全 文 ：藤茶中杨梅素和二氢杨梅素的分离
及抗心肌细胞凋亡作用
姜仕先 , 董乃维 , 张　婧 , 甘春丽 , 刘凤芝＊
(哈尔滨医科大学 药学院药物化学与天然药物化学教研室 , 黑龙江 哈尔滨 150081)
[ 摘要] 　目的　利用聚酰胺法从藤茶中分离得到杨梅素(MYR)和二氢杨梅素(DMY),研究其对心肌细胞的保护作
用。方法　通过水提法得到总黄酮 , 上聚酰胺柱 , 以醇水梯度洗脱分离 , 收集 30%～ 50%醇馏分得 DMY的单体 ,
60%～ 70%醇馏分中收集到 MYR单体。用流式细胞仪(FCM)检测两种化合物对心肌细胞凋亡的影响。结果　FCM
检测结果显示 ,MYR和 DMY对 H2O2 诱导的心肌细胞凋亡有明显抑制作用。结论　聚酰胺法能够分离得到MYR
和 DMY 单体;MYR及 DMY有抑制心肌细胞凋亡作用。
[ 关键词] 　杨梅素;二氢杨梅素;心肌细胞;凋亡;聚酰胺法
[ 中图分类号] R284.2　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1000-1905(2008)01-0004-03
Separation of myricetin and dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata
and their inhibition of cadiomyocyte apoptosis
JIANG Shi-xian ,DONG Nai-wei ,ZHANG Jing , et al
(Department of Pharmacochemistry and Naturally Occurring Drugs , College of Pharmacy ,
Harbin Medical University , Harbin 150081 , China)
Abstract:Objective　To obtain myricetin(MYR)and dihydromyricetin(DMY)by column chromatograph of
polyamide , and to study their protective effects on cardiomyocytes.Methods　The total flavonoids from Ampe-
lopsis grossedentata were extracted with water , and separated by column chromatograph of polyamide with alco-
hol and water.DMY was obtained from 30%～ 50% alcohol distillate , and MYR was obtained from 60%～
70%.The inf luence of MYR and DMY on cardiomyocyte apoptosis was detected by flow cytometry .Results　
MYR and DMY obviously inhibited cardiomyocyte apoptosis induced by H2O2.Conclusion　MYR and DMY
can be obtained by column chromatograph of polyamide from the Ampelopsis grossedentata , and inhibit the car-
diomyocyte apoptosis.
Key words:myricetin;dihydromyricetin;cardiomyocyte;apoptosis;polyamide column
[收稿日期] 2007-03-01
[基金项目] 国家自然科学基金(30371684);黑龙江省自然科学基金
(D0301);哈尔滨医科大学医学基础学科创新群体基金
[作者简介] 姜仕先(1971-), 男 ,黑龙江哈尔滨人 ,副主任医师 ,硕
士。 ＊通讯作者
　　藤茶属葡萄科植物蛇葡萄属中的一种野生藤本
植物的嫩茎叶 ,又名显齿蛇葡萄 ,田婆茶 ,红五爪金
龙 ,大齿蛇葡萄 ,甜茶藤 ,霉茶 。长久以来 ,我国壮族
和瑶族将其嫩茎叶制成保健茶 ,用于治疗感冒发热 、
咽喉肿痛 ,黄疸型肝炎 、疮疖等症。其化学成分主要
为黄酮类 、低聚芪类 、酚类[ 1] ,其中黄酮类中的二氢
杨梅素及杨梅素含量丰富并有很强的药理作用 。特
别是二氢杨梅素在幼叶茎中含量占干重的 20%以
上 ,在幼叶中的心叶可达 40%[ 2] 。据报道 ,藤茶具
有抗肿瘤作用 、抗氧自由基及护肝作用 、调血脂及降
血糖作用 、抗炎镇痛 、抑菌 、祛痰止咳作用[ 3] 。
