全 文 ：94.3(C-1), 52.7(-OCH3)。根据以上光谱数据和
GC-MS计算机标准谱库检索结果 ,确定化合物 Ⅲ为
2, 4, 6-三羟基苯甲酸甲酯(methyl2 , 4, 6-trihydroxy-
benzoate)。
化合物 Ⅳ:黄色粉末状固体(甲醇), mp255 ～
256℃。在硅胶薄层板上用不同的溶剂体系展开 ,均
为单点 , 365 nm紫外光下显棕色荧光 。 ESI-MSm/
z:567[ 2M-H] +, 283[ M-H] -。 IR(KBr)υmax(cm-1):
3428, 1665, 1599, 1502, 1433, 1378, 1342, 1292,
1185, 828。1H-NMR(400MHz, DMSO-d6 )δ:12.95
(1H, s, 5-OH), 10.34(1H, s, 4′-OH), 7.94(2H, d, J
=8.8Hz, H-2′, H-6′), 6.93(2H, d, J=8.8Hz, H-3′,
H-5′), 6.82(1H, s, H-3), 6.74(1H, d, J=2.1Hz, H-
8), 6.36(1H, d, J=2.1Hz, H-6), 3.86(3H, s, 7-
OCH3);13C-NMR(100MHz, DMSO-d6 )δ:181.9(C-
4), 165.1(C-7), 164.0(C-2), 161.2(C-9), 161.1
(C-4′), 157.2(C5), 128.5(C-2′, C-6′), 121.0(C-
1′), 115.9(C-3′, C-5′), 104.6(C-10), 103.0(C-3),
97.9(C-6), 92.6(C-8), 56.0(7-OCH3)。以上光谱
数据与文献〔6〕基本一致 ,鉴定化合物 Ⅳ为芫花素
(genkwanin)。
参 考 文 献
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(2007-12-28收稿)
白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸的
毛细管电泳高频电导法测定
刘春霞 1 ,朱培仪2 ,宋粉云 2＊
(1.中山大学附属第二医院药学部 ,广东广州 510120;2.广东药学院 ,广东广州 510120)
　　摘要　目的:建立白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法。方法:采用毛细管区带电泳 , 高频电导检
测;未涂层弹性融硅石英毛细管柱 55 cm×75 μmID, 有效长度 50 cm;1.2 mmol/L三乙胺-HCl(pH=10.0), 0.24
mmol/Lβ-环糊精为运行缓冲液;分离电压 12.5 kV;重力进样 10 s(高度 20 cm)。结果:以布洛芬为内标 , 齐墩果
酸 、熊果酸线性范围分别为 3.9 ～ 39.0 μg/ml(r=0.9991)和 20.0 ～ 140.0 μg/ml(r=0.9990);平均回收率分别为
97.1%和 96.0%。结论:该法简便 、准确 、快速 、重现性好 , 可用于白花蛇舌草药材中齐墩果酸和熊果酸的含量测
定。
关键词:毛细管电泳;高频电导检测;白花蛇舌草;齐墩果酸;熊果酸
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)08-1176-03
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(5002841)作者简介:刘春霞(1965-),女,主管药师 ,研究方向:药学;Tel:020-81332978, E-mail:lcxgzchina@yahoo.com.cn。＊通讯作者:宋粉云(1965-),女 ,教授 ,从事药物分析的教学和科研工作;Tel:13660528126, E-mail:fuhaiwu@163.com。
　　白花蛇舌草始见于 《广西中药志 》, 别名蛇舌
草 、蛇刺草 、羊须草等 ,中国药典 2005年版 “附录 ”
中规定其来源为茜草科植物白花蛇舌草 Oldenlandia
difusa(Wild.)Roxb.的干燥全草 ,在我国广东 、福
建 、江西 、江苏 、安徽等地均有广泛栽培。本品性味
微苦 、甘 ,寒 ,其干燥或新鲜全草具有清热解毒 、利尿
消肿 、活血止痛 、抗菌消炎和抗肿瘤等功效〔1, 2〕。白
花蛇舌草中所含有的化学成分复杂 ,目前发现的主
要有蒽醌类 、萜类 、甾醇类 、苷类 、有机酸类 、黄酮类 、
多糖类 、香豆精类和生物碱类等 〔3〕。齐墩果酸
(OA)、熊果酸(UA)是白花蛇舌草的重要活性成分 ,
二者为同分异构体 ,齐墩果酸具有较强的抑菌 、强
·1176· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.08.032
心 、利尿和保肝作用 ,是已肯定的免疫增强剂 〔4〕 ,熊
果酸除具有广泛的生物学效应 ,体外抗菌活性及对
