全 文 ：辽东楤木叶总皂苷对卵巢癌细胞的抑制作用
及其对线粒体凋亡途径的影响
王春梅 1 ,张广美2＊
(1.黑龙江中医药大学 ,黑龙江 哈尔滨 150040;2.哈尔滨医科大学第一临床医学院 ,黑龙江 哈尔滨 150081)
摘　要:目的:探讨辽东楤木叶总皂苷(TALAS)对上皮性卵巢癌细胞 SKOV3的抑制作用及其可能的作
用机制。方法:MTT法检测 TALAS对 SKOV3细胞的抑制作用 ,绘制抑制曲线;Hoechst33258染色观察
不同浓度作用后 , SKOV3细胞核形态上的变化;蛋白印迹实验检测药物作用后线粒体凋亡通路中关键
蛋白质的表达变化 。结果:TALAS对 SKOV3细胞具有明显的抑制作用 ,且呈现时 -量依赖性;不同浓
度 TALAS作用后 , SKOV3细胞核出现:核固缩 、核碎裂等变化;用药前后 , bcl-2蛋白表达随药物浓度增
加而下降 , bax、Apaf-1、cyt-c蛋白质表达水平升高 ,且具有浓度依赖性 。结论:TALAS可促使 SKOV3
细胞发生凋亡 ,其作用机制可能与其激活线粒体凋亡途径有关。
关键词:辽东楤木叶;总皂苷;卵巢癌细胞;线粒体凋亡
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2011)01-0017-03
收稿日期:2010-11-13　　修回日期:2011-01-17
基金项目:哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目《辽东楤木叶总皂
苷对卵巢癌细胞抑制作用及其对 NF-KB信号传导通路的
影响 》(编号:2010FRXXS052)
作者简介:王春梅(1982-), 女 , 博士研究生 , 主要研究方向:中药抗
肿瘤。
＊通讯作者:张广美(1966-),女 , 主任医师 ,博士研究生导师 ,主要研
究方向:中药抗肿瘤。 zhangguangmei666@yahoo.cn。
　　卵巢癌的恶性度及癌相关死亡率分列为所有肿瘤
的第六位和第七位 [ 1, 2] ,为致死率最高的妇科肿瘤 [ 3] 。
目前 ,卵巢癌的治疗仍以手术为主 ,结合铂类和紫杉醇
类的化疗为辅 ,但由于对铂类耐药等原因 ,卵巢癌的 5
年生存率低于 45%[ 4] 。为解决这一问题很多学者将
目光转移到传统中药上 ,据统计 ,已有 700 ～ 800余种
中药被应用于治疗肿瘤及肿瘤相关症状 [ 5, 6]上 。辽东
楤木 ,又名刺老芽 、龙牙楤木 ,隶属于植物界 、被子植物
门 、双子叶植物纲 、伞形目 、五加科 、楤木属 ,多分布于
我国吉林 、黑龙江及韩国 、俄罗斯的部分地区。在我
国 ,其传统功效集中在抗炎 、治疗糖尿病等方面 [ 7 -9] 。
有研究证明辽东楤木叶总皂苷对鼠骨肉瘤细胞具有抑
制作用[ 10] 。本实验对辽东楤木叶总皂苷对卵巢癌细
胞的抑制作用及机制进行研究。
1　材料
1.1　细胞系及培养
上皮性卵巢癌 SKOV3细胞系由哈尔滨医科大学
附属肿瘤医院研究所提供 , SKOV3细胞培养于含 15%
胎牛血清的 RPMI-1640培养液中 ,其中加入 0.1%的
青 -链霉素和 0.3%谷氨酰胺 , 37℃、5%CO2恒温培
养箱培养 ,每隔 2d传一代 ,取对数生长期细胞用于
实验 。
1.2　药品及试剂
辽东楤木叶总皂苷(粉末状 、褐色 、易溶于水 ,室
温保存)由黑龙江中医药大学中药化学教研室赠送 ,
用含血清 RPMI-1640培养液配成 1000ug·mL-1的母
液 , -20℃保存 ,根据实验现配成所需浓度 。 RPMI-
1640培养液(HyClone,美国);胎牛血清(NQBB,澳大
利亚);Hoechst33258凋亡染色试剂盒 、蛋白分子量标
准 、细胞培养用青 -链霉素(碧云天生物技术研究
所);β -actin、小鼠抗人 bcl-2、bax、Apaf-1抗体 ,马
抗小鼠 IgG(北京中衫金桥 , SANTACRUZ进口分装);
