全 文 ：[收稿日期 ] 2003-05-27
[作者简介 ]郑作文 ( 1957— ) ,男 ,山东沂源人 ,副研究员 ,主要
从事药理学教学与抗病毒药物研究。
·实验研究·
藤茶总黄酮在 2215细胞培养中对乙型肝炎病毒 HBsAg、 HBeAg
和 HBV-DN A的抑制作用
郑作文
(广西中医学院 ,广西 南宁 530001)
　 　 [摘要 ]目的: 观察藤茶总黄酮在 HBV基因转染的人肝癌细胞系 2215培养中对细菌的毒性、 HBs Ag和
HBeAg分泌的影响及对细胞 HBV-DN A合成的抑制作用。 方法: 药物对细胞的毒性实验 ,接种 2215细胞后 24 h,
加入药物培养 8 d观察细胞病变。 在无毒的药物浓度下 ,将药物加入 2215细胞培养 8 d收集培养液 ,测定 HBs Ag
和 HBeAg水平。将药物加入 2215细胞培养 8 d,提取 DNA,用 HBV-DNA探针作斑点杂交 ,酶标仪测定 OD值。结
果: 藤茶总黄酮半数细胞毒浓度 ( TC50 )为 125μg· ml- 1 ,最大无毒浓度 ( TC0 )为 62. 5μg· ml- 1;在最大无毒浓度时
对 2215细胞分泌的 HBs Ag抑制率为 43. 14% ,半数有效剂量 ( IC50 )为 40. 21μg· m l- 1 ,治疗指数 ( SI)为 3. 11;对
2215细胞分泌的 HBeAg抑制率为 33. 76% ;对 HBV-DN A有一定抑制作用。
[关键词 ]藤茶总黄酮 ; 2215细胞 ; HBsAg; HBeAg; HBV-DN A
[中图分类号 ] R285. 5　　　 [文献标识码 ] A　　　 [文章编号 ] 0257-358X ( 2003) 09-0561-03
　　藤茶为显齿葡萄 Ampelopsisgroossedentata ( Ha-
nd-Mazz) w. T. w ang的嫩茎叶 ,具有清热解毒、 消
肿止痛等功效 , 主治黄疸型肝炎、 感冒风热、 咽喉
肿痛等 [1, 2 ]。藤茶中主要有效成分为黄酮类化合物 ,
含量约 45. 52% [3 ]。据报道 [ 4] ,藤茶总黄酮具有降血
脂、 降血糖、 抗氧化、 抗菌等作用。 本文对藤茶总
黄酮在 2215细胞培养中对乙型肝炎病毒 HBsAg、
HBeAg和 HBV-DNA的抑制作用进行了研究 , 现
报道如下。
1　材料
1. 1　药物　藤茶总黄酮由本院中药化学教研室参
考文献方法提取分离 [3 ] ,为一淡黄色粉状结晶。
1. 2　 2215细胞　 HBV -DNA克隆转染人肝癌细胞
2215细胞系 (购自中国医学科学院生物技术研究
所 )。
1. 3　试剂　 Eag les MEM干粉 (美国 Gibco公司产
品 ) ; G418(美国 Gibco公司产品 ) ; L-谷氨酰胺 (京
科化学试剂公司进口分装 ) ; 胎牛血清 (美国
Hyolone Lab公司产品 ) ; HBs Ag、 HBeAg固相放射
免疫测定盒 (中国同位素公司北方免疫试剂研究所
产品 ) ;卡那霉素 ( Sigma分装 )。
1. 4　器材　培养瓶 (丹麦 Tunclon公司产品 ) ; 96、
24孔培养板 (美国 Co rning公司产品 ) ;二氧化碳培
养箱 (美国 Shel-lab公司产品 )。
1. 5　培养液及试剂配制　 MEM培养液含 10%胎
牛血清、 0. 03%谷氨酰胺、 G418 380μm· ml- 1、卡
那霉素 50U /ml ,用 5%碳酸氢钠调 pH至 7. 0。细胞
消化液含 0. 25%胰酶 ,用 D-Hangs配制。
2　方法与结果
2. 1　 2215细胞培养 [5 ]　在长满 2215细胞的培养
瓶内加 0. 25%胰酶 , 37℃消化 3～ 4 min,加培养液
吹打 ; 1∶ 3传代 , 10 d长满。消化后计数 ,配制成 10
