全 文 ：收稿日期:2007-05-23
作者简介:王 芬(1982-),女,江西人,厦门大学生命科学学院 04级
硕士研究生,主要从事啤酒酵母菌种选育研究工作。
*通讯作者:刘月英,教授,liuying6401@sina.com.
双亲灭活的原生质体融合株啤酒酵母DR9-2
的构建及其特性的研究
王 芬 1,由 媛 1,全 丽 2,陆香庆 2,曾 婷 1,戴玉聪 2,刘月英 1*
(1福建省 厦门大学生命科学学院,福建 361005;2福建省 英博雪津啤酒有限公司,莆田351111)
摘 要:啤酒酵母菌株 JW1-1发酵液中的双乙酰、总高级醇的含量较低,但发酵度较低,发酵液中的乙醛含量
较高;啤酒酵母菌株NW7-45发酵度较高,发酵液中的乙醛含量较低,但发酵液中的双乙酰、总高级醇的含量
较高。为了得到优良的菌株,以紫外线灭活的菌株 JW1-1原生质体和热灭活的菌株 NW7-45原生质体为亲
本进行融合。经三角瓶发酵筛选,得到较优良的融合株DR9-2和DR9-24。其中融合株DR9-2以12°Bx麦芽
汁为培养基,用500L的发酵罐在12℃下发酵,发酵 11d发酵液的发酵度为 69.5%,发酵液中的双乙酰、乙醛和
总高级醇的含量分别为 0.0124mg/L、7.70mg/L和 61.88mg/L。从融合株 DR9-2的主要发酵特性和啤酒口感
品评的结果表明,该菌株在啤酒酿造工业中具有应用前景。
关键词:啤酒酵母;原生质体融合;发酵特性;中试
中图分类号:TS262.5;TS261.1 文献标识码:B
运用原生质体融合技术构建优良啤酒酵母菌株的研究已
有一些报道[1,2]。但应用于原生质体融合的啤酒酵母菌株,都要
具有一定的遗传标记,以便作为融合株检出的依据。在双亲灭
活的原生质体融合法中,两个亲本的原生质体在融合前都被
失活,但它们失活的机制不同。根据“致死损伤互补”的机理,
双亲灭活的原生质体如果发生融合,将能在再生培养基上生
长形成融合新株。双亲灭活原生质体融合法不但可省去亲株
细胞的遗传标记,避免重组体失去亲本的优良性状,而且可以
用不含例如抗生素等抑制细胞生长的遗传标记物的培养基作
为融合子选择培养基,细胞生长较快,从而可提高筛选效率。
啤酒酵母菌株 JW1-1发酵液中的双乙酰、总高级醇的含
量较低,但发酵度较低,发酵液中的乙醛含量较高;而啤酒酵
母菌株 NW7-45发酵度较高,发酵液中的乙醛含量较低,但
发酵液中的双乙酰、总高级醇的含量较高。为了得到生产特性
优良的菌株,以紫外线灭活的菌株 JW1-1原生质体和热灭活
的菌株NW7-45原生质体为亲本进行融合。用发酵液的发酵
度,发酵液中的双乙酰、乙醛和总高级醇等的含量为筛选指
标,经筛选获得一株优良的融合株DR9-2。
1材料与方法
1.1菌株 啤酒酵母菌株 JW1-1和啤酒酵母菌株 NW7-45均
为本课题组诱变选育的菌株。
1.2固体培养基 麦芽汁固体培养基:100mL6°Bx麦芽汁,琼
脂 2g;固体完全培养基(YEPD):葡萄糖 2%,蛋白胨 2%,酵母
膏 1%,琼脂 2%,pH自然;高渗完全培养基(YEPDS):YEPD
中添加17%蔗糖。
1.3液体培养基 12或12.5°Bx麦芽汁。
1.4原生质体的制备与再生:参考文献[2]。
1.5原生质体的灭活
1.5.1热灭活 取原生质体悬液,在 55℃下作用不同时间,稀
释涂布YEPDS平板,同时以未经热处理的原生质体悬液作对
照,28℃倒置培养5d,计算原生质体的存活率
1.5.2紫外线灭活 取原生质体悬液,置于紫外灯(功率:
20W;灯距:20cm)下照射不同时间,稀释涂布YEPDS平板,同
时以未经紫外线处理的原生质体悬液作对照,28℃倒置培养
5d,计算原生质体的存活率。
1.6原生质体融合:参考文献[2];融合条件为 PEG(MW6000)浓
度 35%、CaCl2浓度 10mmol/L、作用时间 20min、作用温度
35℃;融合后涂布于YEPDS培养基,28℃倒置培养。