MTT及 DMSO(Gibical)。
1.3　实验耗材及仪器设备
细胞培养用 25cm2培养瓶 、96孔培养板 、6孔培养
板 、移液头均购自 Corning;细胞培养箱;荧光倒置显微
镜;美国 BiotekinsrumentsSynergyTM4多功能酶标仪;
日本产日立高速离心机;日本产 ASTEC梯度基因扩增
仪;DYY-12型电泳仪(北京六一仪器厂);百维信蓝
盾 552可见光凝胶电泳透射仪;UVPGDS-8000凝胶
成像仪等 。
2　实验方法
2.1　MTT法检测辽东楤木叶总皂苷(TALAS)对 SK-
OV3细胞的抑制作用
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Vol.39, No.1, 2011 　　　　　　　　　
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收集对数生长期 SKOV3细胞 ,以每孔 5×103种
植于 96孔培养板中 ,板四周用 PBS填补 ,培养 24h后 ,
吸弃培养液 , 加药组分别加入 40μg·mL-1 、 60μg·
mL-1 、80μg·mL-1 、100μg·mL-1、120μg·mL-1、140μg·
mL-1 、160μg·mL-1 、180μg·mL-1的 TALAS药液 ,设立
阴性对照组 (不加药 )和空白组 (只加培养液 , 无细
胞),每孔均设立 5个复孔。分别作用 24h、48h、72h
后 ,每孔加入 20μLMTT,孵育 4h,用移液器吸出上清
液 ,各孔加入 150μLDMSO,摇床振荡 10min后 ,酶标仪
测定 570nm波长时各孔的吸光度值。根据公式:细胞
增殖抑制率 =(1-实验组 A值 /对照组 A值)×100%
计算抑制率 , SPSS13.0制作抑制曲线 。
2.2　Hoechst33258染色试剂观察 TALAS作用后 SK-
OV3细胞核的变化
对数生长期 SKOV3细胞以每孔 2 ×105种植于 6
孔细胞培养板中 ,培养 24h后 ,分为对照组 、加药 1组
(100μg·mL-1)、加药 2组(200μg·mL-1),加药后 ,培
养 36h,吸尽培养液 ,加入固定液 ,固定 10min,吸弃固
定液 ,用 PBS洗 3遍 ,每次 3min,加入 Hoechst33258染
色液 ,染色 5min,吸弃染色液 , PBS洗 2遍 ,吸尽液体 ,
倒置荧光显微镜观察 , 激发波长 350nm, 发射波长
460nm,检测细胞核的改变。
2.3　蛋白印迹实验测定 TALAS作用后 Apaf-1、
bcl-2、bax、cyt-c蛋白质水平的变化
SKOV3细胞于培养瓶中培养 24h后 , 分为对照
组 、加药 1组 (100μg·mL-1 )、加药 2组 (200μg·
mL-1),去上清液 , 加入药液 ,培养 48h后 , 吸尽培养
液 , PBS冲洗 ,胰酶消化 ,收集细胞 ,冰上裂解 1h,每
15min涡旋一次 ,提取的蛋白质经过浓度测定 ,计算上
样量 ,进行聚丙烯胺凝胶电泳 ,按蛋白分子量决定电泳
时间为 1 ～ 1.5h,再将蛋白质转到硝酸纤维素膜上 ,
1%BSA封闭过夜 ,小鼠抗人 bcl-2、bax单克隆抗体
按 1∶500稀释 ,小鼠抗人单克隆抗体 Aaβ -actin按1∶
300稀释 ,一抗孵育 2h,二抗孵育 2h, DAB显色 , UVP
凝胶成像仪照相 ,分析结果。
3　实验结果
3.1　TALAS对 SKOV3细胞生长的抑制作用　见图
1。
3.2　Hoechst33258染色法对不同浓度 TALAS作用
36h后 , SKOV3细胞核形态的变化　见图 2 ～ 4。由图
可见 ,与对照组相比 ,加药组细胞出现核致密浓染 、核
固缩 、核碎裂 、核边际。
3.3　蛋白印迹法检测 TALAS作用后 bcl-2、bax、
Apaf-1、cyt-c蛋白质水平的变化　见图 5。如图所
