全 文 ：食品科学 现代农业科技 2011年第 12期
苋菜红和亮蓝可混合调配出类似紫葡萄的颜色，是碳
酸饮料中的常用色素，但是长期过量食用这种偶氮类合成
着色剂有致癌的危险，属于国家明令限量添加的食品添加
剂 [1]。《食品中合成着色剂的测定（GB/T 5009.35-2003）》 [2]规
定了色素的液谱检测方法，但其存在提取步骤多、样品易损
耗的缺点。由于碳酸饮料是以水为主体，加入了防腐剂、色
素、甜味剂等添加剂等配制而成，成分较为单一，因而用直
接进样法检测，既简便省时，又能提高提取效率。目前，化学
分析中不确定度评定是以《化学分析中不确定度的评估指南
（CNAS-GL06：2006）》 [3]为指导，在建立的数学模型的基础
上，充分分析不确定度分量的来源，对各不确定度分量进行
评定，计算合成不确定度及扩展不确定度，并由此可得到各
不确定度分量对总不确定度的贡献 [4]，通常贡献较大的不确
定度分量是检测方法优化的方向。现对直接进样法结合高
效液相色谱检测饮料中的苋菜红和亮蓝进行不确定度评估，
以分析各不确定度分量的来源，明确各不确定度分量对结果
的影响程度，对优化检测方法，提升实验室色谱分析能力，
有效监测实验室在化学分析中的质量控制有重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为市售葡萄味碳酸饮料。试剂：苋菜红标准溶
液，0.50 mg/mL，GBW（E）100002a，U=1%，k=2；亮蓝标准溶
液，GBW（E）100005 a，0.50 mg/mL，U=1%，k=2，均来自中国
计量科学研究院；甲醛（色谱纯），德国 Merck 公司；水相针
式滤器（13 mm×0.45 μm），上海安谱科学仪器有限公司。
1.2 试验仪器
Agilent1200 高效液相色谱仪 ：配有在线脱气机 ，四元
泵、柱温箱、自动进样器 、DAD 检测器 ，美国安捷伦公司 ；
Millipore Milli-Q Academic 纯水机，美国密理博（上海）贸易
有限公司；电子天平 AL204 型，瑞士 METTLER TOLEDO。
1.3 试验条件
1.3.1 色谱条件。色谱柱：Eclipse XDB-C18 柱（5 μm，4.6×
150 mm）；流动相：甲醇：乙酸铵（0.02 mol/L）；梯度洗脱程序：
甲醇 ：20% ～35% ，3% /min；35% ～98% ，9% /min；98%保持 6
min；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；进样体积：10 μL；
柱温：20.0℃。
1.3.2 试验方法。准确称取碳酸饮料 10.151 9 g 于 50 mL 容
量瓶中，超声波脱气 30 min，用氨水调节溶液的 pH 值至中
性，超纯水定容至刻度，经 0.45 μm 滤膜过滤后直接进样，
并用外标法的单点校正法对样品液中的色素进行定量分
析。加标回收试验也采用同样的分析方法。试验均在环境温
度为（20±5）℃的条件下进行。
2 结果与分析
2.1 数学模型
X= A1×C0×V1
A0×m1×f
式中，X为试样中着色剂的含量（g/kg）；A1为试样中着色
剂的峰面积（mAU·min）；C0 为标准溶液的浓度（mg/mL）；V1
为试样定容总体积（mL）；A0为标准溶液中着色剂的峰面积
（mAU·min）；m1为试样称样质量（g）；f为回收率校正因子。
2.2 不确定度来源的分析
根据不确定度评估指南、试验过程及最终结果的计算
公式 [2-3]，确定了试样和标液的峰面积、标液浓度、样品称量
质量、稀释总体积和方法的回收率为主要不确定度分量。此
外，《食品中合成着色剂的测定（GB/T5009.35-2003）》[2]标准
明确规定计算结果保留 2 位有效数字，因而由数字修约引
反相高效液相色谱法检测葡萄味碳酸饮料中苋菜红和亮蓝的不确定度评定
胡 云 1 严志刚 2
（1扬州市产品质量监督检验所，江苏扬州 225000； 2扬州市第一人民医院）
摘要 对碳酸饮料中苋菜红、亮蓝的液相色谱分析方法进行了不确定度评定，为直接进样法检测合成着色剂的色谱条件优化及试验
过程质量控制提供了科学的依据。根据《化学分析中不确定度评估指南》重点对峰面积、标准溶液浓度、样品称重、样品定容体积、回收率和数