1.7融合株的筛选:按文献[2]的方法进行三角瓶低温发酵,以
发酵液的真正发酵度以及发酵液中的双乙酰、乙醛和总高级
醇的含量为筛选指标。
1.8500L 罐发酵:以 12°Bx麦芽汁为培养基,500L 发酵罐
装400L培养基,按5%接种量接入菌种液 20L在 12℃下发酵
11d,发酵期间取样跟踪测定发酵液的发酵度和双乙酰、乙醛
和高级醇类等挥发性物质的含量。
1.9测定方法
发酵度的测定:发酵终止,用滤纸过滤发酵液除菌体,滤液
用SCABA5610啤酒自动分析仪测定[4];双乙酰测定:按文献[4]的
方法测定和计算;发酵液中挥发性物质含量的测定:用 Agi
lent6890气相色谱仪测定。
1.10融合子生物学特性分析
融合子异核体检测:在显微镜下观察挑出的融合子是否
文章编号:1002-8110(2007)05-0072-04
第34卷 第5期
2007年 9月
酿 酒
LIQUOR MAKING
Vol.34.№.5
Sep.,2007
· 72·
含有双核,若含有双核则为异核体;细胞的大小、体积、生物量
和细胞DNA的测定:按文献[5]。
2结果与讨论
2.1原生质体的制备和再生
原生质体的形成和再生主要受蜗牛酶的浓度、作用温度
和作用时间等因素的影响,因此参考文献[2]的原生质体制备与
再生的方法和条件,对菌株 NW7-45和 JW1-1的原生质体形
成与再生就蜗牛酶浓度、作用时间进行试验,结果见表1。
表1菌株JW1-1和NW7-45的原生质体形成与再生试验结果
从表 1可见,菌株 JW1-1在作用时间 30min和作用温度
30℃的条件下,原生质体的形成率与酶浓度成正比,但再生率
下降。综合考虑原生质体的形成率和再生率,制备菌株
JW1-1原生质体时,选择蜗牛酶浓度1%、作用时间30min、温
度 30℃。菌株 NW7-45在 1%酶浓度下,原生质体的形成率
随着酶作用时间的延长而提高,但再生率下降。综合考虑原生
质体的形成率和再生率,制备菌株 NW7-45原生质体时,选
择蜗牛酶浓度1%、作用时间30min、温度30℃。
2.2原生质体的灭活
结果表明,紫外灯照射 8min,菌株 JW1-1原生质体的灭
活率为100%,试验选择紫外灯下照射8min以确保JW1-1原
生质体及其完整细胞完全灭活;当 NW7-45的原生质体悬浮
液在55℃水浴中处理12min时,其灭活率为 100%,试验选择
55℃下处理 12min,以确保 NW7-45原生质体及其完整细胞
全部灭活。
2.3原生质体的融合及融合子的检出
将紫外线灭活的菌株 JW1-1原生质体和热灭活的菌株
NW7-45原生质体,按“1.6”的条件进行融合,结果原生质体
的融合率为3.33×10-4。
温度灭活原生质体的作用主要在细胞质中,使核糖体或
核糖体 RNA受到损伤[1],结果使细胞内的功能蛋白或酶蛋白
的合成受到影响或使其变性失活,产生致死作用[1]。紫外线对
原生质体造成的致死损伤主要集中在DNA上,而且在不同的
原生质体细胞中作用位置可能存在很大差别[1]。由于这两种灭
活方式对细胞致死损伤的机制不同,根据致死损伤互补的机
理,这两种方式灭活的原生质体有可能融合互补再生。因此将
紫外线灭活的菌株 JW1-1原生质体和热灭活的 菌 株
NW7-45原生质体融合物用PBS溶液稀释后涂布于麦芽汁固
体培养基上,在平板上长出的菌落可认为是两亲株原生质体
融合后基因互补的融合子。试验从平板上挑出生长良好的单
菌落 38个,菌株编号为DR9-1、DR9-2、⋯⋯DR9-38。
2.4融合子的筛选
啤酒酿造酵母菌株发酵度的高低,影响啤酒的口感和保
存期,优良菌株的真正发酵度应控制在65%~70%的范围[6]。啤
酒酵母发酵麦芽汁时利用糖释放 CO2,使发酵液减重,因此可
根据发酵液的减重程度衡量菌株的发酵度。双乙酰是影响啤
酒风味的重要物质,适量的双乙酰可以赋予啤酒特殊风味,但
当双乙酰含量超过阈值(0.1mg/L)会给啤酒带来馊饭味[3]。因
此,在融合子平板上挑出的38个单菌落连续传4代后用三角