图 1　药物浓度与 SKOV3细胞生长的关系
图 2　对照组(未加药 skov3细胞核呈蓝色 ,形态完整)
图 3　加药一组(细胞核浓染 、出现核碎裂)
图 4　加药二组(细胞核碎裂 、出现核边际)
示 ,加药后 bcl-2蛋白质表达水平下降 ,而 Bax、Apaf
-1、cyt-c表达增强 ,且呈现浓度依赖性 ,结果见图
1。各加药组平均荧光强度与对照组相比 ,差异显著 ,
具有统计学意义(P<0.05, P<0.01)。结果见表 1。
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图 5　蛋白印迹结果
表 1　TALAS对各蛋白质水平的影响( x±s)
组别(浓度
μg·mL-1) Bcl-2 bax Apaf-1 cyc-c
0 2.34±0.17 2.01±0.15 1.66±0.11 1.91±0.14
80 2.06±0.21＊ 2.22±0.16＊ 2.02±0.14＊＊ 2.07±0.15＊
160 1.89±1.14＊＊ 2.42±0.12＊＊ 2.26±0.21＊＊ 2.24±0.18＊＊
　　注:与对照组相比 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。
4　讨论
楤木属植物中有某些植物及其活性成分被证明具
有抗肿瘤作用 [ 11, 12] ,如长白楤木中提取的几种二萜类
化合物 ,对肺癌 、宫颈癌 、肝癌均有明显的抑制作用 ,且
这种抑制作用与引起细胞周期停滞 ,促进细胞凋亡有
关[ 13-16] 。另外 ,黄毛楤木中提取的乌苏烷型五环三萜
类化合物可以使肝癌耐药细胞 R-HepG2的生长停留
在 G0/G1期 ,并通过下调热休克蛋白 105(HSP)和环
氧化酶 -2(COX-2)的表达促进其发生凋亡 [ 17] 。也
有学者对辽东楤木叶总皂苷的抗肿瘤作用进行研究发
现 ,总皂苷可以抑制 s-180荷瘤鼠 IL-2、TNF-α的
表达 ,增强 P53的表达。本实验对辽东楤木叶总皂苷
对卵巢癌 SKOV3细胞的抑制作用及其对线粒体凋亡
途径的影响进行探讨。
当细胞失去了赖以生存的生长因子或激素的支
持 ,或脱离了原来的生长环境 、或者由于 DNA损伤等
因素均可导致 Bad去磷酸化而活化 ,从而活化下游的
促凋亡因子 Bax,使线粒体释放细胞色素 C,而抗凋亡
成员 Bcl-2能与促凋亡成员相互作用而抑制促凋亡
成员的功能 ,进入胞浆的细胞色素 C与 Apaf-1、ADP/
dATP结合成复合物 ,称凋亡体 。
本实验通过 MTT法证实了 TALAS对 SKOV3的
抑制作用 ,并通过细胞核的染色观察 TALAS作用后细
胞核形态的变化 ,发现 TALAS可促使 SKOV3发生凋
亡。细胞凋亡的两条经典途径为:外源性死亡受体途
径及内源性线粒体途径 ,我们对线粒体途径进行针对性
的研究发现 , TALAS可抑制抗凋亡成员 Bcl-2的表达 ,
促进促凋亡基因 Bax的表达 ,升高细胞色素 C、Apaf-1
的表达 ,从而促使凋亡体的产生。TALAS是通过何种途
径激活线粒体凋亡途径还有待进一步的研究。
参考文献:
[ 1] 　P.Boyle, B.Levin, Eds.Worldcancerreport[ C] .InternationalA-
gencyforResearchonCancerFrance:2008.
[ 2] 　J.Permuth-Wey, T.A.Selers.Epidemiologyofovariancancer
[ J] .MethodsinMolecularBiology, 2009(472):413-437.
[ 3] 　A.Jemal, R.Siegel, E.Ward, etal.Cancerstatistics[ J] .Cancer
JournalforClinicians, 2008, 58(2):71-96.
