全 文 ：林业科学研究 2012，25(2) :174 181
Forest Research
文章编号:1001-1498(2012)02-0174-08
山苍子 AFLP反应体系的建立及其引物筛选
田胜平1，汪阳东1* ，陈益存1，占志勇1，斯林林2
(1．中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400;2．安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036)
收稿日期:2011-07-13
基金项目:浙江省科技计划项目(2009C32107) ;国家林业局重点科研项目(2011-01)
作者简介:田胜平(1986—) ，男，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事化工原料植物育种研究．
* 通讯作者: 汪阳东，副研究员，从事分子生物学研究． E-mail:wyd111111@ 126． com
摘要:通过对山苍子幼嫩叶片、顶芽、花蕾 3 种组织的 DNA提取效果分析和对影响酶切及选择性扩增效果的 4 个主
要因素(酶切时间、Mg2 +浓度、dNTPs浓度、引物浓度)的比较研究，建立了适合于山苍子 AFLP分析的技术体系。结
果表明，山苍子的顶芽是较好的 DNA提取材料;山苍子基因组 DNA经 5 U EcoR I和 5 U Mse I酶切 1 h即可完全酶
切;最佳的选择性扩增体系为 20 μL 反应体系中含有 1． 0 U rTaq 聚合酶、2． 0 μL 10 × PCR 缓冲液、1． 8 μL 25
mmol·L －1MgCl2、1． 4 μL 2． 5 mmol·L
－1dNTP、100 ng·μL －1引物各 1． 0 μL。使用该反应体系获得了清晰、稳定的
DNA指纹图谱，并筛选出 10 对多态性较好的 AFLP引物组合，为利用 AFLP标记技术进一步开展山苍子种群遗传结
构、遗传分化等研究奠定了基础。
关键词:山苍子;基因组 DNA;AFLP;多态性引物
中图分类号:S718． 46 文献标识码:A
Primer Screening and AFLP Amplification Reaction System of Litsea cubeba
TIAN Sheng-ping1，WANG Yang-dong1，CHEN Yi-cun1，ZHAN Zhi-yong1，SI Lin-lin2
(1． Research Institute of Subtropical Forestry，Chinese Academy of Forestry，Fuyang 311400，Zhejiang，China;
2． School of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，Anhui，China)
Abstract:The effect of DNA extraction was analyzed by comparing the young leaf，terminal bud and flower of Litsea
cubeba． The time of DNA digestion and several key factors affecting the PCR selective amplification such as Mg2 +
concentration，dNTPs concentration and the mount of the selective amplification primer were also trialed． An opti-
mized AFLP reaction system of Litsea cubeba was established． The results showed that the high quality genomic DNA
as a PCR template could be isolated from the bud tissue;genomic DNA could be digested in a hour by 5 U EcoR I