× 104 /ml个细胞接种于 96孔培养板 ,每孔 0. 2 ml,
24孔培养板 ,每孔 1 ml, 37℃ , 5% CO2培养 24 h,细
胞长成单层后进行以下实验。
2. 2　藤茶总黄酮在 2215细胞培养中的细胞毒性试
验　药物用培养液配制成 2 mg· ml- 1溶液 , 2倍稀
释加入 96孔细胞培养板 ,每浓度 4孔 ,共 8个浓度 ,
分别为 1000μg· ml- 1、 500μg· ml- 1、 250μg·
ml- 1、 125μg· ml- 1、 62. 5 μg· ml- 1、 31. 25μg·
ml
- 1、 15. 63μg· ml- 1、 7. 81μg· ml- 1。每 4天换同
浓度药液 , 8 d后显微镜下观察细胞病变 ,以观察细
胞病变 ( CPE)为指标 ,完全破坏为 4; 75%为 3; 50%
为 2; 25%为 1;无病变为 0。计算每浓度药液平均细
·561·山东中医杂志 2003年 9月第 22卷第 9期
胞病变程度和抑制率。按 Reed-M uench法计算半数
有毒浓度 ( TC50 )和最大无毒浓度 ( TC0 )。 结果见表
1。
TC50= Antilog ( B+
50- B
A- B
× C)
A= log> 50%药物浓度 , B= log < 50%药物浓
度 , C= lo g释稀倍数
表 1　藤茶总黄酮在 2215细胞培养中的细胞毒性
药物浓度
不同药物浓度 (μg· ml- 1 )　细胞病变
1000 500 250 125 62. 5 31. 3 15. 6
TC50　　 TC0
(μg· ml- 1 )
CPE
破坏 (% )
4
4
4
4
100
4
4
4
4
100
4
4
4
4
100
2
2
2
2
50
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
125 62. 5
　
　
　
　
　　结果表明 ,藤茶总黄酮在 2215细胞培养中的细
胞毒性 TC50为 125μg ml- 1 , TC0为 62. 5μg ml- 1。
2. 3　藤茶总黄酮在 2215细胞培养中对 HBsAg、
HBeAg分泌的抑制作用　药物用细胞培养液稀释 ,
4个稀释度分别为 62. 5μg ml- 1、 31. 25μg ml- 1、
15. 63μg ml- 1、 7. 81μg ml- 1 ,每浓度 3孔。 37℃ ,
5% CO2培养 ,每 4天换原浓度药液培养 ,第 8天时
收取培养液 , -20℃冰冻保存。用固相放射免疫测定
盒测定 HBsAg和 HBeAg ,方法见说明书 ;用γ-计数
仪测定每孔药液 cpm值。 药物效果按下式计算 ,并
进行组间 t检验。结果见表 2,表 3。
抗原抑制百分率 (% )=
细胞对照 cpm-给药组 cpm
细胞对照 cpm × 100%
药物抑制抗原半数有效浓度 ( IC50 )= Antilo g( B
+
50- B
A- B
× C)
A= log> 50%药物浓度 , B= log < 50%药物浓
度 , C= lo g释稀倍数。
药物治疗指数 ( SI)= 半数有毒浓度 ( TC50 )半数有效浓度 ( IC50 )
结果表明 ,藤茶总黄酮在 2215细胞培养中对
HBsAg有明显的抑制作用 ,且随着剂量的增加 ,其
抑制作用增强。 62. 5 μg ml- 1、 31. 25 μg ml- 1、
15. 63μg ml- 1、 7. 81μg ml- 1的药物浓度时抑制率
分别为 43. 14% 、 36. 54% 、 25. 87% 、 16. 43% , IC50为
40. 21μg· ml- 1 , SI为 3. 11;对 HBeAg也有明显抑
制作用。 在 62. 5μg· ml- 1药物浓度时抑制率为
33. 76%。