[ 4] 　I.Vergote, C.G.Trope, F.Amant, etal.“EORTC-GCG/NCIC-
CTGrandomizedtrialcomparingprimarydebulkingsurgerywithneo-
adjuvantchemotherapyinstageIIC-IVovarian, fallopiantubeor
peritonealcancer(OVCA)[ A] .inProceedingsofthe12thBiennial
MeetingoftheInternationalGynecologicCancerSociety(IGCS08)
[ C] .Bangkok, Thailand:2008.
[ 5] 　EferthT, KahlS, PaulusK, etal.Phytochemistryandpharmacog-
enomicsofnaturalproductsderivedfromtraditionalChinesemedicine
andChinesemateriamedicawithactivityagainsttumorcels[ J] .Mol
CancerTher, 2008, 11(1):7-15.
[ 6] 　KonkimallaVB, EfferthT.Anti-cancernaturalproductlibraryfrom
traditionalchinesemedicine[ J] .CombChem HighThroughput
Screen, 2008, 12(1):9-16.
[ 7] 　Seok-JongSuha, Un-HoJin, etal.Biophysicsriterpenoidsapo-
nin, oleanolicacid3-O-b-D-glucopyranosyl(1fi3)-a-L-rh-
amnopyranosyl(1fi2)-a-L-arabinopyranoside(OA)fromAralia
elatainhibitsLPS-inducednitricoxideproductionbydown-regula-
tedNF-kBinraw 267 cels[ J] .ArchivesofBiochemistry, 2007
(467):227-233.
[ 8] 　ShugangXi, GuihuaZhou, XuexinZhang, etal.Protectiveefectof
totalaralosidesofAraliaelata(Miq)Seem(TASAES)againstdiabet-
iccardiomyopathyinratsduringtheearlystage, andpossiblemecha-
nisms[ J].ExperimentalandMolecularmedicine, 2009, 41(8):538-
547.
[ 9] 　JuHyeonLee, YoungWanHa, ChoonSikJeong, etal.Isolationand
TandemMassFragmentationsofanAnti-inflammatoryCompound
fromAraliaelata[J] .ExperimentalandMolecularmedicine, 2009, 32
(6):831-840.
[ 10] 吴勃岩 ,韩玉英 ,梁颖 ,等.龙牙楤木叶总皂苷抗肿瘤作用机理研
究 [ J].辽宁中医杂志 , 2010, 37(1):175-176.
[ 11] 尹丽颖 ,边晓燕 ,肖洪彬.辽东楤木叶总皂苷对荷瘤小鼠抑瘤作用
的实验研究 [ J].中医药信息 , 2010, 27(3):107-109.
[ 12] 王丽岩 ,肖洪彬 ,王鸣慧.辽东楤木叶总皂苷抗急性肝损伤的实验
研究 [ J].中医药信息 , 2009, 26(2):29-30.
[ 13] LeeDK, LimH, LeeCH, etal.HY253, anoveldecahydrofluorene
analog, fromAraliacontinentalis, inducescelcyclearestattheG
(1)phaseandcytochromec-mediatedapoptosisinhumanlung
cancerA549cels[ J] .JEthnopharmacol, 2010, 26(2):144-148.
[ 14] OhHL, Lim, Haeyoung, LimH, etal.HY253, anovelcompoundi-
solatedfromAraliacontinentalis, inducesapoptosisviacytochromec
-mediatedintrinsicpathwayinHeLacels[ J] .BioorgMedChem
Let, 2009, 19(3):797-799.
[ 15] OhHaLim, OhHLLim, Haeyoung, etal.HY251, anovelcelcy-
cleinhibitorisolatedfromAraliacontinentalis, inducesG1phasear-
restviap53-dependentpathwayinHeLacels[ J] .BioorgMed
ChemLet, 2009, 19(3):959-961.
[ 16] KwonTaeOh, KwonTO, JeongSeung-Il, etal.Continentalicacid
fromAraliacontinentalisinducesgrowthinhibitionandapoptosisin
HepG2cels[J].ArchPharmRes, 2008, 31(9):1172-1178.
[ 17] TianZe, TianZ, LinGeng, etal.Anti-hepatomaactivityandmech-
anismofursolicacidanditsderivativesisolatedfromAraliadecais-
neana[ J] .WorldJGastroenterol, 2006, 12(6):874-879.
·19·
2011年第 39卷第 1期
Vol.39, No.1, 2011 　　　　　　　　　
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