全 文 ：收稿日期:2009-12-03;　修订日期:2010-06-30
基金项目:宁夏回族自治区卫生厅科研项目(No.2008028);
宁夏银川市科技攻关项目 [ No.银财发 2009(308)-46]
作者简介:张立明(1971-),男(汉族),宁夏银川人 ,现任宁夏医科大学副
教授 ,硕士学位 ,主要从事天然药物的研究工作.
三叶青黄酮诱导 SMMC-7721肝癌细胞凋亡的实验研究
张立明 1 ,樊瑞军2 ,杨凤琴 1
(1.宁夏医科大学药学院 ,宁夏 银川　750004;　2.宁夏自治区人民医院 ,宁夏 银川　750021)
摘要:目的 观察三叶青黄酮对 SMMC-7721肝癌细胞诱导凋亡的作用。方法 通过四氮噻唑蓝(MTT)比色法检测三叶
青黄酮对细胞的抑制增殖作用;光学显微镜 、荧光显微镜下形态学观察;DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪(FCM)研究
分析三叶青黄酮对肝癌细胞的诱导凋亡作用。结果 三叶青黄酮能显著的抑制 SMMC-7721肝癌细胞的生长 , 并具有浓
度依赖性。光学显微镜 、荧光显微镜下观察 ,发现细胞凋亡现象;DNA琼脂糖凝胶电泳可见 DNA梯形条带;流式细胞仪
(FCM)检测分析出现凋亡亚二倍体峰 。结论 三叶青黄酮对肝癌细胞具有诱导凋亡作用 , 有抗肝癌的药用价值。
关键词:三叶青黄酮;　肝癌细胞;　凋亡
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.061
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)11-2850-01
　　三叶青具有清热解毒 、祛风化痰 、活血止痛等功效 [ 1] , 用于
治疗高热惊厥 、肺炎 、哮喘 、肝炎 、风湿 、月经不调及恶性肿瘤 ,具
有很好的疗效。大量的研究表明该中药具有免疫调节作用 , 其
不仅直接作用于细胞免疫 ,而且通过整体作用来控制细胞免疫与
细胞因子的活动。近几年 , 三叶青黄酮抗肿瘤作用日益受到重
视。为进一步探讨三叶青抗肿瘤作用的机制 ,更好地开发利用三
叶青 , 本实验通过(MTT)比色法 、光学显微镜下形态学观察 、荧
光显微镜观察 、DNA琼脂糖凝胶电泳 、流式细胞仪(FCM)测定法
研究三叶青黄酮对 SMMC-7721肝癌细胞诱导凋亡进行研究。
1　仪器与材料
1.1　仪器 酶联免疫检测仪 , 国营华东电子管厂研制 , 型号 , DG
-3022;流式细胞仪(FCM), 美国 B＆D公司产品 , 型号 , FACS.
