全 文 ：论 著
(基础研究)
三叶青总黄酮通过 Wnt /β-catenin 通路抑制结肠癌细
胞周期及增殖
余 纳，张钰坪，叶院宁，孙文荣，刘 畅，汪芳裕
［摘要］ 目的 三叶青总黄酮(Total Flavonoids of Tetrastigma Hemsleyanum，TFTH)对多种肿瘤具有较强的抑制作用。
分析 TFTH对结肠癌细胞周期及细胞增殖能力的影响，并进一步探索其分子机制。 方法 采取 CCK-8 试验及克隆形成试验
检测不同浓度 TFTH(0、1． 6、3． 2 及 6． 4 mg /mL)对人结肠癌细胞 HT29 及 SW620 细胞增殖能力的影响，并运用流式细胞术检
测不同浓度 TFTH对肿瘤细胞周期的调节作用;通过免疫印迹及实时荧光定量聚合酶链反应等方法证实 TFTH对 Wnt /β-cate-
nin通路有效调控及细胞周期相关蛋白 Cylin D1 和 c-myc的表达。 结果 在 0、1． 6、3． 2 和 6． 4 mg /mL TFTH孵育后，SW620
细胞在 6 孔板中形成的克隆数量分别为 (196 ± 25． 06)、(75． 33 ± 7． 64)、(19 ± 6． 08)、0 个 /孔，HT29 细胞为 (206． 67 ±
30． 55)、(106 ± 12． 17)、(9． 67 ± 4． 04)、0 个 /孔，各浓度间两两比较，差异均有统计学意义(P ＜ 0． 05)。结肠癌细胞 S + G2 /M
期细胞的比例降低(P ＜ 0． 05)，且呈浓度依赖性。同时，TFTH 干预的 HT29 细胞及 SW620 细胞内活化的 β-catenin 蛋白的
表达随药物浓度增高而逐渐降低，将 0、1． 6、3． 2 和 6． 4 mg /mL TFTH 作用于 SW620 细胞后，a-β-catenin 蛋白的 IOD 分别为
231． 46 ± 20． 66、109． 42 ± 15． 58、63． 14 ± 2． 33、6． 38 ± 11． 05;作用于 HT29 细胞时，其 IOD 分别为 817． 28 ± 76． 55、
566． 10 ± 96． 80、324． 23 ± 53． 51、141． 67 ± 34． 35，与 0 mg /mL相比，差异均有统计学意义(P ＜ 0． 01)，进一步研究发现，与
0 mg /mL相比，1． 6、3． 2、6． 4 mg /mL的 TFTH 干预后细胞内 Cyclin D1 和 c-myc 在 mＲNA 及蛋白质水平的表达也显著下调
(P ＜ 0． 05 )。 结论 TFTH抑制结肠癌细胞增殖能力，其作用机制与下调肿瘤细胞 Wnt /β-catenin 信号通路活性，抑制细
胞周期有关。
［关键词］ 三叶青总黄酮;结肠癌;细胞周期;细胞增殖
［中图分类号］ Ｒ285 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1008-8199(2016)06-0582-05
［DOI］ 10． 16571 / j． cnki． 1008-8199． 2016． 06． 005
基金项目:国家自然科学基金(81270453)
作者单位:210002 南京，南京大学医学院附属金陵医院
(南京军区南京总医院)消化内科［余 纳(医
学硕士)、张钰坪、叶院宁、孙文荣、刘 畅、汪
芳裕］
通讯作者:汪芳裕，E － mail:wangfy65@ nju． edu． cn
Total flavonoids of tetrastigma hemsleyanum inhibits the cycle and proliferation of colon cancer cells
through the Wnt /β-catenin pathway
YU Na，ZHANG Yu-ping，YE Yuan-ning，SUN Wen-rong，LIU Chang，WANG Fang-yu
(Department of Gastroenterology and Hepatology，Jinling Hospital，Nanjing University School of Medicine / Nanjing
General Hospital of Nanjing Military Ｒegion，PLA，Nanjing 210002，Jiangsu，China)
［Abstract］ Objective The total flavonoids of tetrastigma hemsleyanum (TFTH)，a traditional herbal medicine，has a strong
inhibitory effect on various tumors． This study was to explore the effects of TFTH on the cycle and proliferation of colon cancer cell lines
and its underlying mechanisms． Methods SW620 and HT29 human colon cancer cell lines were treated with TFTH at the concentra-
