全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2013年 第38卷 第2期生物工程
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收稿日期：2012-04-11 *通讯作者
作者简介：方琼(1978—)，女，硕士研究生，研究方向为应用微生物学。
微生物色素是微生物的次生代谢产物[1]，与
方 琼，刘朝贵*，陈仁玉
(西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，
重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715)
摘要：首次以远东疣柄牛肝菌为材料，对其发酵产色素的条件进行研究。通过单因素试验选
出远东疣柄牛肝菌发酵产色素的最佳碳源是麦芽糖、最佳氮源是玉米浆干粉，利用Plackett-
Burman设计筛选出影响其产色素的2个显著因素：装液量和培养时间，通过最陡爬坡试验和中心
组合设计确定最优发酵条件为：麦芽糖20 g/L、玉米浆干粉5 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4·7H2O
1.5 g/L、VB1 0.01 g/L、培养温度27 ℃、培养时间141.85 h、装液量87.70 mL，优化后的色素含量
比优化前提高了11.37倍。
关键词：远东疣柄牛肝菌；色素；发酵；响应面分析
中图分类号：TS 201.3 文献标志码：B 文章编号：1005-9989(2013)02-0006-04
Optimization on fermentation conditions for pigment of Leccinum
extremiorientale by response surface methodology
FANG Qiong, LIU Chao-gui*, CHEN Ren-yu
(College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Key
Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of
Education, Chongqing Key Laboratory of Olericulture, Chongqing 400715)
Abstract: The fermentation of pigment production with Leccinum extremiorientale was studied at
the first time. The optimal carbon source and nitrogen source for pigment production with Leccinum
extremiorientale were obtained by monofactorial experiment, which were maltose and corn steep
respectively; the fermentation time and liquid volume were found to have major effects on pigment
production through Plackett-Burman experimental design; the steepest ascent experiment and response
surface analysis were used to estimate optimum fermentation conditions: maltose 20 g/L, corn steep 5
g/L, KH2PO4 3 g/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, VB1 0.01 g/L, temperature 27 ℃, fermentation time 141.85 h,
liquid volume 87.70 mL, and the maximum production of pigment under optimum conditions was improved
11.37fold compared to the original conditions.
Key words: Leccinum extremiorientale; pigment; fermentation; response surface methodology
响应面法优化远东疣柄牛肝菌
发酵产色素的条件
动、植物色素相比较，不易受气候、地域等因素
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FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第2期 生物工程
1.2.3 色素含量的测定 发酵液离心5000 r/min、
20 min，去离子水洗涤菌丝体2次，收集菌丝体，
真空冷冻干燥，粉碎至60目保存备用。精确称取
菌丝粉0.200 g，加入90%乙醇，超声波破碎提取50
min。提取液离心5000 r/min、20 min，取上清液稀
释10倍，以90%乙醇为空白，测量410 nm处的吸光
度，以吸光度值作为衡量色素含量的标准。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 最适碳源的选择 分别以20 g/L的葡萄糖、