值修约等不确定度分量逐一进行了评定，并计算合成不确定度和扩展不确定度，结果为 m 苋=0.014±0.000 32 g/kg，k=2；m 亮=0.014±0.000 51
g/kg，k=2。各不确定度分量对总不确定度的贡献按由高到低顺序排列为峰面积＞标液浓度＞回收率＞数值修约＞样品定容体积＞样品称重。
关键词 反相高效液相色谱；苋菜红；亮蓝；不确定度评定
中图分类号 O657.7+2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）12-0328-03
Estimation of Measurement Uncertainty of Determination of Amaranth and Blue brilliant in Grape Sodas by
Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography
HU Yun 1 YAN Zhi-gang 2
（1 Yangzhou Products Quality Supervison and Inspection Institute，Yangzhou Jiangsu 225000； 2Yangzhou No.1 People’s Hospital）
Abstract A uncertainty estimation procedure was developed for analysis of amaranth and blue brilliant in sodas and this HPLC analysis of
synthetic colour provided a scientific evidence for a optimized chromatographic method and quality control in analysis procedure of direct injection. In
quantification of uncertainty components，some important uncertainty sources such as peak area，standard concentration，mass of sample，volume of
sample，recovery and rounding off for values were calculated in sequence based on GUM.At the same time，computation of combined uncertainty and
expanded uncertainty were presented as follows：m=0.014±0.000 32 g/kg and k=2 for amaranth；m=0.014±0.000 51 g/kg and k=2 for blue brilliant.The level
of uncertainty contribution followed the order：peak area＞standard concentration＞recovery＞rounding off for values＞volume of sample＞mass of sample.
Key words reversed-phase high performance liquid chromatography（RHPLC）；amaranth；blue brilliant；estimation of measurement uncertainty
作者简介 胡云（1979-），女，江苏扬州人，工程师，硕士，从事食品及
相关产品的安全性研究工作。
收稿日期 2011-05-16
328
起的不确定度（R）也一并考虑在内（图 1）。评定只考虑了样
品分析过程中的不确定度，而产品在生产过程中由自身的
非均匀性引起的不确定度并未考虑在内。
2.3 各不确定度分量的评定
采用相对标准不确定度对各分量进行评定，此计算结
果保留 3 位有效数字。
2.3.1 分析用标准溶液的不确定度。具体如下：①标准物质
证书提供的不确定度由标准物质证书可知，苋菜红和亮蓝
标准溶液的相对扩展不确定度均为±1%，k=2，服从正态分
