全 文 ：收稿日期:2009-09-07;　修订日期:2010-03-18
基金项目:广东省自然科学基金(No.5002841)
作者简介:张　锋(1978-),男(汉族),山西榆次人 ,现任山西农业大学医
院主管药师 ,硕士学位 ,主要从事中药研究和医院药学工作.
枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量的
毛细管电泳高频电导法测定
张　锋 1 ,宋粉云2＊
(1.山西农业大学医院 ,山西 太谷　030801;　2广东药学院 ,广东 广州　510224)
摘要:目的 建立枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法。方法 采用毛细管区带电泳 , 高频电导检测;未涂层弹性
融硅石英毛细管柱 55cm×75 μmID,有效长度 46cm;1.2mmol· L-1三乙胺 -HCl(pH=10.60), 0.24mmol· L-1 β -环
糊精为运行缓冲液;分离电压 12.5 kV;重力进样 10 s(高度 20 cm)。结果 以布洛芬为内标 , 齐墩果酸 、熊果酸线性范围
分别为 5.1 ～ 102.0 g/ml(r=0.999 7)和 5.55 ～ 111.0 g/ml(r=0.999 3);平均回收率分别为 96.0%和 97.2%。结论 该
法简便 、准确 、快速 、重现性好 ,可用于枇杷叶的质量控制研究。
关键词:毛细管电泳;　高频电导检测;　枇杷叶;　齐墩果酸;　熊果酸
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.08.012
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)08-1875-03
DeterminationofOleanolicAcidandUrsolicAcidIsomersinFoliumeriobotryaebyCapil-
laryZoneElectrophoresiswithHighFrequencyConductivityDetection
ZHANGFeng1 ,SONGFen-yun2＊
(1.HospitalofShanxiAgriculturalUniversity, Taigu, Shanxi030801 , China;2.GuangdongPharmacologicalU-
niversity, Guangzhou510224, China)
Abstract:ObjectiveToestablishamethodforthedeterminationofoleanolicacidandursolicacidisomersinFoliumeriobot-
ryae.MethodsItwasstudiedbyCapilaryZoneElectrophoresiswithhighfrequencyconductivitydetection.Theseparationwas
performedonauncoatedfusedsilicacapilaryof55 cm×75 μmID(46 cmeffectivelength).1.2 mmol· L-1 Triethylamine
(TEA)bufercontaining0.24mmol· L-1β -cyclodextrinandpHadjustedto10.60 withHydrochloricacidwasselectedforthe
runningbufer.Thevoltageappliedwas12.5kVandtemperaturewasmaintainedat25℃.Thesamplewasinjectedbygravity(10
s, 20 cm).ResultsThelinearrangesofdeterminationforoleanolicacidandursolicacidwere5.1 ～ 102.0 g/ml(r=0.9997)
and5.55 ～ 111.0 g/ml(r=0.999 3).Theaveragerecoveryforoleanolicacidandursolicacidwas96.0%, 97.2% respectiv-
iely.ConclusionThemethodisreliable, simple, rapidandaccurate.Themethodcanbeusedforquantitativedeterminationof
oleanolicacidandursolicacidisomersinFoliumeriobotryae.
Keywords:CapilaryZoneElectrophoresis;　Highfrequencyconductivitydetection;　Foliumeriobotryae;　Oleanolicacid;　
Ursolicacid
　　枇杷叶为蔷薇科植物枇杷 Eriobotryajaponica(Thunb.)
