全 文 :hours,embryo development was observed daily for de-
velopmental state,mortality,deforming rate and abnor-
mal condition. Results The result of five drugs LC50
in descending order:cyclophosphamide > azacitidine
> tetracycline hydrochloride > acetylsalicylic acid >
dexamethasone acetate. EC50 in descending order:cy-
clophosphamide > tetracycline hydrochloride > azaciti-
dine > acetylsalicylic acid > dexamethasone acetate.
The TI values of cyclophosphamide,acetyl salicylic
acid,tetracycline hydrochloride,dexamethasone ace-
tate, azacitidine were 1. 92, 1. 11, 1. 05, 1. 44,
2. 99,respectively. Conclusion Zebrafish embryo
model can be used in the preliminary evaluation of
drugs,and the study of early developmental toxicity
and safety.
Key words:zebrafish embryos;median lethal concen-
tration;concentration for 50% of maximal effect;tera-
togenic;developmental toxicity;model validation
网络出版时间:2015 - 12 - 23 13:48 网络出版地址:http:/ /www. cnki. net /kcms /detail /34. 1086. R. 20151223. 1348. 034. html
显脉旋覆花不同部位体内外抗氧化作用比较
贺安娜1,2,3,佘朝文2,3,曾军英1,2,3,彭圣贤1
(1.怀化学院生物与食品工程学院;2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室;
3.湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南 怀化 418008)
doi:10. 3969 / j. issn. 1001 - 1978. 2016. 01. 017
文献标志码:A 文章编号:1001 - 1978(2016)01 - 0079 - 05
中国图书分类号:R282. 71;R284. 1;R284. 2;R345. 49;R349. 1;
R916. 4
摘要:目的 为合理利用显脉旋覆花资源,研究了显脉旋覆
花体内外抗氧化作用。方法 通过水煎法、索氏醇提法及超
声醇提法对显脉旋覆花地上及地下部分药用成分进行提取,
并通过体内外实验比较了不同部位超声醇提物的抗氧化效
果。结果 超声醇提所得总酚及总黄酮含量最高,提取物中
总酚含量明显高于总黄酮含量;显脉旋覆花超声醇提物对
DPPH、ABTS及超氧阴离子自由基都有很好的清除效果,地
下部分提取物的清除效果明显优于地上部分;提取物灌药可
明显提高 D-半乳糖致衰小鼠肝脏、肾脏及血清的过氧化氢
酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶活性,并降低丙二醛
(MDA)含量,地上部分高浓度抗氧化效果相当于地下部分
低浓度的效果。结论 显脉旋覆花醇提物对自由基有良好
的清除作用,具有较好的抗氧化能力,地下部分抗氧化的效
果明显高于地上部分。
关键词:显脉旋覆花;不同部位;提取方式;总酚;总黄酮;抗
氧化
收稿日期:2015 - 08 - 26,修回日期:2015 - 11 - 26
基金项目:湖南省科技计划重点项目(No 2013FJ4324) ;湖南省科技
计划一般项目(No 2013NK4108) ;植物学湖南省“十二五”
重点建设学科资金资助(No ZWX2014-4)
作者简介:贺安娜(1981 -) ,女,硕士,副教授,研究方向:民族药用
植物方面,Tel:0745-2861281,E-mail:anna99102 @ 163.