表 2　藤茶总黄酮在 2215细胞培养中对乙肝 HBsAg的
抑制作用 ( n = 3, x ± s ) ρ/pg· ml- 1
药物浓度 CPM值 抑制率
(% )
IC50 SI
藤茶总黄酮
细胞对照
62. 5
31. 3
15. 6
7. 8
—
10558± 739* *
11784± 1425* *
13766± 949* *
15518± 650* *
18570± 744
43. 14
36. 54
25. 87
16. 43
—
40. 21
　
　
3. 11
　
　
　　与细胞对照组比较* P < 0. 05,* * P < 0. 01,下同
表 3　藤茶总黄酮在 2215细胞培养中对乙肝 HBeAg的
抑制作用 ( n = 3, x ± s ) ρ/pg· ml- 1
药物浓度 CPM值 抑制率
(% )
IC50 SI
藤茶总黄酮
细胞对照
62. 5
31. 3
15. 6
7. 8
—
10892± 853* *
15992± 892
17018± 1055
16320± 1213
16444± 666
33. 76
3. 17
0
0. 75
—
> 62. 5 —
2. 4　藤茶总黄酮在 2215细胞培养中对 HBV-DNA
合成的抑制作用　 2215接种 24孔细胞培养板 ,每
孔 1 m l,接种后 24 h加药物 ,每 4天换原浓度药液
培养 ,培养第 8天收取上清液 ,聚乙二醇沉淀 ,经蛋
白酶 K裂解。 用苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提 ,加无水
乙醇沉淀核酸 ,真空抽干 ,重溶于 TE缓冲液中作样
品 ,用 HBV-DNA探针作斑点杂交 ,用酶标仪测定
OD值。抑制率按下式计算 ,并进行组间 t检验。 结
果见表 4。
抑制百分率 (% )=
细胞对照 IOD-给药组 IOD
细胞对照 IOD × 100%
结果表明 ,藤茶总黄酮在 2215细胞培养中对
HBV-DNA有一定的抑制作用。 62. 5 μg ml- 1、
31. 25μg ml- 1、 15. 63μg ml- 1、 7. 81μg ml- 1的药
物浓度时平均抑制率分别为 13. 88%、 9. 67% 、
·562· 山东中医杂志 2003年 9月第 22卷第 9期
4. 67% 、 0%。
表 4　藤茶总黄酮在 2215细胞培养中对 HBV-DNA的
抑制作用 ( n = 3,x ± s )
药物浓度
(ρ/μg· ml- 1 ) IOD值
平均抑制率
(% )
稀释
倍数
藤茶总黄酮
细胞对照
62. 5
31. 3
15. 6
7. 8
—
1273. 98± 104. 16*
1335. 93± 91. 58
1410. 08± 112. 06
1580. 13± 69. 49
1479. 23± 65. 13
13. 88
9. 69
4. 67
0
—
　
　
2
　
　
4　小结
HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞 2215细胞系
是体外筛选抗乙肝病毒药物的有效方法。 以上实验
结果表明 ,藤茶总黄酮最大无毒浓度 ( TC50 )为 62. 5
μg ml- 1 ,在最大无毒浓度时藤茶总黄酮对 2215细
胞分泌的 HBsAg抑制率为 43. 14% ,半数有效剂量
( IC5 0 )为 40. 21μg ml- 1 ,治疗指数 ( SI)为 3. 11;对
2215细胞分泌的 HBeAg 抑制率为 33. 76% ; 对
HBV-DNA也有一定抑制作用。 本实验为临床进一
步研究提供了依据。 至于藤茶总黄酮对体内抗乙肝
病毒的作用机制尚有待进一步研究。
[参考文献 ]
[1 ]广西壮族自治区中医研究所 .广西药用植物名录 [M ] .南宁:广
西人民出版社 , 1986. 300.
