全 文 ：［收稿日期］ 201210 16(007)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81273726) ;上海市西部开发科技合作项目(11495801300) ;上海市中医药事业三年行动计划首批
重大研究项目(ZYSNXD-CC-ZDYJ017) ;国家中医管理局中医肿瘤重点学科合作项目(LHZLK-1107) ;上海中医药大学杏林
学者项目及龙华医院国家中医临床研究基地“龙医团队、龙医学者”项目(LYTD-04)
［通讯作者］ * 胡兵，博士，副研究员，硕士生导师，从事肿瘤生物学与抗癌中药作用及配伍研究，Tel:021-64385700，E-mail:beearhu@
hotmail． com
藤梨根对 ＲKO结肠癌细胞失巢凋亡的作用
胡兵1，2* ，沈克平1，史秀峰3，邓珊1，2，魏蒙蒙1，2
( 1. 上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科，上海 200032;
2. 上海中医药大学附属龙华医院，中医肿瘤研究所，上海 200032;
3. 上海中医药大学附属龙华医院药剂科，上海 200032)
［摘要］ 目的:观察藤梨根对人结肠癌 ＲKO细胞悬浮生长及失巢凋亡作用。方法:200 ～ 800 mg·L －1藤梨根作用于 ＲKO
细胞，CCK-8(CCK-8)法检测藤梨根对 ＲKO细胞悬浮生长作用，双嵌入剂乙锭均二聚物(EthD-1)染色检测失巢凋亡，比色法检
测半胱天冬酶-3(caspase-3)活性，2-7-二氯氢化荧光素乙二脂染色法结合荧光酶标仪检测细胞内活性氧的产生。结果:200 ～
800 mg·L －1藤梨根可显著抑制 ＲKO悬浮生长，呈剂量依赖性(P ＜ 0. 01)。200 ～ 800 mg·L －1藤梨根作用后悬浮生长 ＲKO细胞
吸收 EthD-1 散发红色荧光，部分细胞可见核碎裂，呈现凋亡形态改变;藤梨根组 EthD-1 荧光吸光度与对照组比较差异显著
(P ＜ 0. 01)。终质量浓度 200 ～ 800 mg·L －1藤梨根可显著增强 ＲKO细胞 caspase-3 活性以及细胞内活性氧的产生(P ＜ 0. 01)。
结论:藤梨根可抑制 ＲKO细胞悬浮生长，促使 ＲKO 细胞发生失巢凋亡，可能与活化 caspase-3 以及升高细胞内活性氧水平
相关。
［关键词］ 结肠癌;藤梨根;失巢凋亡;半胱天冬酶-3;活性氧
［中图分类号］ Ｒ285． 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)16-0242-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013160242
Ｒoot of Actinidia chinensis Planch Induces Anoikis
in Colon Carcinoma ＲKO Cells
HU Bing1，2* ，SHEN Ke-ping1，SHI Xiu-feng3，DENG Shan1，2，WEI Meng-meng1，2
(1. Department of Oncology，Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional
Chinese Medicine (TCM) ，Shanghai 200032，China;
2. Institute of TCM in Oncology，Longhua Hospital，
Shanghai University of TCM，Shanghai 200032，China;
3. Department of Pharmacy，Longhua Hospital，Shanghai University of TCM，Shanghai 200032，China)
［Abstract］ Objective:To observe the effects of Tengligen (root of Actinidia chinensis Planch)on cell
growth in suspension and anoikis in human colon carcinoma ＲKO cells． Method:ＲKO cells were treated with
