全 文 ：· 2122· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.27 中国药房 2009年第 20卷第 27期
RP -HPLC 法同时测定欧亚旋覆花中 4种黄酮的含量
耿红梅*(衡水学院应用化学系 ,衡水市 053000)
中图分类号 R284.1;R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)27-2122-02
摘 要 目的:建立以反相高效液相色谱法同时测定欧亚旋覆花中 4种黄酮(槲皮素 、木犀草素 、菠叶素 、6-甲氧基-木犀草素)含
量的方法 。方法:色谱柱为 Iner tsil ODS-3(250 mm ×4.6 mm ,5 μm),柱温为 40 ℃,流动相为甲醇-乙腈-0.49%枸橼酸(梯度
洗脱),流速为 1.0 mL ·min -1 ,检测波长为 360 nm 。结果:4种黄酮化合物的进样量分别在 0.17 ～ 6.8μg(r =0.999 9)、0.088 ～
3.52μg(r =0.999 9)、0.020 2 ～ 0.808μg(r =0.999 9)、0.045 ～ 1.8μg(r =0.999 6)范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性
关系;平均回收率在 96.03%～ 99.78%之间 , RSD 在 0.73%～ 1.36%之间(n 均=6)。结论:本方法简单 、灵敏、准确 、重现性好 ,
可用于欧亚旋覆花药材及其制剂的质量控制 。
关键词 反相高效液相色谱法;欧亚旋覆花;槲皮素;木犀草素;菠叶素;6-甲氧基-木犀草素;含量测定
Simultaneous Determination of 4 Flavonoids in Inula bri tannica by RP-HPLC
G ENG Hong -mei(Dept.of Applied Chemistry , Hengshui Colleg e , Hengshui 053000 , China)
ABSTRACT OBJECT IVE:To establish the RP -HPLC method for simult aneous dete rmination of flavonoids(quercetin ,
cyanidenon , spinacetin , and 6-methoxy l-cyanidenon)in In ula br itannica.M ETHODS:The sam ples w ere separated on
chrom atog raphic co lumn Iner tsil ODS -3(250 mm ×4.6 mm , 5μm)at a colum n temperature of 40 ℃.The m obile phase con-
sisted of m ethano l-acetonit rile-0.49%cit ric acid(gradient elution)a t a flow rate o f 1.0 min ·mL -1.The de tection wave-
leng th w as set a t 360 nm.RESU LTS:The linear ranges of quercetin , cyanidenon , spinace tin , and 6-met hoxyl-cyanidenon
w ere 0.17 ～ 6.8μg(r =0.999 9), 0.088 ～ 3.52 μg(r =0.999 9), 0.020 2 ～ 0.808 μg(r =0.999 9)and 0.045 ～ 1.8 μg(r =
0.999 6), respectively , and the average recoveries o f all stood at 96.03%～ 99.78%and RSD at 0.73%～ 1.36%(n =6 each).
CONCLUS ION :The m ethod is sim ple , sensitive , accurate and reproducible , and it is applicable f or the quality control o f the
raw medicinal substance and preparation o f I.bri tannica.
KEY WORDS RP -HPLC ;Inula bri tannica ;Quercetin;Cyanidenon;S pinacetin;6-methoxy l -cyanidenon;Content dete r-
m ina tion
*副主任药师 , 博士。研究方向:新药研发。E-mail:hsghm@
126.com
欧亚旋覆花是一种传统的中草药 , 为菊科旋覆花属植物欧
亚旋覆花 Inu la br itannica L.的干燥头状花序 , 主要分布于