瓶发酵,以发酵液的减重量和发酵液的双乙酰含量为初筛的
指标。结果得到 9株发酵液的减重量较多、双乙酰含量较低的
菌株。
啤酒中的乙醛含量超过阈值 10mg/L 时,给人以不愉快
的粗糙苦味感觉,含量过高,有一种辛辣的腐烂青草味[7]。啤酒
中的高级醇主要包括甲醇、正丙醇、异丁醇和异戊醇等,适量
高级醇的存在,能使酒体丰满圆润、香气协调,但含量过高,则
给人以腐臭感和刺激气味,饮酒不多时就会“上头”,引起头痛,
下面啤酒总高级醇的含量以60～100mg/L较适宜[8]。因此,复
筛时除了测定发酵液中的双乙酰含量外,还要测定真正发酵
度和发酵液中的乙醛和总高级醇等物质的含量。表 2列出部
分菌株的复筛结果。
从表 2可见,融合子 DR9-2和 DR9-24的主要发酵特性
较优良。融合子 DR9-2的发酵度较高(68.7%);发酵液中的
双乙酰含量最低,比亲株 NW7-45和 JW1-1的分别低 40.4%
和 25.0%,发酵液中的总高级醇含量比亲株 NW7-45和
JW1-1分别低16.2%和6.3%;虽然发酵液中乙醛的含量比两
亲株的高,但低于其口味阈值 10mg/L。融合子 DR9-24的发
酵度与亲株 NW7-45相同(69.8%),发酵液中双乙酰介于两
亲株之间,发酵液中的乙醛含量最低,比亲株 NW7-45和
JW1-1的分别低12.9%和22.9%。
表2 融合子的筛选结果
注:12.5°麦芽汁
2.5融合子及其亲本的生物学特性测定
2.5.1异核体的检测
按照异核体检测的方法,对融合子 DR9-2和 DR9-24进
行显微镜观察,均未发现异核体的存在。
2.5.2细胞体积、生物量和细胞DNA含量的测定
结果表明,融合子 DR9-2和 DR9-24的细胞体积基本等
菌株
JW1-1
NW7-45
酶浓/%
1.0
1.5
2.0
1.0
1.0
1.0
温度/℃
30
30
30
30
30
30
时间/min
30
30
30
15
30
45
形成率/%
70.7
73.3
83.6
88.6
91.3
93.3
再生率/%
22.3
16.6
13.7
10.6
10.3
8.8
形成率×再生率
1576.61
1216.78
1145.32
939.16
940.39
821.04
菌株
JW1-1
NW7-45
DR9-2
DR9-5
DR9-6
DR9-12
DR9-17
DR9-19
DR9-22
DR9-23
DR9-24
发酵度
/%
66.7
69.8
68.7
67.1
68.6
70.2
67.7
69.1
67.5
69.1
69.8
双乙酰
/mg·L-1
0.0892
0.1122
0.0669
0.0912
0.0971
0.0966
0.0919
0.1059
0.1348
0.0915
0.0928
乙醛
/mg·L-1
6.24
5.52
7.22
8.78
5.85
5.83
7.10
7.78
11.40
6.41
4.81
总高级醇
mg·L-1
79.28
88.62
74.29
76.38
85.36
90.93
78.27
84.78
73.44
85.97
90.26
第五期 2007酿 酒
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双
乙
酰
/
m
g
·
L-
1
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0 2 4 6 8 10 12
时间/d
70
60
50
40
30
20
10质
量
体
积
分
数
m
g·
L-
1
0 2 4 5 8 10 12
时间/d发
酵
度
/
%
70
60
50
40
30
20
10
0 2 4 6 8 10 12
时间/d
王芬,等:双亲灭活的原生质体融合株啤酒酵母DR9- 2的构建及其特性的研究第五期 2007
Construction of the Fine Brewers Yeast Strains DR9-2 by