and 5 U Mse I;The optical selection amplification system was 20 μL reaction mix containing 1． 0 U rTaq polymer-
ase，2． 0 μL 10 × PCR buffer，1． 8 μL 25 mmol·L －1MgCl2，1． 4 μL 2． 5 mmol·L
－1dNTP，100 ng·μL －1 primer
each 1． 0 μL． Clear and stable amplification band patterns can be obtained and 10 pairs of AFLP primers with good
genetic diversity were selected according to the optimized reaction system． The results will be an effective protocol
for further studying the genetic structure and differentiation of Litsea cubeba population．
Key words:Litsea cubeba;genomic DNA;AFLP;the polymorphic primer
山苍子(Litsea cubeba (Lour．)Pers．)别名山鸡
椒、木姜子等，系樟科(Lauraceae)木姜子属(Litsea
Lam．)植物，多为灌木或小乔木，高约 8 10 m［1］，
全世界大约有 250 余种，中国约有 70 余种［2］。原
产于中国，主要分布在长江以南的数十个省份，印
度、印度尼西亚、马来西亚、日本等东南亚、东亚各
国也有分布［3］。其果实、树皮、树叶、树干均可提
炼山苍子油，山苍子油中富含柠檬醛、高级醇、有
第 2 期 田胜平等:山苍子 AFLP反应体系的建立及其引物筛选
机酸，其中柠檬醛含量约占精油的 70% 80%，是
制造紫罗兰酮素系列香料的重要原料［4］;此外，山
苍子油还是许多食品的香料添加剂以及各种香水、
VE、VA、VK 合成的重要原料来源
［5］;其核仁提炼出
的核仁油含有大量的脂肪酸，主要成分为月桂酸和
癸酸。其中月桂酸的含量达 50%以上，可用来代
替椰子油和棕榈仁油，广泛应用于表面活性剂、保
鲜剂、防腐剂制造等工业领域［6 － 7］。我国是世界上
最大的山苍子油生产国和出口国，年出口量达
3 000 5 000 t 左右，产品远销美、日、英、法、德、
瑞士、荷兰、印尼等国［8］。
我国的山苍子野生资源地理分布范围较广，由
于长期的自然选择作用以及地理的隔离效应，导致
了其在自然界中形成了丰富的遗传变异，种内品种
较多，且不同品种的品质和产量均存在很大的差
异，品种选育的空间很大。现有的研究主要侧重于
其精油化学成分分析［9 － 11］、繁殖技术［12 － 14］以及精
油加工应用［15 － 19］等方面，有关山苍子的遗传变异
研究和良种选育工作至今尚未开展。探索适合于
山苍子 AFLP分析的技术体系，对于将来深入开展
山苍子的遗传变异研究、分子标记辅助育种以及从
分子水平上研究山苍子品种间的分类鉴定都有重
要的指导作用。AFLP 是一种基于 PCR 的 DNA 指
纹技术，近年来，AFLP 数据作为核基因技术的代
表与 mtDNA基因测序数据组合，在解决种内遗传
分化、种间系统发育问题方面共同发挥着重要的作
用［20］。在揭示物种的遗传变异方面，H． Nybom［21］
等还认为 AFLP 与 ISSR 相比，可更为准确地估计
群体内的变异水平。尽管 AFLP 实验技术对 DNA
的浓度不太敏感，但它对 DNA 的质量要求比一般
的分子标记技术要高，而且 AFLP 技术体系复杂，
操作程序较多，针对特定的物种或分类群，需要对
各个技术环节进行摸索和优化。因此，高质量
DNA的提取以及 AFLP 反应体系的建立是进行
AFLP成败的关键。本研究通过对山苍子不同组织
材料 DNA 的提取效果进行比较，以及对 AFLP 反
应体系的酶切时间和选择性扩增体系中的几个关
键影响因子进行优化，建立了一套适合于山苍子
AFLP分析的技术体系，为进一步研究山苍子种群
遗传结构、遗传分化以及重要经济性状的关联分析
奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
用于 DNA提取效果分析的山苍子植株新鲜组织
采自中国林科院亚热带林业研究所黄公望森林公园
内;用于多态性引物筛选的山苍子植株个体分别采自
浙江富阳(FY)、浙江龙泉(LQ)、安徽岳西(YX)、湖南
衡山(HS)、福建建瓯(JO)、云南景东(JD)。
试剂:AFLP引物及接头由上海生工生物工程有
限公司合成;Mse I、EcoR I、T4 DNA连接酶购自 NEB
公司;λDNA、rTaq 聚合酶购自 Takala 公司;酚∶氯仿
∶异戊醇(25∶ 24∶ 1)和氯仿 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1)、亲和硅
烷购自上海生工生物工程有限公司。
1． 2 山苍子基因组 DNA的提取及质量检测
本研究参照 J． J． Doyle 等［22］的 CTAB 法加以
改进。改进的方法中在 CTAB 液裂解前，用 DNA 洗
脱液(100 mmol·L －1 Tris-HCl (pH值 8． 0) ，1． 4 mol
·L －1NaCl，20 mmol·L －1 EDTA，2% β-巯基乙醇)
反复洗脱几次至上清液不再黏稠;在加入 2 × CTAB
裂解液(100 mmol·L －1 Tris-HC1 (pH 值 8． 0) ，20
mmol·L －1 EDTA，1． 4 mol·L －1 NaC1，2% CTAB，
2% β-巯基乙醇，5% PVP)的同时加入 200 μL的高
盐 TE(1． 0 mol·L －1 NaCl，10 mmol·L －1 Tris-HC1
(pH值 8． 0) ，1． 0 mmol·L －1 EDTA) ，混匀，65 ℃温
育 30 60 min;离心，取上清液于另一离心管，并加
入 1 /5 倍体积的 7． 5 mol·L －1的 NH4Ac ，颠倒混
匀，冰浴 30 min。将提取的 DNA 浓度调整至 50
ng·μL －1备用。将山苍子新鲜幼嫩叶片、顶芽和花
蕾 3 种组织研磨后，分别取等质量的粉末，用改进的
CTAB法进行各组织基因组 DNA 的提取，用 0． 8%
琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测 DNA 的纯
度和浓度。
1． 3 AFLP反应体系建立与优化设计
1． 3． 1 酶切与连接 本试验选用了 EcoR I /Mse I
双酶切组合，为确定酶切效果，试验前分别进行了两
种酶对基因组 DNA的单独酶切，在确保两种酶单独
酶切效果之后，再进行双酶切和连接反应，单酶切体
系和双酶切反应体系见表 1。为确定最佳的酶切反
应时间，设置了 6 个酶切反应时间梯度试验，时间
分别为 1、2、3、4、6、8 h;用 1%的琼脂糖凝胶电泳检
测酶切效果。连接反应采用 37 ℃连接 4 h，连接体
系见表 1。
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林 业 科 学 研 究 第 25 卷
表 1 山苍子 AFLP反应体系
单酶切体系(20 μL) 双酶切体系(20 μL) 连接体系(20 μL) 预扩增体系(20 μL)
EcoR I 5． 0 U EcoR I 5． 0 U EcoR I 2． 0 U T4 连接酶 4． 0 μL酶切连接模板
2． 0 μL 10 × PCR缓冲液 5． 0 U Mse I 2． 0 μL 10 × T4 缓冲液 1． 0 μL Mse I引物(100 ng·μL －1)
4． 0 μL DNA (50 ng·μL －1) 3． 0 μL DNA (50 ng·μL －1) 1． 0 μL Mse I接头 (50 pmol·μL －1)1． 0 μL EcoR I引物(100 ng·μL －1)
加 ddH2O至 20 μL 加 ddH2O至 20 μL 1． 0 μL EcoR I接头 (5 pmol·μL －1)1． 6 μL MgCl2(25 mmol·L －1)
Mse I 5． 0 U Mse I 加 ddH2O至 20 μL 1． 6 μL dNTPs (2． 5 mmol·L －1)
2． 0 μL 10 × PCR缓冲液 1． 0 U rTaq聚合酶
