全 文 ：　第 25 卷第 6 期
2006年 11 月 　 　 　　　　 　
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Journal of Food Science and Biotechnology
　 　 　　　　Vo l.25　No.6Nov.　2006
　文章编号:1673-1689(2006)06-0049-05
　　收稿日期:2006-01-03;　修回日期:2006-03-25.
　　基金项目:陕西省教育厅专项科研基金项目(99JK109).
作者简介:邓百万(1963-), 男 ,陕西眉县人 , 教授 ,理学硕士.
美味牛肝菌胞外多糖高产菌株的诱变选育
邓百万 , 　陈文强
(陕西理工学院 陕西省资源生物重点实验室 , 陕西 汉中 723001)
摘　要:对美味牛肝菌胞外多糖的高产菌株进行了诱变选育 。结果表明 ,美味牛肝菌原生质体制
备的最佳条件是 56 h菌龄的菌丝体 ,酶解温度 31 ～ 35 ℃,酶解时间 2 h ,2%纤维素酶和蜗牛酶体
积比1∶1 ,稳渗剂 0.010 92 g/mL 的甘露醇;原生质体产量是3.71×105个/mL ,再生率是 7.32%;
15 W紫外灯 30 cm 处照射时间 6 min ,对原生质体进行诱变处理 。选育出一株胞外多糖产量比原
始菌株高 30.40%的菌株 。
关键词:美味牛肝菌;诱变选育;胞外多糖;原生质体
中图分类号:TQ 920 文献标识码:A
Screening of High Exopolysaccharide Yield Strain of
Boletus edulis by UV Ray
DENG Bai-wan , 　CHEN Wen-qiang
(Shanx i Key Labor atory of Bio-Resources , Shanxi Unive rsity of Techno lo gy ,H anzhong 723001 , China)
Abstract:To enhance the exopo ly saccharide production by Boletus edulis , the st rain w as
mutagenized by using UV-i rradiation w as performed , and the condit ions fo r it s pro toplast
preparation and regeneration o f the mycelium incubation t ime , enzyme concentration , enzyme
temperature , enzyme t ime , and o smo tic stabilizer we re examined.T he result s show ed that the
mycelia incubated fo r 56 h w ere most suitable for pro toplast release.The mixture solution of 1%
fiber enzyme/1% snail enzyme and 0.010 92 g/mL mannito l w as the most effective osmo tic
stabilize r and w as most favorable fo r pro toplast preparation.The suitable incubation temperature
and t ime for the release o f pro toplast w as 30 ～ 35 ℃ and 2 h.With the opt imum condi tions , the
protoplasts and the regeneration rate w as 3.71 ×105 and 7.32%, respectively.Compared w ith