[2 ]全国中草药汇编编写组 . 全国中草药汇编 (下册 ) [M ] .北京:人
民卫生出版社 , 1978. 789.
[ 3 ]周桂霞 ,何群 ,裴刚 ,等 . 瑶族藤茶中总黄酮类成分的含量测定
[ J] .湖南中医药学报 , 1999, 5( 12): 30.
[ 4 ] 钟正贤 ,陈学芬 ,周桂芬 ,等 . 广西产藤茶总黄酮的药理研究
[ J] .广西科学 , 1999, 6( 3): 216.
[ 5 ]傅希贤 ,张乃临 ,张国庆 . 试用 2215细胞进行乙肝病毒药物实
验的初步结果 [ J ] . 中华实验和临床病毒学杂志 , 1992, 6 ( 2):
143.
[收稿日期 ] 2003-05-05
[基金项目 ]山东省科技厅资助课题 (编号 991205917)
[作者简介 ]张文东 ( 1961— ) ,男 ,山东济南人 ,主管药师。 通讯
作者:张岫美 ( 1951— ) ,男 ,教授 ,博士生导师 ,主要研究方向心脑血
管药理学。
复方珍珠散抗口腔溃疡作用的实验研究
张文东 1 ,刘玉娥 2 ,魏欣冰 2 ,刘慧青 2 ,李爱国 3 ,陈晓阳 2 ,李朝武 1 ,张岫美 2
( 1.山东大学齐鲁医院 ,山东 济南 200012; 2.山东大学医学院 ,山东 济南 250012; 3.山东大学药学院 ,山东
济南 250012)
　　 [摘要 ]目的: 制备口腔溃疡的动物模型 ,研究复方珍珠散治疗口腔溃疡的作用并初步探讨其安全性。 方法:以
醋酸致豚鼠口腔溃疡模型 ,观察复方珍珠散的治疗作用和皮肤用药的安全性。结果: 复方珍珠散能明显缩小由醋酸
致豚鼠口腔溃疡的面积 ;无明显的皮肤过敏作用。 结论:复方珍珠散有明显的抗口腔溃疡作用 ,外用安全。
[关键词 ]复方珍珠散 ;口腔溃疡 ;实验药理
[中图分类号 ] R285. 5　　　 [文献标识码 ] A　　　 [文章编号 ] 0257-358X ( 2003) 09-0563-03
　　复方珍珠散是由以珍珠、牛黄、麝香、硼砂、朱
砂、雄黄、冰片及薄荷脑等为主要成分的祖传验方制
成的散剂 ,治疗口腔溃疡已有 80余年的历史 ,临床
证明有独特疗效。 我们对复方珍珠散的制备工艺和
质量标准进行了研究 ,药理学实验证明 ,复方珍珠散
有明显的抗炎镇痛作用。本文报告复方珍珠散对醋
酸法动物口腔溃疡模型的治疗作用及皮肤用药的安
全性研究结果。
1　实验材料
1. 1　药品及配制方法　复方珍珠散 ,山东大学齐鲁
医院提供 ,主要成分珍珠、牛黄、麝香、硼砂、朱砂、雄
黄、冰片及薄荷脑等 ,散剂用 50%甘油配成 2∶ 1的
混悬剂 ,每只每次 0. 1 ml,高剂量组每日涂药 2次 ,
低剂量组涂药每天 1次 ,涂抹口腔。锡类散 ,江苏南
通中诚制药有限公司生产 ,批号: 981005。甘油 ,山东
化学研究所提供 ,批号: 910812,配成 50%浓度备
用。
·563·山东中医杂志 2003年 9月第 22卷第 9期