4． 0 μL DNA (50ng·μL －1) 2． 0 μL 10 × Taq缓冲液
加 ddH2O至 20 μL 加 ddH2O至 20 μL
1． 3． 2 预扩增体系及选择性扩增优化设计 预扩
增引物采用 E00 /M00引物组合，引物序列 E00:5-
GACTGCGTACCAATTC-3; M00: 5-GATGAGTCCT-
GAGTAA-3。取酶切连接液 4． 0 μL，加入 16 μL 混
合液(反应体系如表 1)进行预扩增。扩增程序为 94
℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共 30 个
循环，将预扩增产物稀释 20 倍，备用。
分别对选择性扩增反应体系中的引物浓度、
Mg2 +浓度和 dNTP 浓度分别进行了优化，以建立合
适的山苍子 AFLP 扩增体系:引物依次设置 200、
100、50、25 ng·μL －14 个浓度梯度;Mg2 +浓度梯度
为不同体系中分别加入 25 mmol·L －1 MgCl2 0． 8、
1． 0、1． 2、1． 4、1． 6、1． 8 μL，dNTP浓度梯度为不同体
系中分别加入 2． 5 mmol·L －1 dNTP 0． 8、1． 0、1． 2、
1． 4、1． 6、1． 8 μL。其余组分为稀释后的预扩增产物
4． 0 μL，10 × PCR 缓冲液 2． 0 μL，rTaq 聚合酶 1． 0
U，加 ddH2O至 20 μL。降落式 PCR扩增程序为:94
℃ 3 min，94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，13 个循
环，每次循环降低 0． 7 ℃，然后 94 ℃ 30 s，56 ℃ 30
s，72 ℃ 60 s，30 个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。
1． 4 电泳及银染检测
为了获得山苍子不同群体植株的 DNA 指纹图
谱，将选择性扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。使
用质量分数为 6%的聚丙烯酰胺凝 80 mL，加入 10%
的 APS 240 μL和 TEMED 64 μL混匀后立刻灌胶，聚
合 1 h以上，95 W预电泳约 25 30 min。选择性扩
增产物中加入 8． 0 μL上样缓冲液(98%甲酰胺，10 m
MEDTA(pH值 8． 0) ，0． 25%溴酚蓝，0． 25%二甲苯腈
蓝) ，混匀，95 ℃变性5 min，立刻转移到冰浴中以防扩
增产物复性，上样6． 0 μL，95 W恒功率电泳70 min左
右。电泳结束后采用王亚军等［23］描述的银染检测方
法进行 AFLP指纹显色反应。
2 结果与分析
2． 1 DNA提取
为了获得适宜于山苍子 AFLP 分析的高质量
DNA，经过摸索，最终采用改进的 CTAB 法提取山苍
子植株芽组织的 DNA。改进后的 CTAB 法提取的
DNA，吸光度比值在 1． 7 1． 9 之间，经 0． 8%的琼
脂糖凝胶电泳检测，条带清晰且无拖尾，无蛋白质、
多糖等杂质残留胶孔(图 1) ，在后续的酶切实验中，
基因组 DNA均能被 EcoR I 和 Mse I 充分酶切，说明
用改进的 CTAB 法提取的 DNA 符合 AFLP 分析
的要求。
M:DL 2 000 Marker;1 8:不同山苍子个体的 DNA样本
图 1 改进的 CTAB法提取山苍子顶芽组织的 DNA
在以山苍子植株幼嫩叶片、顶芽和花蕾为材料
提取 DNA的对比实验中，研究发现，山苍子植株的
顶芽、花蕾是较为理想的 DNA 提取材料，提取的
DNA所含的杂质少，条带清晰。然而在以花蕾为材
料的 DNA 提取过程中，发现经酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇
(25∶ 24∶ 1)和氯仿 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1)抽提后的上清液
仍含有大量的黄色色素，最终导致经超纯水溶解的
DNA含有一定的色素，从而影响下一步的酶切实
验。从叶片提取的 DNA 纯度较差，DNA 得率也较