com
显脉旋覆花(Inula nervosa Wall.)是菊科旋覆
花属植物,分布于我国湖南西南部、广西北部、贵州
及云南等地[1]。张鸭关等[2]研究表明,显脉旋覆花
富含蛋白质、亚油酸、α-亚麻酸及多种维生素和矿物
质,平均营养价值很高;刘敏等[3]亚慢性毒性试验
证明显脉旋覆花的提取物对大鼠没有产生明显毒性
影响,卫生部已批准显脉旋覆花(小黑药)为新资源
食品,食用其地下部分。显脉旋覆花中含有较多的
挥发性油类物质,其中百里香酚等酚类物质占
80%[4 - 5],李柯等[6]研究发现该药不同产地及不同
部位酚类物质含量差异较大。显脉旋覆花是一种多
民族使用的药用植物,具有补肾益肺通经络等功
效[7],不同民族使用该药的部位有差异[8]。目前未
见显脉旋覆花不同部位药理药效差异的报道,本文
对显脉旋覆花地上部分和地下部分的抗氧化效果进
行了比较,旨在验证民族用药的科学性,也为充分合
理利用该资源提供理论依据。
1 材料
1. 1 实验材料与试剂 显脉旋覆花采自湖南怀化
通道县,10 月挖取全草,将地上和地下部分分别洗
净晒干研磨成粉;昆明小鼠购于湖南斯莱克景达实
验动物有限公司,8 周龄,体质量(30 ± 2)g,许可证
号 SCXK(湘)2014-0002,饲养于(22 ± 1)℃和光周
期 12 h动物房内,给予充足标准饲料和饮用水;没
食子酸、芦丁标准品购于上海金穗生物,纯度 98%
以上;Vit C、D-半乳糖购于美国 Sigma 公司;ABTS、
DPPH、超氧阴离子自由基试剂盒、过氧化氢酶
·97·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2016 Jan;32(1) :79 ~ 83
(CAT)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、总抗
氧化能力(T-AOC)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH-Px)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒购于南京
建成生物工程研究所;乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、Fo-
lin-酚、NaOH、NaCl等试剂均为分析纯。
1. 2 仪器 RE-52AA 旋转蒸发器(上海亚荣生化
仪器厂) ;JY98-ⅢDN超声波细胞粉碎机(宁波新芝
生物科技股份有限公司) ;HH-S 数显恒温水浴锅
(金云市医疗仪器厂) ;5804R 高速冷冻离心机(德
国 Eppendorf) ;UV-2450 紫外可见分光光度计(日本
岛津)。
2 方法
2. 1 提取液的制备 水煎法提取:取显脉旋覆花干
燥粉末 10 g于钢杯中,120 mL 蒸馏水煎煮 3 次,参
考传统中药煎煮时间,每次约 20min,合并 3 次提取
液,浓缩过滤蒸馏水定容至 100 mL。索氏醇提:显
脉旋覆花粉末 10 g 于索氏提取器中,加入 120 mL
75%乙醇回流提取 4 h,重复提取 3 次,合并上清,蒸
馏浓缩去乙醇,过滤后用蒸馏水定容至 100 mL。超
声醇提:显脉旋覆花粉末 10 g 于锥形瓶中,加 120
mL 75%乙醇,放入超声波细胞破碎仪,25℃超声 40
min,超声强度为 500W,重复提取 3 次,合并上清,浓
缩蒸馏去乙醇,过滤后蒸馏水定容至 100 mL。每种
提取方式重复 3 次取样。
2. 2 提取液中总酚及总黄酮含量测定 总酚含量
测定:取 50μL提取物,蒸馏水稀释至 1 mL,加入 2
mL Folin-酚试剂摇匀后静置 5min,加入 1. 6 mL 1
mol·L -1 Na2CO3 溶液摇匀,蒸馏水定容至 25 mL,
50℃水浴 15min,冷却后于 λ = 750 nm 处测定吸光
度,通过标准曲线计算提取物中的总酚浓度(g·
L -1) ,样品中总酚含量 /% =(总酚浓度 ×提取液体
积 ×稀释倍数)/样品重量。总黄酮含量测定:取 1
mL提取物于锥形瓶中,加人 25 mL 30%乙醇及 1. 4
mL 5% NaNO2 摇匀后静置 5min,再加入 1. 4 mL
10% Al(NO3)3 混匀静置 6 min,最后加入 10 mL 1
mol·L -1 NaOH,以 30%乙醇定容至 50 mL,λ = 510
nm处测定吸光度,通过标准曲线计算样品中总黄酮
浓度(g·L -1) ,样品中总黄酮含量 /% = (总黄酮
浓度 × 提取液体积 × 稀释倍数)/样品重量 ×
100%。
2. 3 动物材料准备 实验动物小鼠分空白对照组、
衰老模型组及 6 个给药组,小鼠♀♂各半,随机分
配,每组 10 只。空白对照组每日皮下注射生理盐水
(1 mg·g -1·d -1) ,灌胃蒸馏水(0. 5 mL) ;衰老模