that of parent st rain , the yield of exopoly saccharide production by mutant st rains increase
30.4%.
Key words:Boletus ed ulis;exopoly saccha rides;pro toplast;mutagenesis
　　美味牛肝菌(Boletus edulis)俗称大脚菇 ,属担
子菌亚门 、层菌纲 、伞菌目 、牛肝菌科 、牛肝菌属 。
其子实体菌盖呈扁平球形 ,生于松树 、栎等针叶林
和混交林地上 ,单生或群生 ,常与栎树和松树的树
根形成菌根。该菌菌体较大 ,肉肥厚 ,柄粗壮 ,食味
香甜可口 ,营养丰富 ,是一种食药用价值很高的真
菌。临床上常用来治疗腰腿疼痛 ,手足麻木 ,筋骨
不舒和四肢抽搐 ,还可用以治疗妇女白带症 ,不育
症等[ 1] 。据报道[ 1-3] , 美味牛肝菌含 20 多种氨基
酸 ,其中有人体必需的异亮氨酸 、亮氨酸 、苯丙氨
酸 、苏氨酸等多种氨基酸;还含多种维生素 、矿物质
和多糖 ,具有协调内分泌系统 、神经系统 、提高人体
免疫力以及显著的抗癌作用。该菌子实体的水提
取活性物质(多糖),对小白鼠肉瘤 5-180 的抑制率
为 100%,对艾氏瘤的抑制率为 90%。美味牛肝菌
为菌根菌 ,目前仍不能进行人工栽培 ,液体发酵生
产胞外多糖是发展方向。作者对美味牛肝菌原生
质体的制备 、再生 、紫外线诱变和初选高产多糖菌
株进行了研究。
1　材料与方法
1.1　材料与设备
1.1.1　供试材料　美味牛肝菌由陕西省资源生物
重点实验室食药用菌菌种保藏中心提供;纤维素酶
由上海双向西巴斯科技发展有限公司提供;蜗牛酶
由北京百泰生化技术公司提供 。
1.1.2　实验设备　离心机 、振荡培养箱 、人工气候
箱 、冰箱 、超净工作台 、高压灭菌锅 。
1.1.3　培养基　母种培养基:葡萄糖 2 g/dL ,马铃
薯 20 g/dL , KH2 PO4 0.5 g/dL , MgSO 4 7H 2O 0.3
g/dL , VB1 0.0001 g/dL ,琼脂 1.8 g/dL;再生培养
基:母种培养基+浓度为 0.6 mol/L 的甘露醇稳渗
剂;发酵培养基:马铃薯 10 g/dL ,蔗糖 2%,豆饼粉
0.6 g/dL , KH 2 PO 4 0.3 g/dL , CaCO3 0.2 g/dL ,
MgSO 4 ·7H 2O 0.2 g/dL , pH 5.4 ～ 5.8。
1.1.4　酶解液配制　用0.010 92 g/mL 的甘露醇
分别配置 10 g/dL 纤维素酶和 10 g/dL 蜗牛酶的母
液 ,抽提除菌后备用 。
1.2　实验方法
1.2.1　原生质体制备　参见文献[ 4-8 ,12 , 13] 。
1)菌种活化培养:配制母种培养基 ,分装试
管 ,于 121.3 ℃灭菌 30 min ,放置斜面 ,接种 ,于 28
℃下活化培养 7 d ,待菌丝长满斜面 。
2)菌龄试验:制备液体培养基 ,分装于三角瓶
中 ,于 121.3 ℃灭菌 30 min ,冷却后接活化菌种 ,静
置培养24 h后于 28 ℃振荡培养 5 d ,制备的液体菌
种做如下处理:分别接入新鲜液体培养基中 ,于 28
℃培养 24 、36 、48 、56 、72 h ,再用 100目铜网过滤收
集菌丝体 , 无菌水冲洗用 0.1 mol/L Tris—0.1
mol/L EDTA 冲洗 ,用 0.1 mol/ L Tris—0.1 mol/
L EDTA配制 0.2%巯基乙醇 ,30 ℃振荡处理 30
min ,用0.010 92 g/mL 甘露醇溶液冲洗※2 000 r/
min离心 5 min ,收集菌丝体※称取 1 g 菌丝体加
4mL 2%纤维素酶 +2%蜗牛酶溶液 , 30 ℃振荡 2
h ,酶解液离心(500 r/min), 5 min 后弃掉未被酶解
的菌丝体※4 000 r/min离心 5 min ,获得原生质体
用稳渗剂制成原生质体悬浮液 ,血球计数板计数 。
3)酶浓度试验:蜗牛酶 、纤维素酶酶浓度分别