韩国 、日本及我国河南 、河北 、江苏 、浙江 、新疆 、东北等地 。该药
收载于 2005年版《中国药典》(一部),性味咸 、温 , 入肺 、肾经 ,
主治咳嗽有痰 、胁下胀满 、大腹水肿 、泄散风寒[ 1 ]。目前 ,已有报
道的欧亚旋覆花的化学成分约有 40多种 ,主要包括甾醇 、倍半
萜 、香豆素及黄酮类化合物 [2 , 3 ] , 具有抗炎 、抗肝损伤 、抗肿瘤 、
抗氧化 [4 ]等多种生物活性 ,其中黄酮类化合物是其有效成分之
一 。为了更好地控制欧亚旋覆花药材的质量 , 笔者采用反相高
效液相色谱(RP -HPLC)法同时测定欧亚旋覆花中槲皮素 、木
犀草素 、菠叶素 、 6-甲氧基-木犀草素 4种黄酮化合物的含
量 ,并比较了 7个不同地区药材含量的差异 。
1 仪器与试药
1100 series HPLC 仪 , 包括 G 1310A 四元泵 、G1313A 自
动进样器 、G1316A 柱温箱、G 1314A 紫外检测器(美国 Agilent
公司);GR-202型电子分析天平 (日本 A＆D 公司);KQ -
400KDB型高功率数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公
司)。乙腈 、甲醇均为一级色谱纯(美国迪马公司),水为重蒸馏
水并经 0.45μm滤膜过滤 ,其它试剂均为分析纯;槲皮素 、木犀
草素 、菠叶素 、6-甲氧基-木犀草素均由欧亚旋覆花中分离得
到 [ 5 ] , 光谱分析鉴定与其结构一致 , 应用二极管阵列检测器在
峰上不同位置采集光谱 , 归一化处理后得到匹配的叠加光谱;
药材分别采购于山西 、甘肃 、江苏 、河南、河北安国等地 ,经河北
医科大学生药教研室聂风礻是教授鉴定为菊科植物欧亚旋覆花
I.bri tannica L.的干燥头状花序。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Iner tsil ODS-3(250 mm ×4.6 mm , 5μm);柱
温:40 ℃;流动相:甲醇-乙腈-0.49%枸橼酸 , 梯度洗脱(0
min , 5∶15∶80;30 min , 12∶18∶70;55 m in , 12∶18∶70;60
min , 15∶25∶60);检测波长:360 nm;流速:1.0 min ·mL -1;
进样量:20 μL 。色谱见图 1。
图 1 高效液相色谱
A.标准品;B.供试品;1.菠叶素;2.槲皮素;3.木犀草素;4.6-甲氧
基-木犀草素
Fig 1 HPLC chromatograms
A.s tandar d;B.sample;1.spinacet in;2.quercetin;3.cy anidenon;
4.6-methoxy l -cyanidenon
中国药房 2009年第 20卷第 27期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.27 · 2123·
2.2 标准品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的菠叶素 4.04 mg 、 6-甲氧基-木
犀草素 9.00 mg 、槲皮素 34.0 mg 和木犀草素 17.6 mg , 分别
置于 10 mL 量瓶中 , 加甲醇溶解并稀释至刻度 , 作为标准品贮
备液 。分别精密吸取上述贮备液 0.5 mL ,置于 10 mL 量瓶中 ,
加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,即得 。
2.3 供试品溶液的制备
取 60 ℃减压干燥至恒重的药材样品 ,研匀 ,取约 1.0 g ,精
密称定 ,置于圆底烧瓶中 ,加入 80%乙醇 80 mL ,回流提取 2.5
h ,滤过 , 用 80%乙醇 20 mL 分次洗涤 ,合并滤液和洗涤液 , 蒸
干 , 加 50%甲醇适量使溶解 , 移至 10 mL 量瓶中 ,加 50%甲醇
稀释至刻度 ,摇匀 ,滤过(0.45μm 微孔滤膜),即得 。
2.4 系统适应性试验
吸取标准品溶液 、供试品溶液注入液相色谱仪 , 记录色
谱 。结果 ,菠叶素 、槲皮素 、木犀草素 、6-甲氧基-木犀草素的
理论塔板数分别为 22 156 、20 407 、21 181 、20 013 ,分离度分别
为 59.9 、 6.65 、 1.54 、 2.24 , 不对称因子分别为 1.13 、 0.95 、
0.96 、0.99 。
2.5 标准曲线的绘制
分别精密吸取菠叶素 、6-甲氧基-木犀草素 、槲皮素 、木
犀草素标准品贮备液 1 mL , 各置于 10 mL 量瓶中 , 加甲醇稀
释至刻度 , 摇匀 , 精密吸取 5 mL , 置于 10 mL 量瓶中 , 加甲醇
稀释至刻度 , 摇匀 。采用倍率稀释的方法 ,分别进样 20μL , 记
录色谱和峰面积 。以各成分峰面积积分值(Y)对进样量(X ,
μg)进行线性回归 ,得菠叶素 、槲皮素、木犀草素、6-甲氧基-木犀