布，则相对标准不确定度：Urel1=1%/2=5.00×10-3（B 类），ν=∞。
②标准溶液的稀释引入的不确定度。根据标准 [2]，用吸量管
吸取浓度为 0.50 mg/mL 的各标准溶液 10 mL 于 100 mL 容
量瓶中，加水稀释并定容至刻度，即得分析用标准溶液。可
见，稀释过程产生的不确定的主要来源是容量瓶和吸量管。
具体分析过程如下：一是由试验容器的容量允差引入的不
确定度。根据《常用玻璃量器检定规程（JJG196-2006）》[5]，10
mL A 级单标线吸量管容量允差是±0.020 mL，按三角分布考
虑，则相对标准不确定度：Urel=0.020 mL/（ 6姨 ×10 mL）=8.16×
10-4（B 类），ν=∞。而 100 mL A 级单标线容量瓶容量允差是±
0.10 mL，亦按三角分布考虑，则相对标准不确定度：Urel=0.10
mL/（ 6姨 ×100 mL）=4.08×10-4（B 类），ν=∞。二是由校准温度
波动引入的不确定度。实验室的温度波动范围最大为±5 ℃，
在 20℃时玻璃的体积膨胀系数为 25×10-6/℃，水的体积膨胀
系数是 21×10-5/℃，则容量瓶因校准温度变化引起的体积变
化 Δv=（21×10-5/℃－25×10-6/℃）×5 ℃×100 mL=0.092 5 mL，以
均匀分布处理，则相对不确定度：Urel=0.092 5 mL/（ 3姨 ×100
mL）=5.34×10-4（B类），ν=∞。同样，吸量管因校准温度变化引
起的体积变化 Δv=（21×10-5/℃－25×10-6/℃ ）×5 ℃×10 mL=
0.009 25 mL，服从均匀分布，相对标准不确定度：Urel=0.009 25
mL/（ 3姨 ×10 mL）= 5.34×10-4（B 类），ν=∞。三是由容量瓶读
数重复性引入的不确定度。经 10 次重复性试验，100 mL 容
量瓶的容量示值重复性读数标准偏差为 0.02 mL，则其相对
标准不确定度为 Urel=0.02 mL/100 mL=2.00×10-4（A 类），ν=9。
则由标准溶液稀释产生的不确定度如下：
Urel2=
（8.16×10-4）2+（4.08×10-4）2+（5.34×10-4）2+（5.34×10-4）2+（2.00×10-4）2姨
=1.20×10-3
综上 ，标准溶液的不确定度 ：UrelC0 = Urel12+Urel22姨 =
（5.00×10-3）2+（1.20×10-3）2姨 =5.14×10-3。
2.3.2 称量的不确定度。由天平的校准证书查得不确定度
U=0.6 mg，k=2，服从正态分布，考虑到称量经过了去皮和称
重 2 次过程，因而其校准不确定度：Urel=
2×（ 0.6
2
）2姨
m1×1 000
，经
计算 ：苋菜红 、亮蓝由天平校准引入的不确定度分别为 ：
4.18×10-5，ν= 1
2
[ Δμ（x）
μ（x）
]-2，属 A 类评定，由于是国家法定计
量部门出具的校准证书，认为， Δμ（x）
μ（x）
=0.10，则 ν=50。将样
品重复称重 10 次，得重复性称量的标准差 0.000 1 g，则相
对标准不确定度为 Urel= 0.000 1
10.001 5
=1.00×10-5（A 类），ν=9。
将校准不确定度和重复性不确定度合成，则苋菜红、亮
蓝的称量不确定度为 4.30×10-5。
2.3.3 样品定容体积的不确定度。①由容量瓶容量允差引入
的不确定度。由《常用玻璃量器检定规程（JJG196-2006）》 [5]
可知，50 mL A级单标线容量瓶容量允差是±0.05 mL，按三角
分布考虑，则相对标准不确定度：Urel=0.05 mL/（ 6姨 ×50mL）=
4.08×10-4（B 类），ν=∞。②由校准温度波动引入的不确定度。
实验室的温度波动范围最大为±5 ℃，在 20 ℃时玻璃的体积
膨胀系数为 25×10-6/℃，水的体积膨胀系数是 21×10-5/℃，则容
量瓶因校准温度变化引起的体积变化 Δv=（21×10-5/℃－25×
10-6/℃）×5 ℃×50 mL=4.62×10-2 mL，以均匀分布处理，则相对
标准不确定度 ：Urel=4.62×10-2 mL/（ 3姨 ×50 mL）=5.34×10-4
（B类），ν=∞。③由容量瓶读数重复性引入的不确定度 。经