tions of 0，1． 6，3． 2，and 6． 4 mg /mL． The proliferation of colon cancer cells was evaluated by plate colony formation assay and the
cell cycle distribution determined by flow cytometry． The Wnt /β-
catenin pathway activation and the expressions of the cell cycle-related
proteins cyclin D1 and c-myc were measured by Western blot and
quantitative real-time PCＲ (qＲT-PCＲ)． Ｒesults After treatment
with TFTH at 0，1． 6，3． 2，and 6． 4 mg /mL，the numbers of cloned
SW620 cells were 196 ±25． 06，75． 33 ±7． 64，19 ±6． 08，and 0，and
those of the HT29 cells were 206． 67 ± 30． 55，106 ± 12． 17，9． 67 ±
4． 04，and 0，respectively，with statistically significant difference
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between every two concentrations (P ＜ 0． 05)The colon cancer cells were markedly reduced in G0 /G1 phase in a dose-dependent man-
ner (P ＜ 0． 05)． Compared with the control group，less activation of the Wnt /β-catenin pathway was detected in the HT29 cells treated
with different concentrations of TFTH (817． 28 ± 76． 55 vs 566． 10 ± 96． 80，324． 23 ± 53． 51，and 141． 67 ± 34． 35，P ＜ 0． 01)as well
as in the SW620 cells (231． 46 ± 20． 66 vs 109． 42 ± 15． 58，63． 14 ± 2． 33，and 6． 38 ± 11． 05，P ＜ 0． 01)． Western blot and qＲT-
PCＲ revealed lower levels of cyclin D1 and c-myc after TFTH treatment (P ＜ 0． 05)． Conclusion TFTH suppresses the prolifera-
tion of colon cancer cells by down-regulating the activation of the Wnt /β-catenin pathway and inhibiting their cell cycle．
［Key words］ Total flavonoids of tetrastigma hemsleyanum;Colon cancer;Cell cycle;Proliferation
0 引 言
结肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前结
肠癌的治疗方法多种多样，如手术、局部肿瘤放疗、
化疗及生物治疗等。尽管如此，结肠癌患者整体预
后仍不理想，进展期结肠癌的患者临床疗效较
差［1 － 2］。因此研究结肠癌治疗新方法具有重要的科
学意义和临床价值。三叶青(Tetrastigma hemsleya-
num)是一种传统中草药，具有清热解毒、祛风化痰、
活血止痛的功效［3 － 4］。三叶青的块茎内黄酮类化合
物包括原花青素 B1、原花青素 B2、儿茶酸、芦丁、异
槲皮苷及黄芪多糖等，这些混合物被称为三叶青总
黄酮(Total Flavonoids of Tetrastigma Hemsleyanum ，
TFTH)［5］。药理实验已经证明 TFTH 具有抗炎、止
痛、退热、保肝、抗病毒及调节免疫作用等［6 － 7］。近
年来多项研究表明，TFTH 对多种肿瘤，如肝癌、宫
颈癌等均有较强的抑制作用。部分学者认为三叶青
提取物能通过不同的途径影响肿瘤细胞凋亡，调节
肿瘤免疫［8 － 9］。在 HepG2 肝癌细胞中，三叶青乙酸
乙酯提取物可引起肿瘤细胞 S 期阻滞，影响细胞周
期及细胞凋亡［10］。本文对 TFTH 在结肠癌中对细