Fusion of Two Inactivated Parents Protoplast and Study of its
Fermentation Characters
WANG Fen1,YOU Yuan1,QUANLi2, UXiang-qing,ZENGTing1,DAI Yu-cong2,LIUYue-ying1
(1.SchoolofLifeSciences,XiamenUniversity,Xiamen361005,China;2.InBevSedrinBreweryCo.Ltd.,Putian351111,China)
于两亲株 JW1-1和 NW7-45的细胞体积之和;融合子
DR9-2和 DR9-24的生物量高于两亲株,但是相差不大;融
合子 DR9-2和 DR9-2的 DNA含量明显大于亲株 NW7-45
或 JW1-1的 DNA含量,但略小于两亲株的 DNA含量之和。
因此,菌株DR9-2和DR9-24可认为是真正的融合株。
2.6融合株DR9- 2的500L罐发酵特性
综合比较融合株 DR9-2和 DR9-24的主要发酵特性后,
进一步考察融合株DR9-2的工业应用价值。以12°Bx麦芽汁
作为融合株DR9-2发酵培养基,用500L发酵罐在 12℃下发
酵,发酵期间取样测定发酵液的发酵度和双乙酰、乙醛、总高
级醇和总酯等挥发性物质的含量。结果如图1、图2和图3所
示。
图1菌株DR9-2在500L罐发酵过程中发酵度的变化
从图 1可见,发酵 8d,融合株 DR9-2的发酵度为
68.0%,发酵至 11d为 69.5%,接近于优良菌株发酵度 65%
～70%范围的上限。
图2融合株DR9-2在500L罐发酵过程中双乙酰含量的变化
图2的结果表明,融合株DR9-2发酵 24h发酵液的双乙
酰含量达到峰值(0.1086mg/L) ,之后快速下降,发酵 6d,融合
株 DR9-2发酵液双乙酰含量为 0.0397mg/L,发酵 11d,融合
株 DR9-2发酵液双乙酰含量为 0.0124mg/L,远低于其阈值
0.10mg/L。
融合株 DR9-2发酵 24h发酵液的乙醛含量达到峰值
(21.69mg/L) ,之后逐渐下降,发酵 11d,融合株 DR9-2发酵
液中的乙醛含量为 7.70mg/L(图 3) ,低于其口味阈值 10
mg/L;在发酵的前 5 d,融合株 DR9-2发酵液中的总高级醇
含量随着发酵时间的延长而快速升高,发酵 5d,发酵液中的
总高级醇含量为 72.35 mg/L,之后趋于稳定,发酵 11d,发酵
液中的总高级醇含量为 61.88mg/L(图 3) ,远低于其阈值的
上限(100mg/L)。
图3融合株DR9-2在500L罐发酵过程中乙醛和
总高级醇的含量变化
2.7融合株DR9- 2啤酒的风味
融合株 DR9-2生产的啤酒经评酒师品评认为啤酒淡爽
柔和略带酯香味。可能由于总高级醇含量较低,因此构成啤酒
风味较独特。
融合株 DR9-2具有发酵度高,发酵液中的双乙酰和总高
级醇含量低以及酒液具有淡爽柔和略带酯香味的特点,虽然
发酵液中的乙醛含量较高(7.70mg/L) ,但低于其口味阈值 10
mg/L,该菌株具有工业应用前景。
[参考文献]
[1]罗立新.细胞融合技术与应用[M].北京:化学工业出版社,2004.
[2]蔡车国,张秀丽,刘月英,等.优良啤酒酵母原生质体融合株 GR5
的构建及其发酵特性[J].工业微生物,2006,36(1) :34-38.
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图书馆,2005.
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与发酵工业,2002,10(28):25-28.
[8]武宝忠,申华.浅析啤酒发酵过程中高级醇的产生及控制[J ].酿酒,
2003,3(30):66-68.