10次重复性试验 ，50 mL 容量瓶的容量示值重复性读数
标准偏差为 0.01 mL，则其相对标准不确定度为 Urel=0.01
mL/50 mL=2.00×10-4（A 类），ν=9。可见，由样品定容体积产生
的不确定度：
UrelV1= （4.08×10-4）2+（5.34×10-4）2+（2.00×10-4）2姨 =7.01×10-4
2.3.4 标液（试样）峰面积的不确定度。色谱峰面积的不确
定度受分析仪器的性能指标及峰面积重复性积分的影响。
而液相色谱仪的性能指标主要为样针的体积精度、进样时
的样品携留、流动相流速、流动相组分精度、柱温、基线噪音
和检测波长校准这些方面 [6-7]。①进样体积的精密度及样品
携留引入的不确定度。根据仪器使用手册，当自动进样器的
进样量在 5～100 μL 时，其 RSD＜0.25%，按均匀分布处理，则
相应的相对标准不确定度 ：Urel=0.25%/ 3姨 =1.44×10-3（B
类），ν=∞。在对自动进样器使用外部洗针时，样品的携留量
小于0.05%，认为服从均匀分布，则其相对标准不确定度 ：
Urel=0.05%/ 3姨 =2.89×10-4（B 类），ν=∞。由自动进样器产生
的不确定度 ：Urel1= （1.44×10-3）2＋（2.89×10-4）2姨 =1.47×10-3，ν=
∞。②泵流量的设定值误差及稳定性误差引入的不确定度。
由校准证书可知，在泵流速为 1.0 mL/min 时，仪器泵流量设
定值误差的测量结果为 0.65%，按均匀分布考虑，其相对不
确定度：Urel=0.65%/ 3姨 =3.75×10-3（B 类），ν= 1
2
[ Δμ（x）
u（x）
]-2，
由于是国家法定计量部门出具的校准证书，认为， Δμ（x）
u（x）
=
图 1 饮料中合成着色剂的不确定度因果关系分析
校准
重复性
温度
稀释
校准
重复性
温度
校准 重复性
重复性
校准 线性
净重
重复性
线性
X
校准 校准
R m1fA1
A0 C0 V1
皮重
标准证书
胡 云等：反相高效液相色谱法检测葡萄味碳酸饮料中苋菜红和亮蓝的不确定度评定
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食品科学 现代农业科技 2011年第 12期
0.10，则 ν= 1
2
[0.10]-2=50。同样，在相同的流速下，仪器泵流
量稳定性误差的测量结果为 0.26%，仍然以均匀分布考虑，其
相对不确定度：Urel=0.26% ／ 3姨 =1.50×10-3（B类），ν=50。于是，
由流量产生的相对标准不确定度：
Urel2= （3.75×10-3）2+（1.50×10-3）2姨 =4.04×10-3。③流动
相组分精度引入的不确定度。流动相的组分精度在流速为
1.0 mL/min 时，其值小于 0.2% RSD，认为服从均匀分布 ，取
k= 3姨 ，其相对不确定度：Urel3=0.2%/ 3姨 =1.15×10-3（B类），
ν=∞。④柱温的精度引入的不确定度。柱温箱精度范围为±
0.15 ℃，则其 α=0.15 ℃，认为属于均匀分布，在此次试验中
柱温箱的设定温度为 20.0 ℃，则其相对标准不确定度为：
Urel4=0.15 ℃ ／ （ 3姨 ×20.0 ℃）=4.33×10-3（B 类），ν=∞。⑤基线
噪声和基线漂移引入的不确定度。检测器基线噪声经测定为
2×10-5AU，按均匀分布考虑。同时，色谱工作站的灵敏度为
0.000 001 mAU，则其相对标准不确定度 Urel=0.000 001AU×
10-3/（ 3姨 ×2×10-5AU）=2.89×10-5（B 类），ν= 1
2
[ Δμ（x）
u（x）
]-2，由
于校准证书来自国家法定计量部门，于是， Δμ（x）
u（x）
=0.10，则
ν= 1
2
[0.10]-2=50。 基线漂移值的检验结果为每小时 2.0×10-
4AU， 同样认为服从均匀分布， 在色谱工作站的灵敏度为
0.000 001 mAU 时，其相对标准不确定度 Urel=0.000 001 AU×
10-3/（ 3姨 ×2.0×10-4AU）=2.89×10-6（B 类 ），ν=50。可见，由
检测器基线噪音和基线漂移产生的不确定度：