中枢神经有明显的安定与降温作用外 ,对多种致癌 、
促癌物亦有抵抗作用 ,对多种恶性肿瘤细胞有抑制
生长作用〔5〕。白花蛇舌草中 OA和(或)UA的含量
测定 ,文献报道有薄层扫描法〔6〕、反相高效液相色
谱法〔7〕 ,亦有 HPLC指纹图谱 〔8〕和 LC-MS指纹图
谱 〔9〕研究的报道 。但采用毛细管电泳同时测定白
花蛇舌草中 OA和 UA含量的方法未见文献报道 ,
本文利用毛细管电泳分离 ,高频电导检测 〔10〕白花蛇
舌草中 OA和 UA的含量 。该检测器避免了化合物
末端紫外吸收的限制 ,并且装置简单 ,方法易行 。从
测定结果显示 ,该法具有分离效果好 、快速 、价廉 、简
便等优点 ,可用于该产品的质量控制 。
1 　仪器和材料
CES2003毛细管电泳仪 ,包括高压电源 、高频电
导检测器及毛细管电泳数据工作站(中山大学化学
与化学工程学院研制)。ORIONMODEL828型 pH
计(美国)。 DL-360超声波清波器 (工作频率 4.5
KHz±5%,输出功率 240 W,宁波石浦海天电子仪
器厂)。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(75 μmID,
河北永年锐沣色谱器件有限公司)。
白花蛇舌草样品分别采自广东增城 、广东清远 、
广东茂名 ,经广东药学院生药专家刘基柱老师鉴定
为正品 。将其粉碎 ,于 60℃下干燥 4 h,置干燥器内
备用。定量方法学考察采用广东增城样品 。
齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所 ,
批号:110709-200505);熊果酸对照品(中国药品生
物制品检定所 ,批号:110742-200506);布洛芬对照
品 (中国药品生物制品检定所 , 批号:100179-
200303)。 β-环糊精(中国医药集团上海化学试剂
公司);三乙胺等试剂均为分析纯;水为去离子水。
2 　方法与结果
2.1 　溶液的制备
2.1.1　内标溶液:精密称取布洛芬对照品 22.0mg
置 50 ml量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,
作为内标贮备液(浓度为 440 μg/ml)。
2.1.2 　对照品溶液:精密称取 OA对照品 19.5
mg、UA对照品 20.0 mg置 50 ml量瓶中 ,加甲醇溶
解并稀释至刻度 ,摇匀 ,作为对照品贮备液(浓度分
别为 390 μg/ml和 400 μg/ml)。
2.1.3　供试品溶液:取本品粉末约 1g,精密称定 ,
置索氏提取器中 ,加甲醇 80ml,加热回流 3h,放冷 ,
提取液置 100 ml量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,经
0.45μm滤膜过滤 ,作为供试品溶液 。
2.2　电泳条件　未涂层弹性融硅石英毛细管柱 54
cm×75 μmID,有效长度 50 cm;以 1.2 mmol/L三
乙胺 -HCl(pH=10.0), 0.24 mmol/Lβ-环糊精为运
行缓冲液;分离电压 12.5 kV;重力进样 10 s(高度
20 cm);温度 25℃,湿度小于 45%。毛细管柱在使
用前依次用去离子水 、0.1 mol/L的 NaOH溶液 ,去
离子水 、缓冲液各冲洗 5 min;检测电极和缓冲液容
器用超声波清洗 10min。进样 5次之后也需按照上
述步骤清洗毛细管柱。
2.3　方法学考察
2.3.1 　标准曲线的制备:分别吸取一定量的对照
品贮备液 、内标溶液加甲醇稀释成含齐墩果酸浓度
为 3.9、7.8、15.6、19.5、 23.4、31.2、39.0 μg/ml,熊
果酸浓度为 20.0、 40.0、60.0、80.0、100.0、120.0、
140.0 μg/ml与内标溶液浓度均为 19.8μg/ml的溶
液。依次重力进样 10 s,每个浓度测定 3次以上。
以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(Y),对照
品溶液浓度(C)为横坐标进行线性回归 ,分别得回
归方程 YOA =0.0242C-0.0465(r=0.9991);YUA =
0.0209C+0.0509(r=0.9990)。表明 OA浓度在
3.9 ～ 39.0 μg/ml、UA浓度在 20.0 ～ 140.0 μg/ml
范围内与峰面积线性关系良好。
2.3.2　精密度试验:取浓度分别为 19.5、80.0μg/
ml的 OA与 UA对照品浓液 ,重力进样 10 s,连续测
定 5次 ,记录峰面积并计算 RSD。结果 YOA的 RSD
=1.27%、YUA的 RSD=1.01%,表明仪器精密度良
好。
2.3.3 　稳定性试验:取供试品溶液(广东增城)在
0、2、4、8、24h,分别重力进样 10 s,记录峰面积。结
果 YOA的 RSD=2.11%、YUA的 RSD=1.67%,表明
供试品溶液在 24 h内稳定 。
2.3.4 　重复性试验:取同一批号(广东增城)样品