calibur;电泳仪 , 北京六一仪器厂产品 ,型号 DYY-Ⅲ 1;紫外透射
分析仪 , 上海长兴机器厂产品 , 型号:2F-3。
1.2　药物与试剂 三叶青 , 宁夏明德饮片厂提供 , 宁夏药品检验
所鉴定。 青霉素 , 宁夏启元药业生产 , 规格 , 160万单位 , 批号
080912;链霉素 , 安徽淮南国瑞药业产品 , 规格 , 0.75 g, 批号
20090308;RPMI1640,美国 Sigma公司产品;四氮噻唑蓝(MTT),
美国 Sigma公司产品。
1.3　细胞株及培养 肝癌细胞株 SMMC-7721由第四军医大学
口腔医学院引进。接种于 100 L玻璃培养瓶中 , 在含 10%小牛血
清 、青霉素 100 mg· L-1、链霉素 100 mg· L-1的 RPMI1640培养
基中 , 37℃、pH7.2置 5%CO2培养箱中培养 48 h, 经 0.25%的胰
酶消化后 , 制成 2×105· ml-1细胞悬液。
1.4　三叶青黄酮的提取 、分离和制备 称取三叶青块根 1 000g,
采用碱性稀醇提取法 [ 2]提取得三叶青黄酮 7.2 g。聚酰胺柱层
析 [ 2]后 , 分别用 10% , 30% , 50% , 70% , 95%的乙醇洗脱 ,回收
得浓缩物 , 真空干燥至恒重 , 分别标记为 HT10, HT30, HT50,
HT70和 HT95。分别称取 HT10, HT30, HT50, HT70和 HT95各 2
mg,溶解于 200 μl二甲基亚砜中 , 旋涡振荡 , 全部溶解后 , 加入
800μlRPMI1640培养液旋涡震荡混匀后放置于 4 ℃冰箱保存
备用 , 终浓度为 10 mg· ml-1。用时按比例配制成 2, 4, 6, 8, 10
mg· ml-1的浓度液。
2　方法
2.1　实验分组 实验组分加药组和对照组 , 加药组分别加入
HT10, HT30, HT50, HT70和 HT95。各自加入 100 μl2, 4, 6, 8, 10
mg· ml-1的药液 ,每计量组 6个复空 ,对照组加等量的培养基 ,
混匀后放入 5%CO2培养箱中培养 。
2.2　四氮噻唑蓝(MTT)比色法 取对数生长期 SMMC-7721细
胞 , 接种于 96孔板 ,每孔加入 100μl细胞悬液 ,培养 24 h, 待细胞
贴壁后 , 进行换液和药物处理 [ 3] , 弃上清液 , 加入 100 μlHT10,
HT30, HT50, HT70和 HT95各浓度的药液 100 μl。对照组加 100
μl的培养液 , 混匀。 37℃、pH7.2置 5%CO2培养箱中培养。 培
养 48 h后 , 弃上清液 ,在各孔中加入 5 g· L-1MTT30 μl, 继续培
养 4h,弃上清液 , 每孔加二甲亚砜 100μl, 振摇 5 min, 用酶联免疫
检测仪测定 570 nm处吸光度 , 计算出细胞抑制率。
2.3　光学显微镜下形态学观察 取实验组细胞 , 用 PBS(pH7.2)
洗涤 1次 , 做离心涂片 ,用甲醇固定 3 ～ 5 min, 滴加 Wright染色 2
min,入 Wright磷酸缓冲稀释液 4 ～ 10 min, 用蒸馏水冲洗 [ 3] , 在
油镜下观察细胞形态。
2.4　荧光显微镜观察 取实验组细胞 , 吹打均匀 , 取 30 μl悬液
加到载玻片上 ,加 10 μl吖啶橙染色 ,加盖玻片后置荧光显微镜
下观察 SMMC-7721细胞形态并照相 , 在显微镜下数 400个细
胞 , 计算细胞凋亡率 [ 3] 。
2.5　DNA琼脂糖凝胶电泳 收集药物作用组及对照组培养细
胞 , 常规方法提取细胞 DNA, 1.5%琼脂糖凝胶孔中电泳 , 在室
温 、 50 V、恒流 60 mA电泳 2h,紫外灯下观察并照相 [ 3] 。
2.6　流式细胞仪(FCM)分析 将经药物处理的细胞 , 1 000 r·
min-1离心 5 min,弃上清液 , PBS洗涤 2次 , 1 000r· min-1离心 5