Urel5= （2.89×10-5）2+（2.89×10-6）2姨 =2.90×10-5。⑥检测波
长的准确度及重复性引入的不确定度。根据校准证书，检
测波长示值误差为 1 nm，认为服从均匀分布 ，取 k=3，此
次试验中检测波长为 254 nm，则其相对标准不确定度 ：
Urel=1 nm/（ 3姨 ×254 nm）=2.27×10-3（B 类），ν= 1
2
[ Δμ（x）
u（x）
]-2，
由于校准证书来自国家法定计量部门，于是， Δμ（x）
u（x）
=0.10，
则 ν= 1
2
[0.10]-2=50。检测波长重复性亦为 1 nm，以均匀分布
考虑，此次试验中检测波长为 254 nm，则其相对标准不确
定度：Urel=1 nm/（ 3姨 ×254 nm）=2.27×10-3（B类），ν=50。由上，
检测波长产生的不确定度 Urel6= （2.27×10-3）2＋（2.27×10-3）2姨
=3.21×10-3。⑦标液（试样）峰面积的重复性测定引入的不确
定度。将标液及试样分别重复进样，进样次数 n=10，并计算
峰面积平均值 A、标准偏差 S、自由度 ν，及其相对标准不确
定度：Urel7= S
A n姨
，属 A类评定，结果见表 1、2。
将以上各不确定度分量综合，可得标液及试样峰面积
的不确定度：
UrelA0=UrelA1= Urel12+Urel22+Urel32+Urel42+Urel52+Urel62+Urel72姨 ，结果
见表 3。
2.3.5 样品前处理过程产生的不确定度 。 以回收率来评
价样品前处理过程产生的不确定度。对试验样品分别进行
了 6 次加标回收试验，计算平均值 Rec、相对标准不确定度
UrelRec，及自由度，同时根据公式 t= 1-R
軍ec
UrelRec
对回收率进行差异
显著性检验，并与 95%置信区间、n-1 自由度的双边临界值
t0比较，得 t0=2.571，而 t≥t0，说明存在显著性差异，回收率应
包含在结果的计算中。此类属 A类评定，ν=5，结果见表 4。
2.3.6 数值修约引入的不确定度。由标准可知[1-2，8]，修约间隔
的区间半宽度为 0.000 05，按均匀分布考虑，其相对标准不
确定度 Urel 修=0.000 05/（ 3姨 ×X）（B 类），ν=∞，公式中的 X
为饮料中的合成着色剂的含量，由试验数据计算得到。X 及
UrelR的值见表 5。
2.4 合成不确定度
上述各不确定度分量之间均为积和商的函数关系 ，
且彼此独立不相关 ，所以相对合成不确定度为 ：Urel 合 成=
UrelC0
2
+U
2
relA0+U
2
relA1+UrelV0
2
+Urelrn1
2
+U
2
relf +UrelR
2姨 ，结果见表 6。
2.5 扩展不确定度
取包含因子 k=2，则相对扩展不确定度 Urel 扩展=k×Urel 合成，
扩展不确定度 U 扩展=Urel 扩展×X，并保留 2 位有效位数，结果
见表 6。
2.6 测量不确定度的报告
经分析，葡萄味碳酸饮料中的苋菜红、亮蓝的含量及其
不确定度分别为：m 苋=0.014±0.000 32 g/kg，k=2；m 亮=0.014±
0.000 51 g/kg，k=2。
（下转第 336 页）
表 1 标液峰面积重复性测定的不确定度
化合物
平均峰面积
mAU·min
标准偏差
mAU·min
相对标准
不确定度
自由度
苋菜红 1 413 2.62 5.86×10-4 9
亮蓝 297 8.20 8.70×10-3 9
表 2 试样峰面积重复性测定的不确定度
化合物
平均峰面积
mAU·min
标准偏差
mAU·min
相对标准
不确定度
自由度
苋菜红 78 0.35 1.42×10-3 9
亮蓝 16 0.56 1.11×10-2 9
表 3 峰面积的不确定度
化合物
标液峰面积的相对
标准不确定度
试样峰面积的相对
标准不确定度
苋菜红 6.66×10-3 6.78×10-3
亮蓝 1.09×10-2 1.29×10-2
表 4 合成着色剂回收率的不确定度及 t值
化合物
平均回
收率∥%
标准
偏差∥%
相对标准
不确定度
t 值
苋菜红 97.8 0.61 2.55×10-3 8.627
亮蓝 95.9 0.74 3.25×10-3 12.615
表 5 饮料中合成着色剂的含量及数值修约的不确定度