低(图 2、表 1)。
λ:λDNA(50 ng·μL －1) ;1 2:叶片;3 4:顶芽;5 6:花蕾
图 2 改进的 CTAB法提取 3 种不同组织的 DNA
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第 2 期 田胜平等:山苍子 AFLP反应体系的建立及其引物筛选
表 2 改进的 CTAB法提取山苍子不同组织
类型的 DNA样品(n =8)
组织
类型
DNA质量
DNA浓度 /(ng·μL －1) (珔X ± SD) OD260 /OD280(珔X ± SD)
顶芽 98． 23 ± 0． 12 1． 82 ± 0． 01
叶片 42． 45 ± 0． 02 2． 13 ± 0． 02
花蕾 85． 46 ± 0． 01 1． 95 ± 0． 02
2． 2 酶切及连接
EcoR I 和 Mse I 两种酶的单酶切电泳结果如图
3 所示，EcoR I酶切后，基因组 DNA 主带消失，酶切
产物电泳条带低于基因组 DNA的主带，并呈现均匀
的弥散现象;Mse I酶切后成相对集中的小分子 DNA
片段，这表明两种酶都能分别进行山苍子基因组
DNA的完全酶切。EcoR I /Mse I 双酶切产物在凝胶
上呈现连续的大小不同的 DNA 片段(图 3)。这不
仅说明山苍子基因组 DNA能被 EcoR I和Mse I彻底
消化，而且证明了试验所用的酶切体系适合山苍子
的 AFLP分析。
M:DL 2 000 Marker;1:基因组 DNA，2 3:EcoR I酶切，4 5:Mse I酶切
图 3 EcoR I和 Mse I单酶切效果
双酶切反应中酶切时间对酶切效果有很重要的
影响，酶切结果又直接影响着连接反应。酶切时间
过短，基因组 DNA 不能被限制性内切酶完全酶切;
时间过长，酶的特异性降低，酶切片段的长度变小，
导致连接反应中的接头不能有效连接。为了进一步
探究适合山苍子的双酶切时间，本实验还设置了 6
个不同酶切时间的梯度，如图 4 所示，设置的 6 个酶
切时间结果和原基因组 DNA对比发现，基因组 DNA
的主带消失，6 个酶切时间的带型相近，呈均匀弥散
状，判断 1 h即可完成酶切。
2． 3 扩增体系的建立和优化
预扩增反应起着承上启下的作用，既反应酶切
M:DL 2 000 Marker;7:基因组 DNA，1 6:1、2、3、
4、6、8 h时间梯度
图 4 双酶切时间梯度对比效果
与连接效果的好坏，又直接影响着选择性扩增的电
泳结果。EcoR I接头和 Mse I 接头与酶切片段连接
后，利用 E00和M00寡核苷酸为引物进行预扩增，扩增
结果表明，预扩增片段主要集中在 100 500 bp 之
间，不同样品间预扩增带型相对一致(图 5)。这表
明接头与酶切片段已连接上，预扩增效果较好，可为
选择性扩增提供理想的模板;同时也表明此前进行
的基因组 DNA的提取、酶切和连接操作符合要求。
M:DL 1 500 Marker;1 6:FY、LQ、JO、HS、JD、YX样品
图 5 预扩增产物电泳检测
由于选择性扩增直接影响实验结果，本实验对
影响选择性扩增的几个关键因子(dNTPs浓度、Mg2 +
浓度以及引物浓度)进行了梯度优化。结果显示，
dNTPs(2． 5 mmol·L －1)使用量为 1． 4 μL时，选择性
扩增取得了最佳效果，浓度过高或过低均不同程度
地存在非特异性扩增或主带扩增不明显现象(图
6)。Mg2 +(25 mmol·L －1)使用量小于 1． 6 μL 时，
没有条带，只有弥散的带痕;Mg2 +使用量为 1． 6 μL
时，主带虚弱;Mg2 +使用量为 1． 8 μL时，主带次带均
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林 业 科 学 研 究 第 25 卷
清晰可见(图 7)。扩增体系中引物使用量小于 100
ng时，扩增效果不明显，只有弥散的带痕;引物使用
量为 200 ng 时，主带扩增较模糊，且存在非特异性
扩增现象;引物使用量为 100 ng 时，主带次带均清
晰可见，扩增效果最好(图 8)。优化后的山苍子
AFLP选择性扩增的最佳反应体系为:20 μL 反应体
系中含有 1． 0 U rTaq聚合酶、2． 0 μL 10 × PCR缓冲