蔗糖、麦芽糖、乳糖、玉米粉、可溶性淀粉作为
碳源，其余条件与基础发酵培养基相同，进行最
适碳源的筛选。结果见图1，以20 g/L的麦芽糖作
为碳源时效果最好，色素吸光度值达到0.272。
影响，适于规模化生产，是一类优良的天然色素
来源[2]。目前，国内外对微生物色素的研究多见
于利用红曲霉产红曲色素[3-5]，利用酵母产类胡
萝卜素[6]，利用三孢布拉霉产类胡萝卜素[7]等。
远东疣柄牛肝菌(Leccinum extremiorientale)隶属
于真菌门担子菌亚门层菌纲伞菌目牛肝菌科疣柄
牛肝菌属[8]，菌体可食[9]，美味滑口[10]，已从子
实体中分离出麦角甾醇等13种化合物[11]。作者在
研究中发现远东疣柄牛肝菌的菌丝体提取液呈黄
色，而目前尚未见对此真菌发酵产色素的报道，
因此对远东疣柄牛肝菌发酵产色素的条件进行研
究，以期为这一天然色素的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
1.1.1 菌株 远东疣柄牛肝菌(Leccinum extremio-
rientale)，西南大学食用菌研究室分离保藏菌株。
1.1.2 培养基 种子培养基(g/L)：马铃薯200，葡
萄糖20，KH2PO4 3，MgSO4·7H2O 1.5，VB1 0.01，
pH自然；基础发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母
膏5，KH2PO4 3，MgSO4·7H2O 1.5，VB1 0.01，pH
自然。
1.1.3 试剂 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、
玉米粉、可溶性淀粉、酵母膏、玉米浆干粉、
蛋白胨、牛肉膏、乙醇、(NH4)2SO4、NH4NO3、
KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1：国产分析纯。
1.1.4 主要仪器 UV-1800型紫外可见分光光度
计：日本日立公司；SCIENTZ-ⅡD型超声波细
胞破碎机：宁波新芝生物科技公司；5810R型高
速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；DU-2200型
超低温真空干燥机：东京理化仪器株式会社；
N-1100S-WD型旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限
公司。
1.2 方法
1.2.1 菌种的活化 将保藏菌株接种至平板种子培
养基上，27 ℃培养120 h，打取菌丝块于装有100
mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，27 ℃培养
60 h，以10%的接种量接到装有100 mL基础发酵培
养基的250 mL三角瓶中，27 ℃培养120 h。
1.2.2 发酵条件的优化 通过单因素试验筛选出适
宜的氮源、碳源，再以Plackett-Burman设计筛选
的显著因素做爬坡试验逼近最佳值区域，最后通
过中心组合设计拟合出多项回归模型，确定远东
疣柄牛肝菌发酵产色素的最优条件。
图1 不同碳源对远东疣柄牛肝菌产色素的影响
图2 不同氮源对远东疣柄牛肝菌产色素的影响
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2.1.2 最适氮源的选择 以20 g/L的麦芽糖作为碳
源，分别以5 g/L的酵母膏、玉米浆干粉、蛋白
胨、牛肉膏、(NH4)2SO4、NH4NO3作为氮源，其余
条件与基础发酵培养基相同，进行最适氮源的筛
选。结果见图2，以5 g/L的玉米浆干粉作为氮源时
效果最好，色素吸光度值达到0.346。
2.2 Plackett-Burman设计筛选显著因素
Plackett-Burman试验设计可从多个因素中选
取对试验指标有显著影响的因素。运用Design-
Expert软件，采用试验次数N=12的设计，对8个因
素进行考察，预留3个空项以估计试验误差。每个
因素取高(+1)、低(-1)2个水平，响应值为色素吸光
度值。试验设计和结果见表1，各因素主要效应和
评价见表2。
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1953年，商业化的乳酸菌素Nisin在英国问世至
今，已被60多个国家和地区作为纯天然的食品防
腐剂、保鲜剂[6-7]。当前，国内外关于乳酸菌、乳
酸菌素的文献报道，主要集中在新菌株和高产菌
株的筛选以及已知乳酸菌素结构基因的鉴定及其
改性上，而对其抑菌谱的研究较少[8-13]。此外，
表1 Plackett-Burman试验设计和结果
试验
号
因素
吸光度
A B C D E F G H I J K
1 +1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 0.349
2 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 +1 0.142
3 -1 -1 -1 -1 +1 +1 -1 +1 +1 +1 -1 0.457
4 -1 +1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 0.318
5 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 -1 +1 -1 +1 0.126
6 -1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 -1 -1 -1 -1 0.336
