawkesii by DNA and Chemical Fingerprint
Zhong Xin Zhao Shuyan Liu Xin
（School of Life Science， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510275）
Abstract Cordyceps sinensis （Berkeley） Saccardo， a well-known and valued traditional Chinese medicine， was en-
demic to alpine habitats on the Tibetan plateau. Counterfeits of C. sinensis have been found in the herbal market， and
C. hawkesii was the one of the most common ones. In this paper， C. sinensis， C. hawkesii and samples S1， S2 which
so call “C. sinensis” were analyzed by ribosomal DNA （rDNA） sequence and HPLC fingerprints. The result showed that
the similarities of rDNA sequences from C.sinensis and C. hawkesii were 80.5%~81.0% and HPLC fingerprints from C.
sinensis and C. hawkesii were lower than 47.9%. The samples S1， S2 were C. hawkesii.
Key words Cordyceps sinensis Cordyceps hawkesii rDNA HPLC
世界动物卫生组织称禽流感对人体影响十分有限
世界动物卫生组织总干事贝尔纳·瓦莱特日前在接受记者采访时表示，禽流感影响的主要
对象是禽类，与此相比，人类染病死亡的病例少之又少，而且死者大多是因为生前频繁接触患
病家禽而被感染，从这方面来说，禽流感对人的影响十分有限。
关于日前中国报告一例人感染禽流感致死病例，瓦莱特表示，这只是个案，他并不为此感
到担忧。 他解释说，自 2003 年以来，亚洲至少有数百万野鸟和家禽感染了 H5N1 型禽流感病
毒，而通过养殖厂、田间、森林、实验室等，这些动物与人类接触的机会至少有数百万次，但几年
来人感染禽流感的病例只有 300 多个。 他认为，最令人担心的是禽流感病毒发生变异，从而导
致病毒在人际间传播。 不过，目前尚未发现任何迹象。
为此，瓦莱特指出，人类 60%的疾病都与动物疾病有关，而在这些年出现的新型疾病中，这
一比例更是高达 75%。因此，各国都应高度重视加强和完善动物卫生监督体系。他特别强调说，
世界动物卫生组织与中国一直保持着良好的合作。
关于亚洲部分国家近来出现禽流感疫情，世界动物卫生组织有关专家分析说，这与带病候
鸟大范围迁徙并同当地家禽接触有直接关系。 在许多地区，家禽都具有一定的自由活动范围，
这些地区的家禽与外来迁徙候鸟接触的机会最多，也最容易受到感染。
（消息来源：新华网）
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