型组注射 D-半乳糖(1 mg·g -1·d -1) ,灌胃蒸馏水
(0. 5 mL) ;实验组注射 D-半乳糖(1 mg· g -1·
d -1) ,分别灌胃显脉旋覆花低(L)、中(M)、高(H)
剂量组(300、600、1200 μg·g -1·d -1)。连续给药
30 d。最后 1 次给药 12 h后处死小鼠,收集血液、肝
脏及肾脏。用冰浴的生理盐水将肝脏及肾脏研磨成
10%的组织匀浆液,匀浆及血液在 4℃、3 000 r·
min -1条件下离心 15 min,取上清液待用。
2. 4 生化指标测定 DPPH 自由基清除率、ABTS
自由基清除率测定参考谭娟等[9]的方法。超氧阴
离子自由基清除率、SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px 酶活
性及 MDA含量测定均按照试剂盒说明书进行操作
(南京建成生物工程研究所)。
2. 5 统计学分析 实验数据统计用 SPSS 11. 0 软
件进行,采用重复测量的方差分析,结果用 珋x ± s 表
示;成分含量测定采用 Duncan 法进行多重比较,组
间比较采用 t检测。
3 结果
3. 1 不同提取方法所得总酚及总黄酮含量比较
以没食子酸为标准品,测得标准曲线回归方程为:Y
= 6. 2661X + 0. 0147,R2 = 0. 9997,线性范围在 0 ~
0. 4 g·L -1。以芦丁为标准品,测得标准曲线回归
方程为:Y = 0. 0244X + 0. 0037,R2 = 0. 9992,线性范
围在 0 ~ 0. 7 g·L -1。通过标准曲线计算显脉旋覆
花提取液中总黄酮及总酚含量,结果表明总黄酮含
量远远低于总酚含量(Tab 1) ;相同提取方法所得总
酚及总黄酮含量均表现为地下部分高于地上部分;
采用超声乙醇提取得到的总酚及总黄酮含量明显高
于其他两种提取方法,水煎提取所得成分含量最低,
因此文章后期体内外抗氧化实验所用提取液均采用
超声乙醇提取。
3. 2 不同部位提取物体外抗氧化作用比较 显脉
Tab 1 Content of polyphenol and total flavonoids of I. nervosa Wall. by different extraction methods (珋x ± s,n = 3)
Extraction methods
Content of total polyphenol /%
Aboveground Underground
Content of total flavonoids /%
Aboveground Underground
Decoction extraction 0. 572 ± 0. 031c 1. 32 ± 0. 093c 0. 012 ± 0. 001c 0. 018 ± 0. 001c
Soxhlet ethanol extraction 0. 912 ± 0. 078b 1. 86 ± 0. 121b 0. 017 ± 0. 001b 0. 022 ± 0. 002b
Ultrasonic ethanol extraction 0. 996 ± 0. 085a 2. 23 ± 0. 174a 0. 021 ± 0. 002a 0. 027 ± 0. 002a
Different small letters in the same column indicate significant difference at P < 0. 05
·08· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2016 Jan;32(1)
旋覆花地上及地下部分提取物在低浓度时对 DPPH
自由基、超氧阴离子自由基的清除效果较弱,随浓度
升高,抑制效果呈明显线性关系(Fig 1,Tab 2)。对
ABTS自由基的清除效果在低浓度时有明显线性关
系,浓度较高时则不明显,线性范围远远低于 DPPH
自由基、超氧阴离子自由基。地上部分提取物的半
抑制浓度均高于地下部分,说明地下部分体外抗氧
化的效果强于地上部分,这与显脉旋覆花地下部分
总酚及总黄酮含量高于地上部分的结果相符。
3. 3 不同部位提取物对衰老小鼠肝脏的影响 空
白对照组小鼠肝脏的抗氧化酶活性均明显高于衰老
模型组,同时 MDA 含量明显低于衰老模型组(Tab
3)。显脉旋覆花醇提物对 D-半乳糖致衰小鼠肝脏
CAT、SOD、T-AOC、GSH-Px酶活性有提高作用,并降
低MDA含量,地上部分低浓度组的T-AOC酶活性与
衰老组相比没有明显差异,随灌药浓度的增加肝脏
抗氧化酶活性也得到增加。抗氧化效果随提取物浓
度的增加而增强,同等浓度的地下部分提取物抗氧
化效果均优于地上部分。
3. 4 不同部位提取物对衰老小鼠肾脏的影响 衰
老组小鼠的肾脏抗氧化酶活性均极明显低于空白对