化合物 着色剂含量∥g/kg 数值修约的相对标准不确定度
苋菜红 0.014 2.06×10-3
亮蓝 0.014 2.06×10-3
表 6 饮料中 6种合成着色剂的合成不确定度
及扩展不确定度
化合物
相对合成
不确定度
相对扩展
不确定度
扩展不确定
度∥g/kg
苋菜红 1.13×10-2 2.26×10-2 3.2×10-4
亮蓝 1.81×10-2 3.62×10-2 5.1×10-4
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食品科学 现代农业科技 2011年第 12期
（上接第 330页）
3 讨论
比较各不确定度分量在合成不确定度中的比重，并且按
由大到小的顺序排列，结果为峰面积＞标液浓度＞回收率＞数
值修约＞样品定容体积＞样品称重。其中，峰面积测量的不确
定度与操作仪器的性能密切相关，定期维护并校准设备，使液
谱保持在良好的工作状态，可维持检测结果的精确度和准确
度；标准溶液的配制也是一个重要的试验步骤，使用经过认
证的标准物质，精确配制标准溶液，则能增加测试结果的可
信度；与钱国英[9]的不确定度评定结果相比，回收率分量所占
的比重明显较低，这是因为样品的分析是采用的直接进样
法，避免了聚酰胺吸附法中样品在前处理步骤的损失，提高了
提取效率。对较低数值的检测结果进行修约时，末位数字的进
舍就会造成较大差异，因而数值修约是不可忽视的不确定度
分量。样品称重的影响几乎可以忽略不计，这与 Hibbert 等 [6]
的评定结论相同。在含量相近的情况下，亮蓝峰面积的不确
定度比苋菜红高了近 1 倍，这是因为亮蓝在 254 nm 的峰面
积响应值较小，且出峰时间较晚，容易易受到干扰，显然，改
善亮蓝的检测波长是一种有效的色谱条件优化方法。
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（上接第 333页）
收缩，35～40 d 溏心缩小，水分适中，变色完成，45～50 d 全部
成熟。故每浸泡 7～10、12～15、18～21、27～30、45 d 从缸中抽取
3～5 枚蛋检查蛋的熟化程度，以确定出缸日期，如发现异常
及时分析原因，采取补救措施。
2.8 出缸、洗蛋、晾蛋
2.8.1 出缸。皮蛋成熟后应及时出缸，以免形成碱伤蛋并加
速缸的周转利用。出缸时，用塑料筐将其捞出。挑出裂、破
蛋，水臭蛋和蜡黄蛋等。
2.8.2 洗蛋、晾蛋。捞出后挑出裂、破蛋，水臭蛋和蜡黄蛋
等，洗蛋时用 1.5%～1.8%的烧碱溶液或残料上清液洗去蛋
壳上的污物，并做好标识 [4]：出池人、出池日期和蛋品批号，
皮蛋出池清洗后，必须晾干 24 h，使表面的料液基本干燥，
达到晾蛋目的。
3 参考文献
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业科学，1997（3）：36-37.
（上接第 334页）
法》继续把好农产品质量安全风险管理关，实现从田间到餐
桌全过程监控，才能确保农产品消费安全和农业产业安全。
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施的探索与研究[J].农业环境与发展，2010（4）：42-43.
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限用农药、合理使用农药的宣传。倡导科学用药、合理施肥；
引导正确处理生活垃圾、工业“三废”，增强农业环境保护意
识；加大宣传力度，营造安全生产、放心消费、关爱健康的农
产品质量安全工作氛围。
7 建立生态补偿机制
政府根据现代农业发展的需求，制订农业生态补偿政
策，加强对农业环境保护、农业生产标准化、提高农产品质
量与农产品安全等方面的支持，鼓励、引导生产者进行安全
生产、可持续生产。结合地域特色和种养结构，促进各地制
定优良农业生产技术规范，推广普及环境友好型农业生产
技术，实现节本增效[6-7]。对于采用优良农业生产技术规范的
农户给予补贴，鼓励生产者采取环境友好的生产方式实现农
业生产方式和生产结构的转变，从而达到保护生态环境、保
障农产品质量安全的目的。
8 参考文献
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