杨梅素(3 , 5 , 7 ,3′,4′, 5′-六羟基黄酮醇 ,myrice-
tin ,MYR)异名杨梅树皮素 、杨梅黄酮 、杨梅酮 ,属黄
酮醇类化合物 ,存在于壳豆科 、豆科 、报春花科 、葡萄
科 、菊科等植物中 ,结构式见图 1。该化合物由何桂
霞等[ 4] 于 1999年从藤茶的茎中分离得到。
二氢杨梅素(3 ,5 ,7 ,3′, 4′,5′六羟基-2 , 3双氢黄
酮醇 ,dihydromyricetin , DMY)又称蛇葡萄素 、双氢杨
4
第 42卷　第 1期
2008年 2月 　　　　　　　　
哈尔滨医科大学学报
JOURNAL OF HARBIN MEDICAL UNIVERSITY
　　　　　　　　　　　　Vol.42 ,No.1
Feb., 2008
梅素 、福建茶素 ,属黄酮醇类化合物[ 5] ,结构式见图
1。该化合物曾由 Kotake和Kubota于 1940年从蛇葡
萄属植物福建茶(即楝叶玉葡萄 ,Ampelopsis)的叶中
分离得到并命名为蛇葡萄素[ 6-7] , 周天达等[ 8] 于
1996年从藤茶的茎叶中分离得到二氢杨梅素 。
图 1　杨梅素和二氢杨梅素结构式
　　鉴于MYR和 DMY结构相似 ,用一般方法分离
较困难 ,根据 2 ,3位饱和情况 ,本实验拟采用 200 ～
400目聚酰胺柱层析 ,以乙醇-水梯度洗脱 ,从藤茶提
取的总黄酮中分离得到单一组分 ,并从细胞水平检
测MYR和 DMY对心肌细胞的保护作用。
1　材料与方法
1.1　材料
藤茶干燥嫩茎叶(湖南恩施州凤鸣藤茶有限责
任公司)、新生Wistar大鼠乳鼠(哈尔滨医科大学第
二临床医学院动物中心)。
胰蛋白酶(Sigma公司)、优级胎牛血清(中国医
学科学院生物工程研究所灏洋生物公司)、Annexin
V PI细胞凋亡试剂盒(北京宝赛生物技术有限公
司)、柱层析聚酰胺(200 ～ 400目)(浙江台州路桥四
甲生化仪器厂)、乙醇(分析纯)(哈尔滨新达化工
厂)、丙酮(分析纯)(沈阳化学试剂厂)。
UV-2550型紫外分光光度计(日本岛津公司)、
SHB-Ⅲ循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公
司)、RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、
X-4型显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)、
FACS CALibur流式细胞仪(Becton-Dikinson公司)。
1.2　实验方法
1.2.1　样品制备
1.2.1.1　提取:称取藤茶 100g ,加 10倍水 ,煮1h ,滤
去残渣 ,再加 5倍水煮 30min ,弃去残渣。液体放置
24h ,滤出沉淀 ,用乙醇溶解 ,过滤 ,滤液上旋转蒸发
仪浓缩 ,得到总黄酮结晶 24.4g ,用于分离 。
1.2.1.2　分离方法:①装柱:取 200 ～ 400目的聚酰
胺用蒸馏水以湿法装柱 ,柱为 70cm×5cm;②取总黄
酮结晶5g ,用 95%乙醇溶解 ,以聚酰胺拌样 ,挥干乙
醇 ,装柱 , 柱高 15cm;③分别以 10%、30%、50%、
60%、70%乙醇洗脱 ,每次洗脱液量为 2 000mL ,每
200mL 收集一瓶 ,依次标号;④收集的洗脱液用旋转
蒸发仪浓缩;⑤合并相同物质。流程图见图2。
1.2.2　样品检测
1.2.2.1　化学测定:结晶 Ⅰ为白色细针状结晶 。分
别进行盐酸-镁粉反应 、FeCl3 乙醇液反应 、AlCl3 反
应 、α-萘酚反应和 NaOH 反应。结晶 Ⅱ为黄色针状
或颗粒状结晶 ,亦进行上述鉴别反应 。
1.2.2.2　薄层色谱法:取结晶 I和结晶 II ,用少量乙
醇溶解后 ,点于聚酰胺薄膜上 ,以丙酮-水(5∶1)上行
展开 ,置紫外灯下观察 。
1.2.2.3　紫外检测:将结晶Ⅰ和结晶 Ⅱ分别溶于甲
醇 ,置紫外光谱仪检测 ,在 200 ～ 400nm处紫外扫描 。
1.2.2.4　熔点测定:将干燥结晶Ⅰ和结晶 Ⅱ分别置
于显微熔点测定仪下测定。
1.2.3　细胞实验
1.2.3.1　心肌细胞培养:采用出生 48h以内的Wistar
乳鼠的心肌组织 ,无菌条件下剪碎 ,加入 0.25%胰蛋
白酶溶液于 37℃水浴振荡分次消化 ,每次 15min ,弃
去第1次上清液 ,收集以后几次上清液 ,加入等量冷
的含 10%胎牛血清的 RPMI1640培养液终止消化 ,
1 000r min离心 5min ,弃上清液 ,再用培养液悬浮分
散沉淀细胞 ,制成单细胞悬液 ,接种到 100mL 培养
瓶中 ,放入5%CO2 ,37℃孵育 2h ,差速贴壁 ,之后收
集细胞悬液并计数 ,接种于 6孔板中 ,接种量为 1×
10
6(每孔 1mL)继续在 CO2 培养箱中培养 , 24h后换