照组(Tab 4)。灌胃低浓度的显脉旋覆花地上部分
提取物对衰老小鼠肾脏 CAT、T-AOC酶活性及 MDA
含量影响不明显,随灌药浓度升高,肾脏抗氧化酶活
性也明显升高。地下部分的效果同样优于地上部
分,地下部分高浓度组的 CAT、GSH-Px 酶活性及
MDA含量甚至与空白对照组无显著性差异,说明此
时衰老小鼠的肾脏得到了很好的修复。
3. 5 不同部位提取物对衰老小鼠血清的影响 在
D-半乳糖的作用下,小鼠血清中 CAT、SOD 等抗氧
化酶活性明显下降,MDA含量极显著升高(Tab 5)。
显脉旋覆花提取物对衰老小鼠血清的抗氧化酶都有
不同程度的提高作用,并降低 MDA 含量。与衰老
组相比,地上部分低浓度组T-AOC酶活性的升高及
Fig 1 Clearing effects of I. nervosa Wall. on DPPH free radical,ABTS free radical and superoxide anion
Tab 2 Clearing effects of alcohol extraction of I. nervosa Wall. on DPPH free radical,ABTs free radical and superoxide anion
Type of free radical Group Linear regression equations and linear range r2 IC50 /g·L -1
DPPH aboveground Y = 5. 5809X + 8. 5792(0. 5 ~ 8 g·L -1) 0. 9179 7. 4219
underground Y = 7. 7825X + 17. 554(0. 5 ~ 8 g·L -1) 0. 9473 4. 1691
ABTS aboveground Y = 51. 8X - 12. 1(0. 25 ~ 1. 75 g·L -1) 0. 9089 1. 1988
underground Y = 75. 9X - 2. 0917(0. 25 ~ 1. 25 g·L -1) 0. 9632 0. 6863
Superoxide anion aboveground Y = 3. 853X + 7. 8872(1 ~ 12 g·L -1) 0. 9614 10. 9298
underground Y = 5. 8927X + 0. 86707(1 ~ 10 g·L -1) 0. 9887 8. 3379
Table 3 Effects of alcohol extraction of I. nervosa Wall. on aging mouse liver(珋x ± s,n = 10)
Group CAT / kU·g - 1 Pro SOD / kU·g - 1 Pro T-AOC /kU·g - 1 Pro GSH-Px /kU·g - 1 Pro MDA /μmol·g - 1 Pro
Control 57. 3 ± 5. 01 56. 2 ± 4. 90 15. 2 ± 1. 45 350 ± 37. 1 1. 49 ± 0. 34
Model 29. 4 ± 3. 08## 17. 1 ± 1. 36## 7. 70 ± 0. 67## 166 ± 15. 4## 3. 27 ± 0. 29##
Aboveground-L 35. 8 ± 3. 32**## 26. 2 ± 3. 19**## 7. 83 ± 0. 68## 189 ± 17. 5* ## 2. 89 ± 0. 19* ##
Aboveground-M 37. 1 ± 3. 41**## 28. 6 ± 2. 68**## 9. 85 ± 0. 78**## 233 ± 22. 1**## 2. 52 ± 0. 24**##
Aboveground-H 39. 0 ± 2. 98**## 38. 7 ± 3. 62**## 13. 1 ± 1. 14**# 279 ± 25. 6**## 1. 97 ± 0. 17**##
Underground-L 38. 2 ± 3. 56**## 31. 8 ± 3. 47**## 10. 1 ± 0. 94**## 256 ± 21. 4**## 2. 39 ± 0. 22**##
Underground-M 39. 4 ± 3. 43**## 44. 1 ± 4. 23**## 14. 4 ± 1. 34** 272 ± 27. 8**## 1. 89 ± 0. 18**##
Underground-H 42. 7 ± 3. 95**## 54. 5 ± 5. 49** 14. 8 ± 1. 36** 343 ± 33. 9** 1. 67 ± 0. 14**#
* P < 0. 05,**P < 0. 01 vs model;#P < 0. 05,##P < 0. 01 vs control.