Tengligen (200-800 mg·L －1)or same volume of ＲPMI1640. Cell growth in suspension was detected with CCK-8
assay． Anoikis was visualized by EthD-1 staining． Caspase-3 activities were detected by colorimetric assay．
Intracellular reactive oxygen species (ＲOS) production was observed by 2，7-dichlorofluorescin diacetate
staining． Ｒesult:200-800 mg·L －1 of Tengligen，significantly inhibited ＲKO cell growth in suspension in a dose
dependent manner (P ＜ 0. 01)． After 200-800 mg·L －1 of treatment，EthD-1 was absorbed by suspension-cultured
ＲKO cells to yield a red-fluorescent nuclear staining，and nuclear fragmentation was observed in partial cells． The
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 16
Aug．，2013
EthD-1 fluorescence in 200-800 mg·L －1 of Tengligen treated ＲKO cells were compared with controls (P ＜ 0. 01)．
200-800 mg·L －1 of Tengligen also activated caspase-3 and upregulated intracellular ＲOS generation (P ＜ 0. 01)．
Conclusion:Tengligen could inhibit ＲKO cell growth in suspension，induce anoikis in ＲKO cells，and may
associate with caspase-3 activation and ＲOS production．
［Key words］ colon carcinoma cell;root of Actinidia chinensis;anoikis;caspases-3;reactive oxygen
species
抗癌中药的使用已成为中医肿瘤临床重要的治
疗手段，研究抗癌中药的作用特性具有重要意
义［1］。藤梨根是中医肿瘤临床常用中药，其主要成
分包括多糖、熊果酸、齐墩果酸等，藤梨根具有抗氧
化、抗癌以及抗血管生成等药理作用［2-3］;已证实藤
梨根在大肠癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤中具有抗癌作
用［4-7］，但藤梨根对悬浮肿瘤细胞的作用缺乏研究。
本研究在大肠癌细胞模型中观察了藤梨根对悬浮生
长大肠癌细胞的作用，以期为临床用药及进一步研
究提供基础。
1 材料
1. 1 药材 藤梨根由龙华医院中药房提供，批号
2012040506，产地 江苏，上海华浦中药饮片有限公
司;藤梨根由龙华医院药剂科许丽雯副主任药师鉴
定，为猕猴桃科植物中华猕猴桃 Actinidia chinensis
Planch的干燥根。
1. 2 细胞株与试剂 人结肠癌细胞株 ＲKO(购自
中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库) ，
CytoSelectTM 24-Well Anoikis Assay (批号 11665，美
国 Cell Biolabs 公司) ，Cell Counting Kit-8 (CCK-8，
批号 DL765，［东仁化学科技(上海)有限公司］，
poly-HEMA(批号 SLBB4988V，美国 Sigma Aldrich公
司) ;Caspase-3 活性检测试剂盒(批号 313323，美国
Promega 公 司) ，活 性 氧 检 测 试 剂 盒 (批 号