min,弃上清液 , 加冷的 70%(体积分数)乙醇 4℃固定 24h,离心 ,
弃乙醇 , PBS洗 1次 , 1 000 r· min-1离心 5 min, 弃上清液 , 滴加
0.5 ml100 mg· L-1RNase, 放置 4 h, 离心 , 弃上清液 , PBS洗 1
次 , 300目筛网过滤 1次 , 1 000 r· min-1离心 5 min, 弃上清液 ,
加 0.5 mlPI过夜 [ 3] 。上流式细胞仪测定。
2.7　统计学处理 采用 SPSS11.0软件 ,不同药物浓度组间的比
较采用完全随机设计的方差分析 ,各药物浓度组与对照组的比较
采用 Dunnett检验 ,以 α=0.05为检验水准。
3　结果
3.1　三叶青黄酮对 SMMC-7721肝癌细胞增殖的抑制作用 结
果见图 1。
从图 1可以看出 , 不同浓度乙醇层析分离的三叶青黄酮
(HT10、HT30、HT50、HT70和 HT95)均能抑制 SMMC-7721 细
胞的增殖;随着药物浓度的增加 , 其生长抑制作用增强 ,呈浓度 -
效应关系。其中 HT50作用最强 , 随着加入药物浓度的增加 , 其
对 SMMC-7721 细胞生长抑制率分别为 38.6%, 47.2%,
65.1%, 70.1 %和 71.6%。
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11
图 1　三叶青黄酮对 SMMC-7721肝癌细胞增殖抑制作用
3.2　光学显微镜下形态学变化 取对照组细胞及实验组细胞 ,光
学显微镜下观察 , 可见实验组细胞染色质浓集 , 细胞核固缩 、碎
裂 , 细胞膜起泡 ,有核碎片的凋亡小体形成。
3.3　荧光显微镜下形态学变化 取对照组及实验组细胞 , 荧光显
微镜下可见对照组细胞为黄色或桔红色 ,给药组细胞核或细胞质
内可见致密浓集的黄绿色染色 ,可见黄绿色碎片 , 细胞核固缩 、核
碎裂 、细胞膜起泡及凋亡小体形成 , 检测其凋亡率 , 其中 HT50组
不同浓度的凋亡率分别为 29.5%, 36.3%, 52.5% , 62.8%和
70%;随着浓度的不断增加 ,细胞凋亡率呈上升趋势。
3.4　DNA琼脂糖凝胶电泳结果 取对照组及 HT50组的 8, 10mg
· ml-1两个浓度的细胞 , 经琼脂糖凝胶电泳后 ,给药组均出现凋
亡特有 DNALad-der带 , 而对照组则无此带。
3.5　流式细胞仪(FCM)测定结果 取对照组及 HT50组的 8, 10
mg· ml-1两个浓度的细胞 ,流式细胞仪(FCM)测定 , 对照组未出
现亚 2倍体峰 , 给药组均可见明显的亚 2倍体峰。
4　讨论
三叶青具有多方面的生物活性 ,其中抗肿瘤作用日渐被人们
重视。本研究通过定量和定性的细胞凋亡研究方法 ,对 5种不同
浓度的乙醇分离的三叶青黄酮作用后的细胞进行凋亡研究 ,发现
各组均有直接抑制肿瘤细胞增殖作用 , 且呈浓度 -效应正相关。
其中 HT50的 10 mg· ml-1浓度抑制作用最强。通过光学显微
镜 、荧光显微镜对细胞形态学的观察 , 可见细胞核固缩 、核碎裂 、
细胞膜起泡及凋亡小体形成等形态 , 随着浓度的增加凋亡率也
不断升高。DNA琼脂糖凝胶电泳显示实验组细胞 , DNA电泳图
上呈现 “梯状”条带 , 这是细胞凋亡最具特征的生化改变;流式细
胞仪分析 , 三叶青黄酮作用后的细胞均出现明显的亚 2倍体峰。
三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞具有明显的诱导凋亡作用 ,
是很有潜力的抗癌药物。
参考文献:
[ 1 ] 　中国医学科学院药物研究所 , 北京医学院 , 南京药学院 ,等.中药
志(第 2册)[ M] .北京:人民出版社 , 1984:219.
[ 2 ] 　肖崇厚.中药化学 [ M] .上海:上海科学技术出版社 , 2000:265.