胞周期及侵袭转移的影响进行探讨，并进一步探索
其调控机制。
1 材料与方法
1． 1 细胞培养 HT29 及 SW620 人结肠癌细胞购
自中国科学院上海细胞库，用含 10%胎牛血清及
1%双抗(青霉素及链霉素)的 DMEM 高糖培养基
(Gibico，USA)，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将
TFTH(南京泽朗医药有限公司，南京)溶于 DMSO
(Sigma，USA)，配制成含 TFTH 浓度分别为 0、1． 6、
3． 2 和 6． 4 mg /mL 的培养基，培养基中 DMSO 含量
低于 0． 1%［6，8，10］。观察到细胞贴壁并生长良好
后，加入含 TFTH 培养基，每 24 小时更换培养液 1
次，每 2 ～ 3 天传代 1 次并更换培养瓶(Sigma，
USA)。
1． 2 细胞增殖试验 用 96 孔板培养 SW620 及
HT29 细胞，约 5 × 103 /孔。待细胞贴壁后，分别加
入含 0、1． 6、3． 2 和 6． 4 mg /mLTFTH的培养基培养。
在孵育 24、48、72 h 后，向每孔加入 10 mL CCK-8 溶
液(碧云天，南京)，37 ℃孵育 1 h 后，用酶标仪在
450 nm波长条件下检测其吸光度 A 值，每个浓度及
时间点重复 5 个复孔。在 1． 6 mg /mL TFTH 作用下
SW620 及 HT29 细胞存活率轻度抑制，3． 2 和 6． 4
mg /mL的 TFTH可使肿瘤细胞存活率维持于较低的
水平，而不受干预时间的影响。
1． 3 克隆形成试验 将 SW620 及 HT29 细胞加入
6 孔板中，约 3 × 102 /孔。贴壁后分别加入含 0、1． 6、
3． 2 和 6． 4 mg /mL TFTH的培养基孵育，每 2 天更换
培养液 1 次。12 d 后，弃去并吸干培养基，用 4%多
聚甲醛固定细胞 15 min，1%结晶紫溶液染色 10 min
后，轻轻洗去染色液，晾干。拍照并计算克隆数量，
其中超过 50 个细胞的集落可纳入统计。每个浓度
重复 3 个复孔。
1． 4 流式细胞术 分别用 TFTH 药物浓度为 0、
1． 6、3． 2 和 6． 4 mg /mL 的培养基培养 SW620 及
HT29 细胞，48 h后收集细胞，约每孔 1 × 106，每个浓
度设置 3 个复孔。用不含 EDTA 的胰酶消化，冰
PBS冲洗、离心 2 次 (100 × g，5 min)。向细胞中加
入预冷的 70%乙醇，4 ℃固定 2 h。加 Ｒnase A 溶液
37 ℃孵育 30 min。每管细胞分别加入碘化丙啶(PI，
0． 04mg /mL)，充分混匀后，4℃避光孵育 30min。用
流式细胞仪(BD Bioscience，USA)在 488 nm的激发
波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况，并采用
流式分析软件分析。
1． 5 蛋白印迹 含 0、1． 6、3． 2 和 6． 4 mg /mL 浓度
的 TFTH 培养基培养细胞 48 h，待细胞约长至
60% ～70%融合时，用细胞裂解液(99% ＲIPA + 1%
PMSF，碧云天，南京)提取总蛋白，其中每个浓度设
置 3 个复孔。分别加等量蛋白提取液于含 SDS-
PAGE的 10%丙烯酰胺凝胶中，电泳分离，并将胶中
蛋白转移至 PVDF 膜上。用 TBST 液配制 5% BSA
溶液，室温下封闭 PVDF 膜 1 h 后，加一抗 Total β-
catenin (CST，1∶1000)，Active β-catenin (Millipore，
1∶ 1000) ，c-myc(Abcam，1 ∶ 2000) ，CyclinD1 (Ab-
cam，1∶1000) ，β-actin (Epitomics，1∶5000) ，4 ℃孵育
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过夜。次日室温孵二抗 1 h。与辣根过氧化物酶底
物(Bio-Ｒad，America)充分反应，数字成像系统
(Tanon，China)检测蛋白结合水平，用 Image-pro
plus 6． 0 软件测定蛋白条带的累积光密度(Integrat-
ed optical density，IOD)，蛋白相对表达量以目的蛋
白与 β-actin比值的形式表示。
1． 6 实时荧光定量聚合酶链反应 使用 Trizol 试
剂(Invitrogen，USA)分别提取浓度为 0、1． 6、3． 2 和
6． 4 mg /mL TFTH 培养后的结肠癌细胞总 ＲNA，使
用 PrimeScriptTM ＲT kit (Takara，Japan)将 ＲNA 逆
转录为 cDNA。用 SYBＲ premix Ex TaqTM Green II
(Takara，Japan)在 qＲT-PCＲ系统上(BioＲad，USA)
检测靶基因的 mＲNA 水平，每个浓度设置 3 个复
孔。qＲT-PCＲ的引物分别为:Cyclin D1:Forward Se-