Lindl.的干燥叶 ,有清肺止咳 、降逆止呕之功效 , 主治肺热咳嗽 ,
气逆喘急 , 胃热呕逆 ,烦热口渴等症 [ 1] , 主产于广东 、江苏 、福建 、
江西等地。近年来对其化学成分的研究表明 ,其主要成分为三萜
酸和倍半萜及其苷类 ,药理活性的报道也主要集中于三萜酸的抗
炎 、降血糖和抗病毒活性 [ 2 ～ 4]方面。目前枇杷叶的含量测定方法
有薄层色谱法 [ 5]和 HPLC法 [ 6] 。本文采用毛细管区带电泳(Cap-
ilaryZoneElectrophoresis, CZE)高频电导(Highfrequencyconduc-
tivitydetection)检测的方法 [ 7] , 对不同产地枇杷叶中齐墩果酸
(oleanolicacid,简称 OA)和熊果酸(ursolicacid, 简称 UA)进行含
量测定的研究 , 以期为药材质量控制提供可借鉴的依据。
1　仪器与试药
CES2003毛细管电泳仪 ,包括高压电源 、高频电导检测器及
毛细管电泳数据工作站(中山大学化学与化学工程学院研制)。
ORIONMODEL828型 pH计(美国)。 DL-360超声波清洗器
(宁波石浦海天电子仪器厂), 工作频率 4.5 kHz± 5%, 输出功
率 240 W。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(75mID,河北锐年永
沣色谱器件有限公司)。
枇杷叶样品(批号 1:购自广东清远;批号 2:购自广东连山;
批号 3:购自河南;批号 4:购自江苏;批号 5:购自福建), 经广东
药学院生药学专家房志坚副教授鉴定为真品。将其粉碎 , 于
60℃下干燥 4 h, 置干燥器内备用。定量方法学考察采用广东清
远的样品。
齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所 , 批号:110709-
200505);熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所 , 批号:110742
-200516);布洛芬对照品(中国药品生物制品检定所 , 批号:
100179-200303)。 β -环糊精(中国医药集团上海化学试剂公
司);三乙胺等试剂均为分析纯;水为去离子水(电阻为 16.6MΨ
· cm-1)。
2　方法
2.1 　溶液的制备
2.1.1　内标溶液 精密称取布洛芬对照品 20.2 mg置 50ml量瓶
中 , 加甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 作为内标贮备液(浓度为
404 g/ml)。
2.1.2　对照品溶液 精密称取 OA对照品 20.4 mg, UA对照品
22.2 mg置 50 ml量瓶中 , 加甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 作为
对照品贮备液(浓度分别为 408g/ml和 444g/ml)。
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2.1.3　供试品溶液 取本品粉末约 2.0 g, 精密称定 ,加甲醇 40
ml, 水浴中加热回流 2h,冷却至室温 ,转移至 50 ml量瓶中 ,加甲
醇至刻度 , 摇匀 ,过滤 , 续滤液 0.45 μm滤膜过滤 , 作为供试品溶
液。
2.2 　电泳条件 未涂层弹性融硅石英毛细管柱 50 cm×75 μm
ID, 有效长度 46 cm;以 1.2 mmol· L-1三乙胺 -HCl(pH=
10.60), 0.24 mmol· L-1 β -环糊精为运行缓冲液;分离电压
12.5 kV;重力进样 10s(高度 20 cm);温度 25℃,湿度小于 45%。
毛细管柱在使用前依次用去离子水 、 0.1 mol· L-1的 NaOH溶
液 、去离子水 、缓冲液各冲洗 5 min;检测电极和缓冲液容器用超
声波清洗 10min。进样 5次之后也需按照上述步骤清洗毛细管。
在此条件下 , 对照品 、样品色谱图见图 1。
1.齐墩果酸　　　 2.熊果酸
3.布洛芬　　　 4.水峰
图 1　对照品(A)、样品(B)的毛细管电泳色谱图
2.3 　方法学考察
2.3.1　标准曲线制备 分别吸取一定量的对照品贮备液 、内标
溶液加甲醇稀释成含齐墩果酸浓度为 5.1, 10.2, 20.4, 40.8,
61.2, 81.6, 102.0 g/ml、熊果酸浓度为 5.55, 11.1, 22.2, 44.4,
66.6, 88.8, 111.0g/ml与内标溶液浓度为 20.1 g/ml的溶液。依
次重力进样 10s,每个浓度测定 3次以上。以对照品与内标峰面
积的比值为纵坐标(Y), 对照品溶液浓度(C)为横坐标进行线性
回归 , 分别得回归方程 YOA=0.023 5C-0.026 7(r=0.999 7);YUA=0.022 9C-0.026 4(r=0.999 3)。表明 OA浓度在 5.1 ～