为 1 、1.5 、2 、2.5 、3 g/dL ,取培养 56 h 的菌丝体 ,进
行酶解处理 ,操作步骤同(2),血球计数板计数。
4)酶解时间试验:取培养 56 h的菌丝体 ,用 2
g/dL 纤维素酶+2 g/dL 蜗牛酶溶液分别 处理 1 、
1.5 、2 、2.5 、3 、3.5 、4 h , 操作步骤同菌龄试验 ,血球
计数板计数。
5)酶解温度试验:取培养 56 h的菌丝体 ,用 2
g/dL 纤维素酶+2 g/dL 蜗牛酶溶液分别在 25 、27 、
29 、31 、33 、35 、37 ℃下进行酶解处理 ,操作步骤同菌
龄试验 ,血球计数板计数 。
1.2.2　原生质体再生　将制备的原生质体悬浮液
分别用液体再生培养基和无菌稳渗剂稀释 ,28 ℃预
培养 24 h ,取 0.2 mL 涂布于再生培养基上 ,每皿原
生质体数达到 104个/mL ,28 ℃培养 10 d ,观察平皿
中的再生菌落数 ,计算再生率 。
1.2.3　诱变育种
1)诱变处理:取 5 mL 稀释至一定浓度的原生
质体悬浮液 ,置于直径为 6 cm 的培养皿中 ,无盖并
距 15 W 紫外灯 30 cm 处分别照射 0 、2 、4 、6 、8 、10 、
15 、20 min ,照射过程振荡搅拌 ,然后于 28 ℃下避光
培养[ 10] 。
2)变异菌株筛选:挑取紫外线诱变后直径大 、
菌丝生长茂盛的单菌落 ,接种到综合马铃薯培养基
中 , 28 ℃培养 7 d后 ,比较各诱变菌株的生长速度。
筛选出的诱变菌株经液体发酵培养后 ,测定各诱变
菌株胞外多糖的产量[ 11] 。
1.2.4　分析方法
1)胞外多糖的提取:收集发酵液 ,3 500 r/min
下离心 20 min ,收集上清液并浓缩 ,加入 3倍体积
95%酒精 ,4 ℃沉淀 48 h ,3 500 r/min离心 20 min ,
收集粗多糖 ,烘干测定。
2)多糖的测定:采用苯酚 —硫酸法[ 9] 。
2　结果与分析
2.1　原生质体制备
2.1.1　菌龄对原生质体产率的影响　活化后的美
味牛肝菌分别接入新鲜液体培养基中 , 28 ℃培养
24 、36 、48 、56 、72 h ,分别过滤收集菌丝体进行酶解 ,
50 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 25卷　
细胞计数 ,结果见表 1 。
　　结果表明 ,菌龄对原生质体产率的影响明显 ,
随着培养时间不同 ,美味牛肝菌原生质体产率差异
较大。当菌龄为 56 h时 ,原生质体数量达到3.72×
105个/mL。在原生质体制备过程中 ,一般以对数生
长期前期的幼嫩菌丝体制备原生质体效果最好 ,因
此确定 56 h为美味牛肝菌菌丝酶解的最适菌龄。
表 1　菌龄对原生质体产率的影响
Tab.1　Effect of hyphase age on the released protoplost
菌龄/ h 原生质体产率/(个/m L)
24 1.28×105
36 2.06×105
48 2.97×105
56 3.72×105
72 3.69×105
2.1.2　酶液质量浓度对原生质体产率的影响　蜗
牛酶 、纤维素酶的质量浓度分别是 1 , 1.5 ,2 ,2.5 , 3
g/dL ,按体积比 1︰ 1混合 ,取培养 56 h 的美味牛
肝菌菌丝体 ,进行酶解处理 ,细胞计数 ,结果见表 2。
表 2　酶液质量浓度对原生质体产率的影响
Tab.2　Effect of enzyme concentration on the released proto-
plast
酶液质量浓度/(g/dL) 原生质体产率/(个/m L)
1 2.17×105
1.5 3.48×105
2 3.56×105
2.5 3.62×105
3 3.67×105
　　结果表明 ,酶液质量浓度对原生质体产率的影
响明显 ,由纤维素酶和蜗牛酶组合而成的混合酶 ,
在酶解菌丝时 , 随酶质量浓度的增加 ,原生质体产
率呈增加趋势。当酶质量浓度大于 2 g/dL时 ,原生
质体产率增加缓慢 ,考虑到经济因素 ,确定 2.0 g/