液 ,48h后进行实验 。
1.2.3.2　实验分组及药物处理:实验用黄酮化合
物用 DMSO溶解后 , 过滤除菌 。①正常组:培养心
肌细胞 48h 后加生理盐水;②对照组:细胞培养
48h后 , 加入终浓度 100μmol L 的 H2O2 , 诱导心肌
细胞凋亡;③样品组:细胞培养 48h后 , 分别往 6
孔板中加入终浓度 30μmol L 的MYR和 DMY , 孵育
1h , 加入终浓度 100μmol L 的 H2O2 , 孵育 16h , 诱
导心肌细胞凋亡。
1.2.3.3　流式细胞仪检测:0.125%胰酶消化 ,4℃
PBS洗 3次 ,Binding Buffer重悬细胞 ,过 200目筛 ,调
整细胞浓度为 1×106 个 mL。检测前 30min 加入
FITC-Annexin V ,低温避光孵育 ,检测前 5min加入碘
化丙啶(PI)。将对照管(裸细胞)荧光强度设为非特
异本底荧光 ,单染 FITC-Annexin V和单染 PI作为补
偿设置管。用流式细胞仪检测细胞凋亡率 。
5第 1期　　　　　　　　　　姜仕先 ,等.藤茶中杨梅素和二氢杨梅素的分离及抗心肌细胞凋亡作用
图 2　MYR和DMY提取纯化流程图
2　结果
　　结晶 Ⅰ为白色细针状结晶 。盐酸-镁粉反应呈
玫瑰红色 ,与 FeCl3 乙醇液反应呈紫黑色 ,与 AlCl3
反应呈黄色荧光 ,α-萘酚反应呈阴性 ,与 NaOH 反应
呈橙黄色 ※绿色 。熔点 245 ～ 246℃, UV(MeOH):
291.4nm ,以上数据 ,与已知文献[ 9]报道的二氢杨梅
素熔点和光谱数据一致 ,可初步推断其为二氢杨梅
素。
结晶Ⅱ为黄色针状或颗粒状结晶 ,盐酸-镁粉反
应呈玫瑰红色 , 与 FeCl3 乙醇液反应呈墨绿色 , 与
AlCl3 反应呈强黄绿色荧光 ,α-萘酚反应呈阴性 ,与
NaOH 反 应呈 黑 绿色 。熔 点 324 ～ 326℃, UV
(MeOH):375.0nm , 255.0nm。以上数据与文献[ 10]
记载的杨梅素各项数据一致 ,可初步推断为杨梅素 。
由薄层色谱检测 ,结晶 Ⅰ为单一斑点 ,结晶 II
为单一斑点 ,分别与二氢杨梅素和杨梅素标准品斑
点相一致[ 11] 。
由流式细胞仪检测结果(图 3 ,附表)可知 ,在正
常组中第 3象限(左下区)活细胞大量存在 ,第 4象
限(右下区)凋亡细胞较少 , 细胞的凋亡率为
11.81%。对照组中第 3象限活细胞大量减少 ,而第
4象限凋亡细胞增多 ,细胞的凋亡率为 40.65%。同
心肌细胞凋亡与氧化应激有关的理论相吻合;与对
照组相比 ,MYR和 DMY样品组中第 3 象限活细胞
的几率增加 ,而第 4象限凋亡细胞明显减少 ,细胞的
凋亡率分别为 17.17%和 19.83%。证明 MYR和
DMY对 H2O 2诱导的心肌细胞凋亡 ,均有明显的抑
制作用 。
图 3　流式细胞仪检测细胞凋亡率
第 2象限表示坏死细胞几率 , 第 3象限表示正常细胞几率 , 第 4
象限表示凋亡细胞几率
附表　流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率
分组 凋亡率(%)
正常组 11.81
对照组 40.65
杨梅素 17.17
二氢杨梅素 19.83
3　讨论
　　藤茶中二氢杨梅素含量较高 ,但杨梅素含量较
少 ,约 1%～ 2%。二氢杨梅素和杨梅素在化学结构
上近似 ,仅在 2 ,3位上差 1个双键 ,极性相同 ,造成
了分离纯化的困难 ,至今没有好的分离方法 。本研
究根据二氢杨梅素和杨梅素与聚酰胺之间氢键缔合
能力的差异 ,采用 200 ～ 400目聚酰胺柱分离 DMY
和MYR ,在 24.4g总黄酮中能够得到 18.3g 的 DMY
和 1.5g的 MYR ,达到较好的分离纯化效果 。
关于 MYR和 DMY的药理作用 ,多数文献报道
有抗氧化作用 ,其机制尚未完全阐明 ,而且未见关于
(下转10页)
6 哈尔滨医科大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 42卷　　
NF-κB表达的机制及意义的认识将有助于认清脑出
血的发展程度与治疗方法的制定。
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(上接 6页)
对心肌细胞凋亡的抑制作用的报道 。本实验采用流
式细胞仪测定 DMY和 MYR 对心肌细胞凋亡的影
响。检测结果表明 ,MYR和 DMY对 H2O2 诱导心肌
细胞凋亡有抑制作用 ,但是MYR和 DMY相比 ,抗心
肌细胞凋亡的作用比较未见显著差异 ,证明黄酮醇
和二氢黄酮醇对心肌细胞凋亡都有抑制作用 。
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