·18·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2016 Jan;32(1)
Tab 4 Effects of alcohol extraction of I. nervosa Wall. on aging mouse kidney(珋x ± s,n = 10)
Group CAT / kU·g - 1 Pro SOD / kU·g - 1 Pro T-AOC /kU·g - 1 Pro GSH-Px / kU·g - 1 Pro MDA / μmol·g - 1 Pro
Control 19. 0 ± 1. 94 34. 2 ± 3. 45 8. 04 ± 0. 67 312 ± 22. 4 3. 67 ± 0. 41
Model 9. 99 ± 1. 02## 18. 3 ± 1. 85## 3. 81 ± 0. 28## 168 ± 17. 1## 6. 37 ± 0. 58##
Aboveground-L 10. 3 ± 1. 05## 20. 2 ± 1. 97* ## 3. 93 ± 0. 41## 206 ± 19. 4**## 6. 19 ± 0. 59##
Aboveground-M 13. 2 ± 1. 34**## 21. 6 ± 1. 89**## 4. 66 ± 0. 39**## 259 ± 25. 3**## 5. 62 ± 0. 52* ##
Aboveground-H 16. 0 ± 1. 66**## 22. 4 ± 2. 14**## 6. 91 ± 0. 56**## 312 ± 30. 6** 4. 51 ± 0. 44**##
Underground-L 14. 4 ± 1. 34**## 23. 1 ± 2. 15**## 4. 42 ± 0. 42* ## 198 ± 18. 1**## 5. 87 ± 0. 57* ##
Underground-M 15. 5 ± 1. 37**## 24. 8 ± 2. 34**## 6. 39 ± 0. 61**## 295 ± 28. 6** 5. 36 ± 0. 51**##
Underground-H 19. 3 ± 1. 56** 28. 2 ± 2. 18**## 7. 15 ± 0. 74**# 311 ± 34. 2** 3. 55 ± 0. 37**
* P < 0. 05,**P < 0. 01 vs model;#P < 0. 05,##P < 0. 01 vs control.
Tab 5 Effects of alcohol extraction of I. nervosa Wall. on aging mouseserum(珋x ± s,n = 10)
Group CAT / kU·g - 1 Pro SOD / kU·g - 1 Pro T-AOC /kU·g - 1 Pro GSH-Px /kU·g - 1 Pro MDA /μmol·g - 1 Pro
Control 13. 2 ± 1. 12 234 ± 21. 1 26. 6 ± 2. 12 1613 ± 257 6. 05 ± 0. 53
Model 9. 04 ± 0. 78## 114 ± 10. 1## 17. 9 ± 1. 54## 411 ± 31. 8## 13. 1 ± 1. 27##
Aboveground-L 10. 5 ± 0. 95* ## 164 ± 15. 8**## 18. 9 ± 1. 87## 623 ± 58. 9**## 12. 8 ± 1. 18##
Aboveground-M 11. 7 ± 0. 91**# 171 ± 15. 4**## 19. 3 ± 1. 98* ## 842 ± 78. 8**## 11. 3 ± 1. 05* ##
Aboveground-H 13. 4 ± 1. 21** 179 ± 16. 8**## 22. 7 ± 2. 21**# 1065 ± 100**## 9. 37 ± 0. 87**##
Underground-L 11. 6 ± 1. 14** 191 ± 18. 9**## 22. 2 ± 2. 01**# 750 ± 73. 4**## 11. 0 ± 0. 98* ##
Underground-M 12. 1 ± 1. 19** 212 ± 17. 9**# 23. 7 ± 2. 13**# 944 ± 87. 5**## 8. 32 ± 0. 75**##
Underground-H 14. 5 ± 1. 31** 223 ± 15. 6** 25. 3 ± 1. 67** 1242 ± 121**## 7. 86 ± 0. 64**##
* P < 0. 05,**P < 0. 01 vs model;#P < 0. 05,##P < 0. 01 vs control.