0402261212，江苏碧云天生物技术研究所)。
1. 3 仪器 NAPCO-5410 型二氧化碳培养箱(美国
Napco 公司) ，Thermo Varioskan 型酶标仪(美国
Thermo公司) ，Olympus 1 × 70 型倒置显微镜(日本
Olympus公司)。
2 方法
2. 1 中药制备 参考文献方法制备中药［8］，藤梨
根 300 g 加 8 倍量水，浸泡 1 h，煎煮 2 次，每次 30
min，纱布粗滤去渣，合并滤液、浓缩，18 000 r·min －1
离心 30 min，取上清加入等体积乙醇，4 ℃过夜;
18 000 r·min －1离心 30 min，取上清液冰冻干燥，称
重，无血清 ＲPMI 1640 溶解，调浓度至 400 g·L －1，依
次 0. 45，0. 22 μm滤器过滤除菌，1 mL 分装，4 ℃保
存备用。
2. 2 细胞悬浮生长检测 1 × 104 个对数生长期
ＲKO细胞接种于 poly-HEMA 包被 96 孔板，根据预
实验结果接种后第 2 天加入终质量浓度 200 ～ 800
mg·L －1藤梨根或等体积 ＲPMI 1640，每组 3 个复孔;
药物作用 24 h后加入 10 μL CCK-8，37 ℃反应 2 h，
酶标仪 450 nm波长检测各孔吸光度(A) ，计算细胞
存活率。
细胞存活率 = A实验组 /A对照组 × 100%
2. 3 失巢凋亡检测 1 × 105 个对数生长期 ＲKO细
胞接种于 poly-HEMA 包被 24 孔板，接种后第 2 天
加入不同质量浓度中药或等体积 ＲPMI 1640，每组 3
个复孔;药物作用 24 h后加入 1 μL EthD-1，37 ℃反
应 1 h，荧光酶标仪检测 A(激发波长 525 nm，发射波
长 590 nm) ，荧光显微镜下观察细胞形态。
2. 4 caspase-3 活性检测 1 × 106个对数生长期
ＲKO细胞接种于 poly-HEMA 包被直径 6 cm 培养
皿，接种后第 2 天加入不同质量浓度中药或等体积
ＲPMI 1640，每组 3 个样本;药物作用 24 h 后收集细
胞，按操作说明书采用酶底物法检测 caspase-3
活性。
2. 5 活性氧检测 5 × 105 对数生长期 ＲKO细胞接
种细胞于 poly-HEMA包被 6 孔板，接种后第 2 天加
入不同浓度中药或等体积 ＲPMI 1640，空白组不作
处理，每组 3 个样本;药物作用 24 h 后收获细胞，加
入含 DCFH-DA 探针(10 μmol·L －1)的无血清
ＲPMI1640，37 ℃孵育 20 min 后，酶标仪测各孔 A
(激发波长 488 nm，发射波长 525 nm)。
2. 6 统计学分析 采用 SPSS 16. 0 统计软件进行
统计分析，计量资料以 珋x ± s 表示，组间比较采用单
向方差分析，组间两两比较用 LSD 法，以 P ＜ 0. 05
为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 对 ＲKO 细胞悬浮生长影响 200 ～ 800 mg·
L －1藤梨根可显著抑制 ＲKO 细胞悬浮生长，与对照
组比较差异显著(P ＜ 0. 01)。见图 1。
3. 2 对 ＲKO失巢凋亡作用的影响 200 ～ 800 mg·
·342·
胡兵，等:藤梨根对 ＲKO结肠癌细胞失巢凋亡的作用
a． 对照组;b． 藤梨根 200 mg·L －1组;
c． 藤梨根 400 mg·L －1组;d． 藤梨根 800 mg·L －1组;
与对照组比较1)P ＜ 0. 01(图 2 ～ 4 同)
图 1 藤梨根对 ＲKO细胞悬浮生长影响(珋x ± s，n = 3)
L －1藤梨根作用后 ＲKO 细胞可吸收 EthD-1 呈现红
色荧光，部分细胞可见核碎裂，藤梨根不同剂量组荧
光吸光度(A)与对照组比较差异显著(P ＜ 0. 01) ，
提示藤梨根可促 ＲKO细胞失巢凋亡。见图 2。
A． 荧光显微镜下细胞形态(EthD-1 染色，× 200) ;
B． EthD-1 吸光度(A)
图 2 不同剂量藤梨根对 ＲKO细胞失巢凋亡影响(珋x ± s，n = 3)
3. 3 对 ＲKO 细胞 caspase-3 活性影响 200 ～ 800
mg·L －1藤梨根可以显著增强悬浮生长 ＲKO 细胞