液、1． 8 μL 25 mmol·L －1Mg2 +、1． 4 μL 2． 5 mmol·
L －1dNTPs、100 ng·μL －1引物各 1． 0 μL，预扩增产
物稀释 20 倍作为选择性扩增模板。使用该体系，不
同山苍子个体经不同引物组合的选择性扩增产物在
1%的琼脂糖凝胶上呈主带明亮，次带虚弱现象，扩
增效果较好(图 9)。
M:DL 2 000 Marker;1 6:0． 225、0． 200、0． 175、
0． 150、0． 125、0． 100 mmol·L －1
图 6 dNTP浓度变化的选择性扩增效果
M:DL 1 500 Marker;1 6:2． 25、2． 00、1． 75、
1． 50、1． 25、1． 00 mmol·L －1
图 7 Mg2 +浓度变化的选择性扩增效果
M:DL 1 500 Marker;1-1、1-2:200 ng·μL －1，2-1、2-2:100 ng·μL －1，
3-1、3-2:50 ng·μL －1，4-1、4-2:25 ng·μL －1
图 8 引物浓度变化的选择性扩增效果
M:DL 1 500 Marker;1 3，4 6，7 9，10 12，13 15 分别为
EAAC /MTCC、EACG /MCTT、EAAG /MTCC、EACT /MCTT、EACT /MCCT引物组合
图 9 不同引物组合的选择性扩增效果
2． 4 多态性引物的筛选
为了获取可供山苍子自然群体遗传多样性分析
的引物组合，本实验从 6 个不同群体中选取生态型
差异较大的山苍子个体用于多态性引物的筛选，最
后共筛选出 10 对多态性引物。总的来看，山苍子
AFLP图谱的片段大小在 50 500 bp 范围内，各引
物组合平均扩增出的条带数在 30 条左右，片段大小
范围较为适中，不同引物组合扩增的多态性高低、条
带清晰度、分布均匀度均相差较大(图 10)。筛选的
10 对引物共扩增出 303 条条带，其中多态性条带为
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第 2 期 田胜平等:山苍子 AFLP反应体系的建立及其引物筛选
259 条，多态性比率达 75． 0% 94． 1%。其中
EACG /MCAA 引物多态性最高(94． 1%) ，EACT /
MCTT引物多态性最低(75． 0%) (表 3)。筛选出的
这 10 对引物多态性较好，可以进一步用于山苍子遗
传多样性研究。
M:DL 1 500 Marker;P1 P6:EAAC /MTCC、EACG /MCTT、EACG /MCTA、EAAG /MTCC、
EACT /MCTT、EACT /MCCT引物组合，每 6 个泳道为筛选的一对引物
图 10 部分引物组合产生的 PAGE谱带
表 3 山苍子 AFLP引物筛选结果及条带多态性
引物组合 总条带数 条带范围 /bp 多态条带数 多态性比率 /%
EAAG /MTCC 28 50 400 24 85． 7%
EAAG /MCAA 26 50 400 23 88． 5%
EACT /MCTT 32 100 500 24 75． 0%
EACT /MCAA 30 100 400 26 86． 7%
EACG /MCTT 28 50 400 25 89． 3%
EACG /MCCT 23 50 400 20 87． 0%
EAAC /MTCC 34 50 500 28 82． 4%
EACG /MCTA 36 50 400 31 86． 1%
EACT /MCCT 32 50 500 26 81． 3%
EACG /MCAA 34 50 500 32 94． 1%
3 讨论
樟科的许多植物如肉桂(Cirmamonu cassia
Pres1．)、锡兰肉桂(C． zeylanicum Bl． Bijdr．)、阴香
(C． burmannii (C． G． et Th． Nees)B1．)等属于分
子生物学家所称的顽拗植物(recalcitrant plant)。这
类植物细胞内含有大量的多糖、鞣质、多酚等多种次
生代谢产物，采用常规的 CTAB 法、SDS 法、高盐低
pH法提取总 DNA时，都不能很好地除掉这些物质，
导致提取分离出的 DNA 由于不可逆地结合了这些