quence: TCTACACCGACAACTCCATCCG， Ｒeverse
Sequence:TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG;c-myc:
Forward Sequence:CCTGGTGCTCCATGAGGAGAC，
Ｒeverse Sequence:CAGACTCTGACCTTTTGCCAGG。
相关靶基因 mＲNA表达水平，以内参基因 β-actin水
平的倍数形式表达并计算。
1． 7 统计学分析 采用 SPSS 19． 0 软件进行统计
分析。定量资料以均数 ±标准差(x ± s)表示。组间
比较使用 One-Way ANOVA 进行统计。以 P≤0． 05
为差异有统计学意义。
2 结 果
2．1 TFTH 抑制细胞克隆形成 在 0、1． 6、3． 2 和6． 4
mg /mL TFTH孵育后，SW620 细胞在 6 孔板中形成的
克隆数量均数分别为 (196 ±25． 06)、(75． 33 ± 7． 64)、
(19 ± 6． 08)、0 个 /孔，HT29 细胞为 (206． 67 ±
30． 55)］、(106 ± 12． 17)、(9． 67 ± 4． 04)、0 个 /孔，各
浓度间两两比较，差异均有统计学意义(P ＜ 0． 05)。
见图 1。
2． 2 TFTH 对细胞周期的阻滞作用 流式细胞术
结果显示:在 TFTH 作用 48 h 后，处于 S + G2 /M 期
的结肠肿瘤细胞比例明显下降，而 G0 + G1期比例增
加。含 0、1． 6、3． 2 和 6． 4 mg /mL TFTH 培养 SW620
细胞 S + G2 /M 期细胞比例分别为 60． 9%、51． 6%、
18． 7%、15． 4%，HT29 结肠肿瘤细胞 S + G2 /M 期
细胞比例分别为 57． 3%、49． 7%、37． 4%、19． 9%，
浓度间两两比较的差异有统计学意义(P ＜ 0． 05)，
见图 2。
2． 3 TFTH 下调 Wnt /β-catenin 通路活性 予以
不同 TFTH 干预细胞后，Western blot 检测可见
SW620、HT29 结肠癌细胞中 β-catenin 总蛋白(t-β-
catenin)水平保持不变，而磷酸化的 β-catenin(a-β-
catenin)蛋白表达明显降低。将 0、1． 6、3． 2 和 6． 4
mg /mL TFTH作用于 SW620 细胞后，a-β-catenin 蛋
白的 IOD 分别为 231． 46 ± 20． 66、109． 42 ± 15． 58、
63． 14 ± 2． 33、6． 38 ± 11． 05;作用于 HT29 细胞时，
其 IOD 分别为 817． 28 ± 76． 55、566． 10 ± 96． 80、
324． 23 ± 53． 51、141． 67 ± 34． 35，与 0 mg /mL比较相
比，差异均有统计学意义(P ＜ 0． 01)，见图 3。
图 1 TFTH 对细胞克隆形成能力的抑制
Figure 1 Inhibitory effects of different concentrations of
TFTH on the clone formation ability of the
SW620 and HT29 cells
图 2 流式细胞术分析 TFTH干预后细胞周期变化
Figure 2 Inhibitory effects of different concentrations of
TFTH on the cell cycles of the SW620 and HT29
cells
2 ． 4 TFTH 抑制 Wnt 通路靶蛋白的表达 进一
步检测发现，与 0 mg /mL TFTH相比，予以 1． 6、3． 2
和6． 4 mg /mL TFTH 培养后，SW620 及 HT29 细胞
内 CyclinD1 和 c-myc 蛋白水平均明显降低 (P ＜
0． 05)，其下降程度与药物浓度呈正相关，见图 4。
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qＲT-PCＲ检测可见，与 0 mg /mL 相比，1． 6、3． 2、6． 4
mg /mL TFTH干预之后肿瘤细胞内 CyclinD1和 c-myc
呈依赖性的 mＲNA表达抑制(P ＜0． 05)，见图 4。
2． 5 三叶青总黄酮抑制Wnt通路靶蛋白的表达
进一步检测发现，与 0 mg /mL TFTH 组相比，予以
1． 6、3． 2 和 6． 4 mg /mL TFTH 培养后，SW620 及
HT29 细胞内 CyclinD1 和 c-myc 蛋白水平均明显降
低，其下降程度与药物浓度呈正相关(P ＜ 0． 05)，见
图 5。同时，qＲT-PCＲ 检测发现 TFTH 干预后也呈
浓度依赖性地抑制结肠癌细胞内 CyclinD1 和 c-myc
mＲNA水平的表达(P ＜ 0． 05)，见图 5。
a:SW620;b:HT29 细胞