caspase-3 活性(P ＜ 0. 01)。见图 3。
3. 4 对 ＲKO 细胞内活性氧水平影响 200 ～ 800
mg·L －1藤梨根可以显著升高悬浮生长 ＲKO 细胞内
ＲOS水平，藤梨根不同剂量组荧光 A 与对照组比较
差异显著(P ＜ 0. 01)。见图 4。
4 讨论
上皮细胞需要胞外基质上提供存活信号，脱离
胞外基质黏附细胞将发生凋亡，即失巢凋亡
图 3 藤梨根对 ＲKO细胞 caspase-3 活性影响(珋x ± s，n = 3)
图 4 藤梨根对 ＲKO细胞 ＲOS生成影响(珋x ± s，n = 3)
(anoikis) ，anoikis 是 1 个希腊词汇，原意无家可归
(homelessness) ;失巢凋亡现象由 Frish 等于 1994 年
首次发现。上皮来源肿瘤细胞在血液或淋巴循环中
的存活与失巢凋亡耐受相关。肿瘤细胞由于基因表
达或活性异常而获得一定程度的失巢凋亡耐受，使
得部分肿瘤细胞可以在血液或淋巴循环中存活，最
终导致肿瘤转移，失巢凋亡已成为肿瘤治疗新的
靶标［9-10］。
poly-HEMA 是一种无毒阴离子聚合物，具有均
匀的非离子特性，铺在培养皿底部，可阻止细胞贴
壁，使细胞只能悬浮生长，本研究结果显示藤梨根可
以抑制结肠癌细胞在 poly-HEMA 包被板中的生长，
提示藤梨根对悬浮生长结肠癌细胞具有抗癌作用。
EthD-1(Ethidium homodimer)是一种核酸荧光染料，
EthD-1 可以进入破损细胞结合核酸，呈现红色荧光
信号，但不能渗透活细胞，因此常用作死亡细胞的荧
光染色指示剂;CytoSelectTM24-Well Anoikis Assay 试
剂盒以 EthD-1 为标记，结合细胞在 poly-HEMA包被
板悬浮生长检测细胞失巢凋亡。本研究 EthD-1 染
色显示藤梨根作用后部分 ＲKO细胞吸收 EthD-1 呈
现红色荧光，部分细胞还可见核碎裂，提示藤梨根可
以促使 ＲKO细胞失巢凋亡。
失巢凋亡是一种特殊形式的凋亡，失巢凋亡也
是由 caspase级联反应介导的。上皮细胞与胞外基
质黏附后经整合素介导，形成 Focal adhesion plaque，
促使黏着斑激酶(FAK)构象变化而活化。FAK 下
游信号转导与 MAPK，PI3K-AKT 等信号通路有关。
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Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 16
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细胞脱离基质黏附后 FAK 到 MAPK 信号转导受到
抑 制，致 使 细 胞 凋 亡 分 子 调 控 失 常，活 化
caspases［10-11］。与细胞凋亡一样，失巢凋亡也可以通
过内源或外源通路，分别活化 caspase-9 或 caspase-8，
进而激活细胞凋亡执行蛋白酶 caspase-3，引发失巢
凋亡。本研究发现藤梨根可以活化悬浮状态 ＲKO
细胞 caspase-3，提示藤梨根对 ＲKO细胞失巢凋亡作
用与 caspase-3 活性相关。
ＲOS是细胞在有氧代谢过程中产生一系列活
性氧簇，细胞内 ＲOS水平变化可以引起肿瘤细胞一
系列与细胞增殖、凋亡相关信号通路的变化，提高细
胞内 ＲOS 水平可活化细胞内 caspases 活性，诱导肿
瘤细胞凋亡［12］。ＲOS 是中药活化 caspase 信号通
路，介导抗癌作用的重要机制，已发现大黄素、姜黄
素等中药组分可以通过提高细胞内 ＲOS 水平促使
肿瘤细胞失巢凋亡［13-14］。本研究发现藤梨根作用
后 ＲKO细胞内 ＲOS 水平显著升高，提示藤梨根对
ＲKO细胞失巢凋亡作用可能还与 ＲOS相关。
综上所述，本研究结果显示藤梨根可以抑制
ＲKO细胞悬浮生长，促 ＲKO 失巢凋亡，同时活化
ＲKO细胞 capase-3，提升 ＲKO 细胞内 ＲOS 水平;本
研究提示藤梨根对悬浮生长状态结肠癌细胞作用敏
感，值得进一步研究。
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［责任编辑 李玉洁］
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胡兵，等:藤梨根对 ＲKO结肠癌细胞失巢凋亡的作用