dL酶液质量浓度(纤维素酶和蜗牛酶体积比为 1∶
1)为美味牛肝菌原生质体酶解的最适浓度。
2.1.3　酶解时间对原生质体产率的影响　取培养
56 h的菌丝体 ,由 2 g/dL 纤维素酶和 2 g/dL 蜗牛
酶组成的混合酶 ,分别在不同时间进行酶解 , 细胞
计数 ,结果见表 3 。
　　表 3结果表明 ,酶解时间对原生质体产率的影
响较明显 ,随酶解时间的延长 ,原生质体数目呈增
加趋势 ,2 h后达到 3.50×105个/mL。但酶解时间
大于 2 h时 ,原生质体产率增加缓慢;并且酶解时间
的延长会影响原生质体的活力。确定 2 h为美味牛
肝菌原生质体酶解的最适时间。
表 3　酶解时间对原生质体产率的影响
Tab.3　Effect of enzyme time on the preparation of the pro-
toplast
酶解时间/ h 原生质体产率/(个/m L)
1 1.36×105
1.5 1.83×105
2 3.50×105
2.5 3.58×105
3 3.63×105
3.5 3.65×105
4 3.64×105
2.1.4　酶解温度对原生质体产率的影响　取培养
56 h的菌丝体 ,用 2 g/dL 纤维素酶+2 g/dL 蜗牛
酶溶液组成的混合酶 ,分别在不同温度下进行酶解
2 h处理 ,细胞计数 ,结果见表 4。
表 4　酶解温度对原生质体产率的影响
Tab.4　Ef fect of enzyme temperature on the released proto-
plast
酶解温度/ ℃ 原生质体产率/(个/m L)
25 1.83×105
27 2.67×105
29 3.13×105
31 3.46×105
33 3.55×105
35 3.61×105
37 3.68×105
　　结果表明 ,酶解温度对原生质体产率的影响明
显 ,当酶解温度低于 30 ℃时 ,美味牛肝菌原生质体
产量随温度的升高增加明显 ,当酶解温度大于31 ℃
时 ,原生质体产量增加缓慢。综合考虑 ,确定 31 ～
35 ℃为美味牛肝菌原生质体酶解的最适温度范围。
2.2　原生质体再生
以质量浓度为 0.010 92 g/mL 甘露醇作为渗
透压稳定剂 ,在 31 ℃、pH 自然的条件下 ,用纤维素
酶 2 g/dL+蜗牛酶 2 g/dL 的混合酶对培养56 h的
美味牛肝菌菌丝体酶解 2 h ,原生质体的数目可达
到 3.71×105个/mL。28 ℃进行再生培养 ,再生率
为 7.32%。
51　第 6期 邓百万等:美味牛肝菌胞外多糖高产菌株的诱变选育
再生率=(培养皿中再生出的单菌落个数/(0.2×
3.71×104)个/mL)×100%
2.3　诱变育种
2.3.1　诱变剂量的确定　取稀释至一定浓度的美
味牛肝菌原生质体悬浮液置于培养皿中 ,无盖并距
15 W紫外灯 30 cm 处照射处理 ,涂平板 ,28 ℃暗培
养。根据再生率换算出杀菌率 ,结果见表 5。
表 5　紫外线照射时间对原生质体再生率的影响
Tab.5　Ef fect of UV irradiation time on the regeneration rate
of protoplasts
时间/ min 杀菌率/ %
0 0
2 1.52
4 20.00
6 66.25
8 78.33
10 80.55
15 93.89
20 97.07
杀菌率=((紫外线处理 0 min 时原生质体再生率—紫外线
处理 t min 时原生质体再生率)÷紫外线处理 0 min 时原生
质体再生率)×100%
　　表 5结果表明 ,随紫外线照射时间的延长 ,杀
菌率明显提高。根据微生物诱变育种的原理 ,用紫
外线作诱变剂时 ,一般采用杀菌率 30%～ 70%的相
对剂量为合适剂量[ 5] 。因此 ,确定诱变剂量为置于
15 W紫外灯 30 cm 处照射 6 min。
2.3.2　诱变处理　取 5 mL 稀释至 2.0 ×105个/
mL 的美味牛肝菌原生质体悬浮液 ,置于培养皿中 ,
无盖并距 15 W 紫外灯30 cm 处照射处理 6 min ,涂