与 0 mg /mL比较，* P ＜ 0． 01
图 3 THTF抑制结肠癌细胞Wnt /β-catenin通路
Figure 3 Inhibitory effects of different concentrations of
TFTH on the Wnt /β-catenin pathways of the
SW620 and HT29 cells
a:SW620;b:HT29 细胞
与 0 mg /mL比较，* P ＜ 0． 01
图 4 THTF抑制Wnt通路靶蛋白表达
Figure 4 Inhibitory effects of different concentrations of
TFTH on the expressions of Wnt-pathway target
proteins in the SW620 and HT29 cells
a:SW620;b:HT29 细胞
与 0 mg /mL比较，* P ＜ 0． 01
图 5 THTF抑制Wnt通路靶蛋白的表达
Figure 5 Inhibitory effects of different concentrations of
TFTH on the expressions of Wnt-pathway target
proteins in the SW620 and HT29 cells
3 讨 论
部分研究发现中草药中的黄酮类化合物有抑制
肿瘤细胞增殖、凋亡的功效［7，9 － 10］。为证实 TFTH
对结肠肿瘤的抑制作用具有普遍性，本实验选用了
结肠腺癌的原位肿瘤细胞株 HT29 及腹腔淋巴结转
移肿瘤细胞株 SW620，并向结肠癌细胞中加入不同
浓度的 TFTH进行培养。研究发现，TFTH可呈浓度
依赖性抑制地肿瘤细胞增殖能力及克隆形成能力，
并将细胞周期阻断于 G0 /G1期，减少肿瘤细胞从 G1
期向 S期转化。进一步研究发现，TFTH 可通过抑
制 β-catenin 的磷酸化而调控 Wnt /β-catenin 通路的
活性，抑制 Wnt 通路下游调控细胞周期的靶基因
cyclinD1 及 c-myc表达。
Wnt /β-catenin 通路参与肿瘤的增殖，分化，凋
亡及转移等多种生物学过程，在肿瘤发生发展过程
中起重要作用［11 － 12］。研究发现，90%的结直肠肿瘤
中可检测到 Wnt 通路的突变，如 β-catenin 基因突
变。结肠肿瘤中 β-catenin 在核内堆积，其核内 β-
catenin水平和结肠癌患者预后呈负相关［13 － 14］。核
内 β-catenin结合于Wnt通路的靶基因，激活Wnt通
路，并在转录水平调节下游靶基因 cyclinD1，c-myc，
E-cadherin及 Lgr5 等表达［12，15 － 19］;而多种靶基因的
激活可促进肿瘤细胞生长、分化、侵袭及转移等肿瘤
的恶性生物学行为［20 － 23］。
本研究发现，予以不同浓度 TFTH 干预后，结肠
肿瘤细胞增殖能力及克隆形成能力明显下降。同
时，流式细胞分析可见细胞周期受影响，其中 S +
G2 /M期的细胞比例下降，而 G0 + G1期比例明显增
加，提示细胞周期由 G1期向 S 期的转换过程被阻
滞，其抑制程度与药物浓度呈正相关，提示 TFTH
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抑制结肠癌细胞增殖可能通过调控细胞周期实现。
进一步研究发现，用含 TFTH的培养基培养后，细胞
内 β-catenin总蛋白水平不变，而磷酸化的 β-catenin
明显减少，表明 β-catenin 活化减少，Wnt /β-catenin
通路被抑制。同时，TFTH 呈浓度依赖性地抑制了
Cylin D1 和 c-myc 等细胞周期相关调控蛋白在
mＲNA和蛋白水平的表达。实验结果提示 TFTH 可
能通过降低Wnt /β-catenin通路活性，下调Wnt通路
的靶基因 Cylin D1 和 c-myc 的表达，继而阻断肿瘤
细胞有丝分裂周期的进展，抑制结肠肿瘤细胞增殖
作用。此外，本研究同样探索了 TFTH 对肿瘤细胞
增殖的影响，流式细胞术结果提示不同浓度的
TFTH干预后结肠癌细胞凋亡水平无明显变化。
综上所述，TFTH 可通过抑制 Wnt /β-catenin 信
号通路活性，影响肿瘤细胞有丝分裂过程，抑制结肠
肿瘤的增殖作用。本文以中医理论为指导，结合现
代药理研究，验证了中草药三叶青中的有效成分，为
中药的临床应用提供了理论依据。三叶青作为毒副
作用微弱的常用中草药，其块茎内黄酮类化合物有
显著抑制肿瘤的作用，可为将来临床治疗恶性肿瘤，
尤其是进展期肿瘤及产生化疗药物抵抗的患者提供
新的治疗方向。
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(收稿日期:2016-01-25; 修回日期:2016-03-29)
(责任编辑:缪 琴; 英文编辑:罗永合)
·685· 医学研究生学报 2016 年 6 月 第 29 卷 第 6 期 J Med Postgra，Vol． 29，No． 6，June，2016