[ 3 ] 　姜　泊 ,周殿元.细胞凋亡基础与临床 [ M] .北京:人民军医出版
社 , 1999:258, 263, 266, 285.
收稿日期:2009-12-19;　修订日期:2010-06-16
基金项目:北京市中医管理局青年科学研究资助项目;
北京市中西医结合传染病重点学科项目(京中重 IV13);
北京中医局优秀人才培养计划
作者简介:孙凤霞(1969-),女(汉族),河北深县人 ,现任北京地坛医院副
主任医师 ,硕士学位 ,主要从事中西医结合治疗肝病研究工作.
＊通讯作者简介:王宪波(1963-), 男(汉族),河北邢台人 , 现任北京地坛
医院主任医师 ,博士学位 ,主要从事中西医结合治疗肝病研究工作.
清肝化痰活血方对大鼠非酒精性脂肪肝的防治研究
孙凤霞 ,张姝媛 ,王宪波＊ , 石小红 ,沈　冰 , 兰梦东
(首都医科大学传染病学研究所 、北京地坛医院中西医结合中心 ,北京　100015)
摘要:目的 观察清肝化痰活血方对大鼠非酒精性脂肪肝的疗效 。方法 雄性 SD大鼠 52只 , 随机分为正常组(12只)、模
型组(30只)、预防组(10只)。除正常组外 , 其他组以高脂饲料造模 ,造模 12周后 , 将模型组大鼠随机分为 2组 , 即模型
对照组(10只)与治疗组(10只)。预防组和治疗组均给予清肝化痰活血中药干预。分别观察清肝化痰活血方对大鼠肝
脏脂肪变性及炎症程度 、血清 ALT、AST的影响。结果 造模 12周时 , 正常对照组大鼠肝组织正常 , 没有脂肪变性和炎症
发生;模型组大鼠均发生重度肝脏脂变及不同程度的肝组织炎症 , 而预防组大鼠肝脏的脂变程度和炎症程度明显轻于模
型组。与正常对照组比较 , 模型组血清 ALT活性 、AST活性有上升趋势 , 但统计学处理无显著差异(P>0.05);与模型组
比较 , 预防组血清 ALT、AST活性显著下降(P<0.05);治疗 4周时 , 治疗组大鼠的肝脏脂肪变性程度和炎症程度均明显
轻于模型对照组;治疗组 ALT、AST活性明显低于模型对照组(P<0.05)。结论 清肝化痰活血方对非酒精性脂肪性肝病
有较好的预防和治疗作用。可在一定程度上防止肝脏脂肪过度沉积 , 改善肝功能 , 改善肝细胞脂肪变性 、减轻肝组织炎
症。
关键词:清肝化痰活血方;　非酒精性脂肪性肝炎
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.062
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)11-2851-03
　　非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfatyliverdisease, NAFLD)是
指酒精性因素以外多病因引起的肝内大泡性脂肪变。非酒精性
脂肪性肝炎 (nonalcholicsteatohepatitis, NASH)是指继发于
NAFLD,合并肝脂肪变性与炎症的一种疾病。日益增多的资料表
明 , NAFLD患病率逐年增加 , 趋于超过病毒性肝炎和酒精性肝
病 , 成为全球普遍关注的医学问题和社会问题 [ 1] 。对于 NASH目
前尚无特效治疗 ,长期的临床经验表明中药清热化痰活血方治疗
有一定疗效。为进一步验证此法的疗效 ,特设计本实验研究。
1　材料
1.1　清肝化痰活血方药物组成 茵陈蒿 18g,栀子 10 g,大黄 6g,
决明子 15 g, 陈皮 10 g,半夏 10 g, 茯苓 15 g,丹参 15g, 郁金 10 g。
1.2　动物 SD雄性大鼠 , 52只 , 体质量 140 ～ 160g, 购自北京维
通利华实验动物技术有限公司 [许可证号:SCXK(京)2007 -
0001] 。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11 时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期