7 -1 +1 -1 -1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 0.094
8 +1 -1 +1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 0.357
9 -1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 0.125
10 +1 +1 -1 -1 -1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 0.105
11 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 0.418
12 +1 +1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 0.432
表2 Plackett-Burman试验设计因素效应及评价
代码 因素 低水平(-1)
高水
平(+1) 效应 P值
A 麦芽糖/(g/L) 15 25 0.026 0.0741
B 玉米浆干粉/(g/L) 4 6 0.023 0.1000
C 空项
D KH2PO4/(g/L) 2.5 3.5 -0.023 0.1000
E MgSO4·7H2O/(g/L) 1 2 0.026 0.0774
F 空项
G VB1/(g/L) 8 12
8.083E-
003 0.4674
H 培养温度/℃ 25 29 0.014 0.2574
I 空项
J 培养时间/h 96 144 0.050 0.0141*
K 装液量/mL 80 120 -0.110 0.0014**
注：*.P<0.05，差异显著；**. P<0.01，差异极显著。
由表2可知，在上述8个影响色素吸光度值的
因素中，麦芽糖、玉米浆干粉、MgSO4·7H2O、
VB1、培养温度、培养时间为正效应，KH2PO4、
装 液 量 为 负 效 应 ， 各 因 素 对 色 素 吸 光 度 值 影
响大小依次为：装液量、培养时间、麦芽糖、
MgSO4·7H2O、培养温度、VB1、玉米浆干粉及
KH2PO4，其中装液量对色素影响达到极显著水
平，培养时间达到显著水平，可考虑作为重要因
素进行进一步的优化试验。
2.3 响应面法优化培养条件
2.3.1 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman设计筛
选出的主要影响因素效应值的正负及大小设计爬
坡方向和步长，进行最陡爬坡试验，以逼近色素
最大吸光度值区域，建立有效的拟合方程。最陡
爬坡试验设计及结果见表3，最大的吸光度值在第
3组附近，故以第3组的试验条件为水平中心点，
进行响应面试验设计。
表3 最陡爬坡试验设计及结果
试验号
因素
吸光度
培养时间/h J 装液量/mL K
1 108 70 0.191
2 120 80 0.208
3 132 90 0.487
4 144 100 0.349
5 156 110 0.334
2.3.2 中心组合试验设计 中心组合设计(Central
composite design，CCD)各因素及水平见表4，试验
设计及结果见表5。
表4 中心组合设计因素及水平
因素
水平
-1.41 -1 0 1 1.41
J 培养时间/h 115.03 120 132 144 148.97
K 装液量/mL 75.86 80 90 100 104.14
表5 中心组合设计试验及结果
试验号
因素
吸光度
J K
1 0 0 0.482
2 0 1.41 0.245
3 -1.41 0 0.227
4 -1 -1 0.205
5 0 0 0.489
6 0 0 0.493
7 0 -1.41 0.336
8 1.41 0 0.511
9 1 -1 0.458
10 -1 1 0.296
11 0 0 0.491
12 0 0 0.494
13 1 1 0.346
运用Design-Expert软件，拟合得多项式回归
模型：Y=0.49+0.10J-0.032K－0.051JK-0.061J2-
0.10K2+0.027J2K-0.025JK2。
此数学模型的多元回归分析结果见表6，模型
的P<0.0001，表明该模型显著，可用来进行响应
值预测；失拟项的P=0.3601，表明模型拟合程度
理想；复相关系数R2=0.9993，值越高表明则相关
性越好；校正决定系数R2Adj=0.9983，表明99.83%
的数据变异性可以用此回归模型来解释；变异系
数CV=1.23%，值越低则试验的可信度和精确度越
高；精密度(Adeq Precision)大于4视为合理，该试
验结果达到80.49。
由回归模型绘出培养时间和装液量对色素
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吸光度值影响的曲面图和等高线图(见图3)。通过
“快速登高法”对这2个显著因素进行寻优，优
化结果为培养时间141.85 h、装液量87.70 mL，此
条件下色素吸光度值的理论值为0.537。因此确
定远东疣柄牛肝菌发酵产色素的最优培养条件：
麦芽糖20 g/L，玉米浆干粉5 g/L，KH2PO4 3 g/L，
MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB1 0.01 g/L，培养温度27
℃，培养时间141.85 h，装液量87.70 mL。
2.4 模型验证
在上述发酵条件下重复3次试验，远东疣柄牛