102.0g/ml、UA浓度在 5.55 ～ 111.0 g/ml范围内与峰面积线性
关系良好。
2.3.2 　精密度实验 取浓度分别为 40.8、 44.4 g/ml的 OA与
UA对照品溶液 , 重力进样 10 s, 连续测定 5次 , 记录峰面积并计
算 RSD。结果 YOA的 RSD =1.57%, YUA的 RSD =1.35%, 表明
仪器精密度良好。
2.3.3　稳定性实验 取供试品溶液(批号 1)在 0, 2, 4, 8, 24h,分
别重力进样 10s,记录峰面积。结果 YOA的 RSD = 4.64%, YUA
的 RSD =3.50%,表明供试品溶液在 24 h内基本稳定。
2.3.4　重复性实验 取同一批号(批号 1)样品 6份 , 按 “ 2.1.3”
项下方法提取 、测定。结果 OA的平均含量为 3.63mg· g-1 , RSD
=4.54%(n=6);UA的平均含量为 9.08 mg· g-1 , RSD =
3.88%(n= 6)。表明分析方法精密度良好。
2.3.5　加样回收实验 精密称取同一批号(批号 1)的枇杷叶药
材共 6份 , 加入相应量的 OA和 UA对照品 , 按 “ 2.1.3”项下方法
处理并测定 , 计算回收率。 OA的平均回收率为 96.0%、RSD =
2.76%;UA的平均回收率为 97.2%, RSD = 3.44%。结果表明
方法准确 、可靠。结果见表 1 ～ 2。
表 1　OA回收率实验结果
样品重
m/g
OA量
m/mg
加入量
m/mg
测得量
m/mg
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
1.000 1 3.63 3.26 6.72 94.8
0.975 2 3.54 3.26 6.58 93.3
1.159 8 4.21 3.26 7.28 94.2 96.0 2.76
1.066 1 3.87 3.26 7.13 100.0
1.129 4 4.10 3.26 7.20 95.1
1.096 4 3.98 3.26 7.19 98.5
　　n=6
表 2　UA回收率实验结果
样品重
m/g
UA量
m/mg
加入量
m/mg
测得量
m/mg
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
1.000 1 9.08 8.88 17.64 96.4
0.975 2 8.85 8.88 17.52 97.6
1.159 8 10.53 8.88 18.89 94.1 97.2 3.44
1.066 1 9.68 8.88 18.12 95.0
1.129 4 10.25 8.88 18.81 96.4
1.096 4 9.96 8.88 19.15 103.5
　　n=6
2.4 　样品测定 取不同产地的枇杷叶 , 按 “ 2.1.3”项下方法处
理后测定 ,记录峰面积 , 代入回归方程计算样品中齐墩果酸和熊
果酸的含量。结果见表 3。
表 3　枇杷叶样品中 OA和 UA的含量测定结果
编号 产地 OA含量C/mg· g-1
RSD
(%)
UA含量
C/mg· g-1
RSD
(%)
1 广东清远 3.63 4.54 9.08 3.88
2 广东连山 2.25 4.57 7.94 4.55
3 河南 4.40 4.79 14.04 4.56
4 江苏 3.53 3.69 13.11 4.91
5 福建 3.73 3.42 14.29 3.75
3　讨论
3.1 　缓冲液的选择 实验考察了 NaAc-HAc,三乙胺 -H3BO3 ,
Tris-H3BO3 , NaH2PO4 -H3PO4 , Tris-Na2HPO4 , NaH2PO4 -
Na2HPO4 , 三乙胺 -HCl等几种电解质体系不同浓度和不同配比
对分离效果的影响。结果发现 ,只有在三乙胺 -HCl和三乙胺 -
H3BO3这两个体系中 OA和 UA可以出峰。将这两个体系进行
实验对比 ,三乙胺 -HCl体系基线平稳 ,峰形较好 , 检测信号灵敏
度高 , 因此认为三乙胺 -HCl体系是比较理想的缓冲液。
3.2 　体系 pH值的影响 缓冲溶液的 pH值是影响分离检测的
一个重要因素 ,缓冲溶液的酸度直接影响毛细管表面的 Zeta电
势 , 从而影响电渗流(EOF)的方向和速率;同时溶液的酸度也决
定样品中各组分分子的表观电荷数 ,继而影响组分的迁移时间和
分离度 。在比较不同 pH值对分离效果的影响中发现 , 当 pH值
低于 10.0时 , 峰形很差;在 pH值于 10.0 ～ 10.60之间 ,分离度逐
渐加大;pH值为 10.60时 , OA和 UA的峰形好 , 基线稳定 , 其原
因可能是在此 pH值条件下 , OA和 UA的羧基与三乙胺存在弱配
合作用 , 形成的复合阴离子在电渗流作用下向负极移动 , 在流经
检测器时电导值发生变化而被检测。
3.3　缓冲液浓度的选择 三乙胺的浓度对分离产生很大的影
响 , 在本实验中 ,保持 pH=10.60及环糊精浓度为 0.24 mmol·
L-1不变的情况下 , 依次改变三乙胺的浓度(0 ～ 2 mmol· L-1)发