草素的回归方程分别为 Y =3 541.7X +9.493 7(r =0.999 9)、
Y =3 698.8X +10.337(r =0.999 9)、 Y =3 648X +146.24
(r =0.999 9)、 Y =3 974X +48.618(r =0.999 6)。结果表
明 ,四者的进样量分别在 0.020 2 ～ 0.808 、0.17 ～ 6.8 、0.088 ～
3.52 、 0.045 ～ 1.8μg 范围内与各自峰面积积分值呈良好的线
性关系 。
2.6 最低检测限测定
将标准品溶液逐步稀释 ,直至信噪比(S/N)≥3 ,此时的进
样浓度即为检测限 。以 S/N=3∶1确定的菠叶素 、槲皮素 、木
犀草素 、 6-甲氧基 -木犀草素的最低检测限分别为 0.05 、
0.05 、0.06 、0.03μg ·mL -1。
2.7 稳定性试验
取同一供试品溶液 ,分别在 0 、2 、4 、6 、8 、12 、24 h测定峰面
积 。结果 ,菠叶素 、槲皮素 、木犀草素 、6-甲氧基-木犀草素的
R SD 分别为 2.4%、1.3%、1.4%、2.1%, 表明供试品溶液在
24 h 内稳定性良好 。
2.8 精密度试验
取干燥研匀的欧亚旋覆花药材约 1.0 g ,按“2.3项下方法
制备供试品溶液 ,吸取 20μL 注入液相色谱仪 ,重复进样 6次 ,
按上述色谱条件测定峰面积 。结果 ,菠叶素 、槲皮素 、木犀草素 、
6-甲氧基 -木犀草素的 RSD 分别为 1.24% 、 0.35%、
0.74%、1.06%,表明方法精密度良好 。
2.9 重现性试验
取同一欧亚旋覆花药材 ,干燥 ,研匀 。精密称取 6份 ,每份
约 1.0 g ,按“2.3”项下方法制备供试品溶液 ,吸取 20μL 注入
液相色谱仪 ,按上述色谱条件测定 。结果 ,菠叶素 、槲皮素 、木犀
草素 、 6-甲氧基 -木犀草素的含量分别为 0.127 、 1.31 、
0.761 、0.379 mg ·g -1 , RSD 分别为 2.19%、1.20%、1.26%、
1.57%,表明方法重现性良好 。
2.10 加样回收率试验
精密称取已知含量的欧亚旋覆花药材 6份 ,每份 0.5 g ,精
密加入标准品溶液 ,按“2.3”项下方法制备供试品溶液 ,进样 20
μL ,按上述色谱条件测定并计算加样回收率 。结果 ,菠叶素 、槲
皮素 、木犀草素 、 6-甲氧基-木犀草素的平均回收率分别为
96.03%、99.78%、 99.25%、 96.37%, RSD 分别为 1.09%、
1.03%、1.36%、0.73%(n 均=6)。
2.11 样品含量测定
取不同产地干燥研匀的欧亚旋覆花药材各 3份 , 每份约
1.0 g ,精密称定 ,按“2.3”项下方法制备供试品溶液 ,各吸取 20
μL 注入液相色谱仪 , 按上述色谱条件测定峰面积 , 计算含量 ,
结果见表 1。
表 1 样品含量测定结果(n=3)
Tab 1 Results of content determination of samples(n=3)
产地 样品含量/mg· g -1菠叶素 槲皮素 木犀草素 6-甲氧基-木犀草素
山西 0.127 1.330 0.756 0.379
河北安国 0.125 0.765 0.525 0.301
江苏 0.542 0.728 0.400 0.170
河南 0.182 0.943 0.634 0.278
甘肃 0.105 0.599 0.370 0.217
内蒙 0.114 0.688 0.401 0.298
新疆 0.178 0.986 0.682 0.326
3 讨论
本试验建立了同时测定欧亚旋覆花中 4种黄酮化合物(菠
叶素 、槲皮素 、木犀草素 、 6-甲氧基-木犀草素)的 RP -
HPLC法 ,方法简单、灵敏 、准确 、重现性好 ,可用于欧亚旋覆花
药材及其制剂的质量控制。
在 190 ～ 760 nm波长范围内 ,应用二极管阵列检测器对菠
叶素 、槲皮素 、木犀草素、6-甲氧基-木犀草素进行检测 。结
果 ,菠叶素在 210和 360 nm 、槲皮素在 260和 370 nm 、木犀草
素在 210和 360 nm 、 6-甲氧基木犀草素在 360 nm 波长处均
有最大吸收 。可见 , 360 nm 为各成分共有的吸收波长 , 故选择
360 nm为检测波长 。
通过对山西 、河北安国 、甘肃 、江苏、河南 、内蒙 、新疆 7个
产地欧亚旋覆花中 4种黄酮化合物的含量测定结果表明 , 不同
产地之间的黄酮含量有差异:山西产欧亚旋覆花中 4种黄酮化
合物总含量最高;江苏产欧亚旋覆花中菠叶素的含量比其他几
个产地高出几倍 。可见 ,生态环境影响了药材有效成分的积累 ,
估计与植物来源 、品种基因 、生长温度 、采收季节 、干燥过程和
贮存条件等因素有关 。因此 , 根据有效成分的含量确定药材的
种植基地是非常必要的 。
参考文献
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(收稿日期:2008-10-04 修回日期:2009-01-19)