肝菌发酵产色素的吸光度平均值为0.532，与预测
值的误差为0.93%，说明该模型可以较好地预测实
际发酵情况。以基础发酵培养基及培养条件为对
照组的色素吸光度值为0.043，优化后的色素实测
值比优化前的提高了11.37倍。
3 结论
通过单因素试验确定远东疣柄牛肝菌发酵产
色素的最佳碳源是麦芽糖、氮源是玉米浆干粉，
再运用Plackett-Burman设计筛选出影响产色素的
显著因素：培养时间、装液量，接着对这2个因素
进行最陡爬坡试验，以逼近最大值区域，最后通
过中心组合设计建立回归模型，获得的最佳培养
条件：麦芽糖20 g/L，玉米浆干粉5 g/L，KH2PO4 3
g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB1 0.01 g/L，培养温
度27 ℃，培养时间141.85 h，装液量87.70 mL，该
模型的试验结果与预测结果一致性较高，优化后
的色素含量比优化前提高了11.37倍，说明此模型
是合理有效的，并为此天然色素的深入研究和利
用提供技术支持。
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图3 培养时间和装液量对远东疣柄牛肝菌产色素影响的
响应曲面图和等高线图
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表6 回归模型的方差分析
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 0.16 7 0.024 1021.97 <0.0001
J 0.040 1 0.040 1753.28 <0.0001
K 4.146E-003 1 4.146E-003 180.25 <0.0001
JK 0.010 1 0.010 447.90 <0.0001
J2 0.026 1 0.026 1135.40 <0.0001
K2 0.070 1 0.070 3056.26 <0.0001
J2K 1.452E-003 1 1.452E-003 63.14 0.0005
JK2 1.216E-003 1 1.216E-003 52.89 0.0008
误差 1.150E-003 5 2.300E-005
失拟项 2.421E-003 1 2.421E-005 1.07 0.3601
纯误差 9.080E-003 4 2.270E-005
总和 0.16 12
R2=0.9993 R2Adj=0.9983
CV= 1.23% AdeqPrecision=80.409
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收稿日期：2012-05-14
作者简介：魏淑珍(1966—)，女，河北衡水人，教授，研究方向为微生物。
魏淑珍，吴荣荣，李 辉
(衡水学院，衡水 053000)
摘要：为研究嗜酸乳杆菌的生长刺激因子，初步研究了黄瓜、番茄、胡萝卜天然提取汁对嗜酸
乳杆菌HS111菌种生长的影响。由单因素刺激试验结果得出：5%黄瓜汁、10%番茄汁、12%胡
萝卜汁为HS111菌种的最佳刺激浓度；由正交试验L9(3
3)得出的最佳天然刺激因子组合为3%胡萝
卜汁、3%黄瓜汁和12%番茄汁。因此，黄瓜、番茄、胡萝卜天然提取汁对嗜酸乳杆菌HS111菌
种生长有促进作用，可提高活菌的数量，进而为人体肠道益生菌刺激因子的研究和健康饮食提
供理论依据。
关键词：嗜酸乳杆菌；生长刺激因子；单因素试验；正交试验
中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)02-0010-03
Several vegetables juice affect the growth of Lactobacillus acidophilus
HS111 strains
WEI Shu-zhen, WU Rong-rong, LI Hui
(Hengshui University, Hengshui 053000)
Abstract: To study the growth stimulators of Lactobacillus acidophilus, the preliminary study on the
effects of natural cucumber, tomato and carrot to growing of HS111 bacterias. The results showed that 5%
cucumber juice, 10% tomato juice, 12% carrot juice all had marked effects to growing of HS111 bacterias
in single factor test. The best combine is 3% carrot juice, 3% cucumber juice and 12% tomato juice in
orthogonal test. Thus, natural growth stimulators can promote the growth of HS111 bacterias, and raise
the number of living Lactobacillus acidophilus. And then providing a theoretical basis for researching
几种蔬菜提取汁对嗜酸乳杆菌
HS111菌种生长的影响
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