次生代谢物而呈棕褐色，DNA 溶液粘稠，这种不纯
的 DNA 既不能被内切酶酶切，也不能作为 PCR 模
板，不能用于常规的分子生物学分析和研究［24］。在
实验初期，本研究分别采用了常规 CTAB 法、SDS 法
和试剂盒法提取山苍子基因组 DNA。结果发现，
SDS法的提取效果最差，提取的 DNA 含杂质较多，
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林 业 科 学 研 究 第 25 卷
且 DNA溶液的粘稠度较高;试剂盒法提取的 DNA
溶液尽管不存在 DNA粘稠的问题，但研磨后的山苍
子叶片粉末经裂解液裂解后粘稠度仍较高，所释放
出的 DNA大多被次生代谢物质所包裹，最终导致提
取的 DNA得率较低，此外，试剂盒法提取的 DNA 降
解较严重，这可能与试剂盒所采用的离心柱有关;在
采用常规的 CTAB 法提取山苍子基因组 DNA 时发
现，经 CTAB液裂解后的上清液粘稠度极高，下一步
抽提操作也难以进行。为此，作者在传统 CTAB 法
的基础上加以改进，如在加入 CTAB 裂解液前，先用
DNA洗脱液反复洗脱几次、水浴裂解时加入高盐 TE
以及在裂解液中加入醋酸铵冰浴 30 min，以达到降
低粘稠度的目的。实验证明，这些处理对 DNA 的提
取有一定的有效性，所得 DNA 粘稠度较低，但尚不
能满足于 AFLP 实验对高质量 DNA 的要求。采用
改进的 CTAB法在以山苍子植株幼嫩叶片、顶芽和
花蕾为材料提取 DNA 的对比实验中，作者发现，以
山苍子顶芽组织为材料提取 DNA 时，经 CTAB 裂解
后的上清液粘稠性较低，经两次抽提后，上清液呈较
为透明状的液体，所得 DNA纯度和得率都较高。这
可能是由于在山苍子叶片组织中存在的难以抽提的
次生代谢物质在芽的发育早期还尚未参与合成或含
量较低的缘故。因此，选用山苍子植株的顶芽组织，
并采用改良的 CTAB法进行样本 DNA 的提取，所得
DNA质量能满足 AFLP分子标记实验的要求。
酶切反应是 AFLP 反应的关键步骤之一。本研
究选用 EcoR I /Mse I 酶切组合，获得的条带分布均
匀，能满足后续分析的要求。在以往的研究中，为了
使基因组 DNA得到充分酶切，一般采用延长酶切时
间的方法，然而，随着酶切时间的延长，内切酶的特
异性降低，很容易形成非特异性酶切现象，这势必会
对连接和后续的实验产生影响。为了确定合适的酶
切反应时间，在保证 DNA 质量的前提下，对酶切时
间进行优化，实验发现，山苍子基因组 DNA在 37 ℃
条件下经 EcoR I /Mse I 双酶切 1 h 即可完全完成酶
切，这一结论与赵敏在进行喙尾琵甲(Blaps rhyncho-
petera Fairmaire)基因组 DNA 酶切反应时的结论一
致［20］。在后续的预扩增反应中也充分显示出酶切 1
h和其它酶切时间的预扩增片段范围也近乎一致，
这与通常所认为的酶切反应时间至少需要 4 h 以上
有所不同，大大缩短了试验时间，说明在保证 DNA
模板质量和内切酶高效率的前提下，较短的时间内
就可以完成基因组 DNA 的限制性酶切。预扩增的
引物一般只含有 1 个选择性碱基或不含选择性碱
基，选择性较差，在琼脂糖凝胶中往往形成连续的一
片［25］。理论上，预扩增产物分子量大小应在 100
1 500 bp［26］。然而，山苍子预扩增产物却仅集中在
100 500 bp范围之间，这在许多其它植物 AFLP反
应过程中是非常少见的，可能与其基因组中酶切位
点的分布有关。
本试验采用单因子 PCR 优化设计对各个影响
因素进行研究，对最佳水平的确定更为直观，综合各
因素最佳水平，确定了最佳反应体系;并筛选出可供
山苍子遗传多样性研究的 10 对多态性高、条带较为
丰富的引物组合。所构建的山苍子 AFLP 反应体系
为进一步开展山苍子种群遗传学研究奠定了良好的
技术基础。然而，由于 AFLP 不能同 ISSR 或 RAPD
等标记一样可以直接通过琼脂糖电泳进行条带的优
化比较，本实验没有进一步采用正交设计或均匀设
计来考虑选择性体系中各因素的交互作用，AFLP条
带的优化将在接下来的银染步骤中进一步地探索。
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