6份 ,按 2.1.3项下方法提取 、测定 。结果 OA的平
均含量为 1.75 mg/g, RSD=3.92%(n=6);UA的
平均含量为 9.94 mg/g, RSD=0.76%(n=6)。表
明重复性良好 。
2.3.5 　加样回收率试验:精密称取同一批号(广东
增城)的白花蛇舌草药材 6份 ,加入相应量的 OA和
UA对照品 ,按 2.1.3项下方法处理并测定 ,计算回
收率 。OA的平均回收率为 97.1%、RSD=2.86%;
UA的平均回收率为 96.0%、RSD=1.18%。结果
表明方法准确 、可靠 。
2.4　样品测定 　取不同产地的白花蛇舌草 , 按
2.1.3项下方法处理后测定 ,记录峰面积 ,代入回归
方程计算样品中齐墩果酸和熊果酸的含量 ,结果见
·1177·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月
表 1。
　表 1　　　　　白花蛇舌草样品中 OA和 UA
的含量测定结果(n=3)
编号 产地 OA含量(mg/g) RSD(%) UA含量(mg/g) RSD(%)
1 广东增城 1.75 3.92 9.94 0.76
2 广东清远 1.58 3.42 8.79 1.24
3 广东茂名 1.64 4.16 8.64 1.73
3 　讨论
3.1 　缓冲液的选择　实验考察了 NaAc-HAc、三乙
胺 -H3BO3、 Tris-H3BO3 、 NaH2PO4 -H3PO4、 Tris-
Na2HPO4 、NaH2PO4 -Na2HPO4 、三乙胺 -HCl等几种电
解质体系不同浓度和不同配比对分离效果的影响 。
结果发现 , 只有在三乙胺 -HCl和三乙胺-H3BO3这
两个体系中 OA和 UA可以出峰 。将这两个体系进
行实验对比 ,三乙胺 -HCl体系基线平稳 ,峰形较好 ,
检测信号灵敏度高 ,因此认为三乙胺 -HCl体系是比
较理想的缓冲液 。
3.2 　添加剂的选择　由于 OA和 UA属于同分异
构体 ,空间结构中只有一个甲基的位置不同 ,在未加
任何添加剂的情况下 ,检测时只有一个峰而无法实
现分离 。在保持体系不变 ,本实验对 SDS、熊去氧胆
酸 、β-环糊精 、HP-β -环糊精分别进行考察 , 发现
SDS、熊去氧胆酸无法分离 OA和 UA, HP-β-环糊精
分离效果不佳 , β -环糊精能够对 OA和 UA产生较好
的分离效果 。
随后对 β -环糊精浓度进行了实验考察 ,在 0.02
～ 0.6 mmol/L范围内 ,进样 OA和 UA混合对照品 。
当浓度低于 0.24 mmol/L,对照品分离度达不到
1.5;浓度在 0.24 ～ 0.4 mmol/L时 ,分离度又逐渐下
降 ,且迁移时间延长;浓度大于 0.6 mmol/L时 ,对照
品无法分离 。这是由于随着环糊精浓度的增加 ,相
应增加了包合物的浓度 ,体系粘度增大 ,延长出峰时
间;且浓度增加影响缓冲液的电渗流 ,溶液中各组分
的电泳淌度也发生变化 ,从而影响分离度 。经过对
供试品和对照品的多次实验 ,选择 β -环糊精浓度为
0.24mmol/L。
3.3 　分离电压和进样时间的影响　分离电压决定
了电场强度的大小 ,影响电渗流和待测物质的迁移
速度 ,也是影响分离的重要因素之一。在毛细管内
径和长度固定的条件下 ,一定范围内 ,组分的迁移时
间和分离电压成反比关系 ,随着分离电压增大 ,样品
的迁移速度加快 ,分离度和灵敏度也越大 。在 7 ～
22 kV分离电压下进样分析 ,结果表明 ,高的分离电
场令电渗流速度加快 ,出峰时间明显缩短 ,有利于加
快分析速度。但分离电压过高 ,焦耳热增大 ,会导致
噪音大幅度增加 ,当分离电压达到 18 kV时基线有
明显的毛刺 ,并且可以听到高压放电的声音。故选
择分离电压为 12.5kV。
进样量同时受进样时间和进样高度的影响。在
20 cm高度下比较了进样时间为 2.0 ～ 20.0 s的分
离效果 ,结果表明 ,峰高随着进样时间延长而增加 ,
但当进样时间大于 14.0 s时 ,峰高增加幅度下降 ,
区带展宽趋于明显 ,峰形受到影响;进样时间 4.0 s
以下时 ,进样量太小 ,检测到的峰高较小 ,不利于检
测。在相同条件下考察了虹吸进样高度为 10.0 ～
30.0 cm的分离检测效果 。综合考虑 ,选择的进样
高度为 20 cm,进样时间为 10.0s。
3.4　供试品提取方法的选择　实验比较了甲醇 、
95%乙醇 、乙醚 、三氯甲烷 4种提取溶剂对提取的影
响 ,乙醚 、三氯甲烷提取液的杂质较少 ,但提取率不
高 ,甲醇与 95%乙醇提取率相当 ,而甲醇提取液色
谱图杂质峰少 ,对熊果酸与齐墩果酸测定无干扰 ,基
线较平稳。选择甲醇作溶剂后 ,对比超声 、索氏提
取 、加热回流 3种提取方法 ,结果发现超声和加热回
流提取均不如索氏提取的提取率高 ,用索氏提取 2h
的样品基线稳定 ,提取完全 , OA和 UA的检测状况
良好 。
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