现 , 随着浓度的增加 , OA和 UA的分离度及峰面积随之增加 , 但
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.8
在浓度大于 1.2 mmol· L-1时 ,分离度保持在 1.5 ～ 2.0之间 ,并
不会发生很大变化 , 而且此时电流增加 , 基线不平 , 迁移时间后
移。因此在保证分离度的情况下 , 选择三乙胺的浓度为 1.2
mmol· L-1 , 见图 2。
图 2　三乙胺浓度对迁移时间的影响
3.4　添加剂的选择 由于 OA和 UA属于构造异构体 , 空间结构
中只有一个甲基的位置不同 , 在未加任何添加剂的情况下 , 检测
时只有一个峰而无法实现分离。 在保持体系不变 , 实验对 SDS
(十二烷基硫酸钠)、熊去氧胆酸 、β -环糊精 、HP-β -环糊精分
别进行考察 ,发现 SDS、熊去氧胆酸无法分离 OA和 UA, HP-β -
环糊精分离效果不佳 , β -环糊精能够对 OA和 UA产生较好的
分离效果。
随后对 β -环糊精浓度进行了实验考察 , 在 0.02 ～ 0.6
mmol· L-1范围内 , 进样 OA和 UA混合对照品。当浓度低于
0.24 mmol· L-1 ,标准品分离度达不到 1.5;浓度在 0.24 ～ 0.4
mmol· L-1 , 分离度又逐渐下降 , 且迁移时间延长;浓度大于
0.6 mmol· L-1时 , 对照品无法分离 , 见图 3。这是由于随着环糊
精浓度的增加 , 相应增加了包结物的浓度 , 体系粘度增大 ,延长出
峰时间;且浓度增加影响缓冲液的电渗流 , 溶液中各组分的电泳
浓度也发生变化 , 从而影响分离度。经过对供试品和对照品的多
次实验 , 选择 β -环糊精浓度为 0.24 mmol· L-1。
图 3　β -环糊精浓度对分离度的影响
3.5 　电压 、温度及湿度的影响 随着电泳电压的增加 (7 ～
20kV),样品出峰时间缩短 , 分离度变小 , 且电流显著增加 , 从焦
耳热的影响和毛细管散热来考虑 ,选择 12.5kV为最佳分离电压。
见图 4。
实验中还发现 ,随着温度的改变及室内相对湿度的变化 , 对
实验重现性有很大的影响 ,因此选择实验环境为 25℃, 相对湿度
<45%为宜。
图 4　电压对迁移时间的影响
3.6 　供试品提取方法的选择 实验比较了甲醇 、 95%乙醇 、乙
醚 、三氯甲烷 4种提取溶剂 ,乙醚 、三氯甲烷提取液的杂质较少 ,
但提取率不高 ,甲醇与 95%乙醇提取率相当 , 而甲醇提取液色谱
图杂质峰少 ,对熊果酸与齐墩果酸测定无干扰 , 基线较平稳。 选
择甲醇作溶剂后 ,对比超声 、索氏 、加热回流 3种提取方法 , 结果
发现超声 2 h和索氏提取的提取率均不如加热回流 2 h的提取
率 , 用加热回流的样品基线稳定 , 提取完全 , OA和 UA的检测状
况良好 。
4　结论
在优化的实验条件下 , 这几种药材中的 OA和 UA可以在
6min之内得到很好的分离 ,并且进行含量测定 , 该高频电导检测
器使用方便 ,灵敏度较高 ,实验重现性和精密度都比较理想。 由
于其自身的特点和优势 ,随着研究的深入 , 其应用潜力在毛细管
电泳分离中草药成分中会得到更大的发挥。
参考文献:
[ 1 ] 　国家药典委员会.中国药典 , Ⅰ 部 [ S] .北京:化学工业出版社 ,
2005:142.
[ 2 ] 　葛金芳 ,李　俊 , 胡成穆 , 等.枇杷叶三萜酸的免疫调节作用研究
[ J] .中国药理学通报 , 2006, 22(10):1194.
[ 3 ] 　DeTommasiN, DesimoneF, CirinoG, etal.Hypoglycemicefectof
sesquiterpeneglycosidesandpolyhydroxylatedtrierpenoidsofEriobotrya
japonica[ J] .PlantaMed, 1991, 57(5):414.
[ 4 ] 　ShokoTanigachi, YokoImayoshi, EriKobayashi, etal.Productionof
bioactivetriterpenesbyEriobotryajaponica[J].Phytochemistry, 2002,
59(3):315.
[ 5 ] 　韩小龙 ,陈开勋.薄层扫描法测定枇杷叶中熊果酸 [ J].中草药 ,
2005, 36(7):1086.
[ 6 ] 　杜丰玉 ,陈　钧 ,宣　寒.RP-HPLC测定枇杷叶中熊果酸和齐墩
果酸的含量 [ J] .中成药 , 2006, 28(12):1790.
[ 7 ] 　谢天尧 ,郑一宁.一种简易型毛细管电导检测装置及其作用 [ J] .分
析测试学报 , 2000, 19(3):5.
·1877·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.8 时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期