平板 ,28 ℃暗培养 。每皿选出 20个再生菌落 ,分别
接种试管 ,编号进行筛选 。
2.3.3　变异株筛选　将诱变再生的菌落分别接种
在综合马铃薯培养基平板上 ,28 ℃培养 ,测定生长
速度 。挑取生长状况稳定 ,单菌落直径大 、菌丝生
长茂盛和生长速度快的菌株10株。对初选的 10个
菌株进行 3次传代培养 ,在马铃薯 10 g/dL ,蔗糖 2
g/dL , 豆饼 粉 0.6 g/dL , KH 2 PO 4 0.3 g/dL ,
MgSO 4 ·7H2O 0.2 g/dL , CaCO 3 0.2 g/dL 发酵
培养基上;初始 pH 5.4 ～ 5.8 ,振荡速度 180 ～ 220
r/min ,培养温度 28 ℃,装液量 60%下进行多糖发
酵试验 ,测定其粗多糖产量 ,从中复筛选出遗传性
状稳定且具有高产多糖的菌株 ,结果见表 6。
表 6　Be-0 诱变菌株液体发酵产胞外多糖情况
Tab.6　Exopolysaccharide production by mutants Be-0
菌株编号 胞外多糖质量浓度/(g/ L)
Be-0 11.38
Be-1 11.27
Be-2 9.09
Be-3 12.78
Be-4 11.81
Be-5 12.23
Be-6 13.99
Be-7 14.84
Be-8 11.91
Be-9 11.54
Be-10 10.12
　　结果表明 ,与原始菌株 Be-0相比 ,诱变后的美
味牛肝菌株多糖质量浓度均有较大变化 ,大部分菌
株多糖含量比原始菌株高。Be-3 、Be-6和 Be-7菌株
胞外多糖产量较高 ,分别是 12.78 , 13.99 , 14.84 g/
L 。经原生质体再生的 Be-7比出发菌株 Be-0优良 ,
菌丝体生长快 ,胞外多糖含量比 Be-0 高 30.40%。
对 Be-7菌株进行一年多次平板培养和发酵试验 ,遗
传性状表现稳定。
3　结　论
原生质体制备是菌种选育及遗传研究的一个
重要方面 。影响原生质体产生的因素较多 ,包括菌
龄 、酶解时间和温度 、酶的浓度 、渗透压稳定剂的选
择等 。本研究结果表明 ,美味牛肝菌原生质体的最
佳制备条件是:培养 56 h的菌丝和 2 g/dL 纤维素
酶+2 g/dL 蜗牛酶 ,以质量浓度为0.010 92 g/mL
甘露醇作为稳定剂 ,在 31 ℃下酶解 2 h ,原生质体
的数目可达 3.71 ×105个/mL ,再生率为 7.32%。
美味牛肝菌原生质体经紫外线照射处理后 ,再生率
有明显的致死效应 ,在 15 W 紫外灯 30 cm 处 ,照射
时间为 10 ～ 20 min的剂量中 ,原生质体的致死率为
80.55%～ 97.07%。而综合诱变效应和获得的诱
变菌株 ,在 15 W 紫外灯 30 cm 处 , 照射时间为 6
min的剂量为宜。将得到的美味牛肝菌再生菌株进
行平板培养 ,根据菌丝生长状况是否稳定 、单菌落
直径大小 、菌丝生长是否茂盛和生长速度速度等 ,
从中初筛出 10 株性状较好的变异菌株进行复筛
选 ,经 1 年多次平板培养和发酵试验后综合评估 ,
52 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 25卷　
以 Be-7号菌株为最优 , Be-7号菌株菌丝分枝多且
均匀 ,生长速度快 ,菌丝生长茂盛 ,在 28 ℃,pH 5.4
～ 5.8下 ,以马铃薯 10 g/dL ,蔗糖 2 g/dL ,豆饼粉
0.6 g/dL , KH 2PO 4 0.3 g/dL ,MgSO 4 ·7H 2O 0.2
g/dL , CaCO3 0.2 g/dL 发酵培养基上进行液体发
酵 ,胞外多糖产量比出发菌株高 30.40%。
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(责任编辑:李春丽)
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(责任编辑:朱 明)
53　第 6期 邓百万等:美味牛肝菌胞外多糖高产菌株的诱变选育