MDA含量的降低不明显,随浓度的增加,地上部分
抗氧化的效果也逐步增加。地下部分的抗氧化效果
同样比地上部分强,各组抗氧化酶活性与衰老组相
比差异均有统计学意义,CAT 酶活性与空白对照组
无显著性差异。
4 讨论
近年来天然抗氧化剂的研究开发取得了很大进
展,已报道发现很多植物都具有一定的抗氧化效
果[10],这些研究都基于药材的特殊用途,通过药理
实验对药效进行了验证[11]。本文研究发现,显脉旋
覆花提取物在体外对超氧阴离子自由基、DPPH 自
由基及 ABTS 自由基都有一定的清除效果,地上部
分提取物的半抑制浓度均高于地下部分。注射 D-
半乳糖致衰小鼠的肝脏、肾脏及血清中 CAT、SOD、
T-AOC、GSH-Px酶活性明显低于空白对照组,MDA
含量则明显增高,与文献报道的结果一致[12],表明
实验动物造模成功。通过灌胃显脉旋覆花提取物,
致衰小鼠的抗氧化酶系统得到很好的修复,抗氧化
效果随提取物浓度的增加而增强。
酚类物质是有效的自由基清除剂、抑制剂和螯
合剂,黄酮类化合物也都有较强的抗自由基作用,这
两类物质的抗氧化效果已有众多报道[13 - 14]。显脉
旋覆花中含有较高的酚类物质,本文实验结果表明,
显脉旋覆花地下部分提取物的总酚及总黄酮含量高
于地上部分,同浓度提取物的地下部分抗氧化效果
都强于地上部分,提取物体内外抗氧化的效果与总
酚及总黄酮含量呈正比,可见酚类及黄酮类物质是
显脉旋覆花抗氧化的重要药用成分。实验通过比较
地上及地下部分的活性成分及抗氧化效果,验证了
显脉旋覆花使用部位的科学性(卫生部公布的食用
地下根茎部位)。
(致谢:本实验在怀化学院民族药用植物资源研究与利
用湖南省重点实验室完成。)
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Comparison study on in vitro and in vivo antioxidant activities of
Inula nervosa Wall. extracts from different parts
HE An-na1,2,3,SHE Chao-wen2,3,ZENG Jun-ying1,2,3,PENG Sheng-xian1
(1. College of Biological and Food Engineering,Huaihua University;2. Key Laboratory of Research and Utilization of
Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province;3. Key Laboratory of Xiangxi Medicinal Plant and Ethnobotany of
Hunan Higher Education,Hunan Huaihua 418008,China)
Abstract:Aim To study the in vitro and in vivo an-
tioxidant activity of Inula nervosa wall. in order to le-
gitimately use the resources of I. nervosa. Methods
The medicinal ingredients of aboveground and under-
ground parts of I. nervosa were extracted by different
extraction methods. Ultrasonic extractions from differ-
ent parts were compared by their in vitro and in vivo
antioxidant effects. Results Ultrasound alcohol ex-
traction had the highest content of total phenols and fla-
vonoids,with the content of total phenolics much high-
er than that of total flavonoids. Ultrasound alcohol ex-
tractions had very good scavenging effect on DPPH,
ABTS and superoxide anion radical,with the extraction
from underground part more effective than extraction
from aboveground part. Ultrasound alcohol extractions
significantly increased the level of catalase (CAT) ,
superoxide dismutase (SOD) ,total antioxidant capaci-
ty (T-AOC) ,glutathione peroxidase (GSH-Px)activi-
ty and decreased the level of malondialdehyde (MDA)
in liver,kidney and serum in drenching aging mice.
The antioxidant activity of high concentration of the ex-
traction from aerial part was equivalent to that of low
concentration of the extraction from underground part.
Conclusions Ultrasound alcohol extractions of I. ner-
vosa have very good scavenging effect on free radicals,
which indicates good antioxidant ability. Antioxidant
activity of underground part is much stronger than that
of the aboveground part.
Key words:Inula nervosa Wall.;different parts;ex-
traction methods;total polyphenol;total flavonoids;
antioxidant
·38·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2016 Jan;32(1)