· 74·
Abstract:SacchararomycescerevisiaeJW1-1wasastrainwiththerelativelylowcontentofdiacetylandtotalhigheralcoholsbutrelatively
highcontentofacetaldehydeinthefermentedliquidandrelativelylowfermenteddegree,whileSacchararomycescerevisiaeNW7-45wasa
strainwithrelativelyhighfermenteddegreeandrelativelylowcontentofacetaldehydebutrelativelyhighcontentofdiacetylandtotalhigher
alcoholsinthefermentedliquid..Inordertoconstructthefinebrewersyeaststrains,thefusionofUV-inactivatedstrainJW1-1protoplastand
heat-inactivatedstrainNW7-45protoplastwascariedout.ThefinefusantsDR9-2wasobtainedafterselectingbyflaskfermentation.The
contentofdiacetyl,acetaldehyde,totalhighalcoholsofDR9-2inthefermentedliquidwere0.0124mg/L,7.70mg/Land61.88mg/L,respectively,
andthefermentationdegreewas69.5%in500Lfermentorusing12°Bxwortasthemediumat12℃ for11days.Themainfermentative
propertyandthesensoryevaluationofthebeerofDR9-2indicatedthatstrainDR9-2isofwelappliedprospectonthebeerbrewing.
Keywords:brewersyeast,protoplastfusion,fermentativecharacter,pilotscale
调制鸡尾酒常用的几种酒介绍
梁 琳
(黑龙江旅游职业技术学院,哈尔滨 15000)
摘 要:介绍了鸡尾酒的概念及调制鸡尾酒的常用酒类的名称、主要特点、产地。
关键词:鸡尾酒;调制用酒
中图分类号:TS972.19 文献标识码:E
鸡尾酒是由两种或两种以上的酒或由酒渗入果汁配合而
成的一种饮品。具体他说鸡尾酒是以 Rum、Whisky或其它烈
酒、葡萄酒为酒基,再配以其它辅料,如果汁、蛋清、苦精(Biter)、
糖等以搅拌或摇晃法调制而成的,最后再饰以柠檬片或薄荷
叶。鸡尾酒非常讲究色、香、味、形的兼备,故又称艺术酒。鸡尾
酒的历史算来不过一个多世纪,风行世界各国也不过几十年
的光景。鸡尾酒大多以极名贵的Cognac(干邑)、威士忌、葡萄
酒等为主,它开辟了酒的新的色、香、味的领域,它还含有只能
意会不能言传的意境,饮用鸡尾酒是一种艺术享受。实践证
明,鸡尾酒以它特有的魅力赢得了人们的赞誉,各种配方层出
不穷,成为宴席上不可缺少功饮料。鸡尾酒自身的世界性传播
可追溯到 100多年前的美国,当时美国的制冰业正向工业化
迈进,这无疑为鸡尾酒的迅速发展奠定了基础,使得美国成为
当时鸡尾酒最为盛行的一个国家,那里的调酒师的技艺也是
最为高超和美妙的;后来,美国的禁酒法造成了名酒吧师
(Bartender)的外流:他们到了法国或英国后,英雄有用武之
地,亦促成了欧洲乃至世界鸡尾酒黄金时代的到来。
随着我国经济的快速发展和人们生活水平的不断提高,
近几年我国的鸡尾酒的消费量有了快速增长,尤其是在经济
发达的大城市,如北京、上海、广州、深圳等,鸡尾酒已是许多
中年白领的最爱。改革开放的加快和对外开放的加强必将促
进我国鸡尾酒市场的快速壮大。
调制鸡尾酒一般常用的都是混合酒,就是在蒸馏酒和酿
造酒中放一些果实、香草香料、药材、花瓣等一起蒸馏浸渍,而
形成具有特殊风味的酒,由于混合酒多掺有蜂蜜等糖分的配
料,味道香甜、柔软,故也可称之为香甜酒。如薄荷酒、香橙酒、
香蕉酒、杏仁白兰地以及中国的药酒、补酒等。其酒精体积分
数一般在 20%~30%左右,但有些高达60%。
1白兰地 (BRANDY)
白兰地是一种烈性酒,由葡萄或水果发酵后蒸馏而成的。
但必须放在木桶内经过相当时间的陈酿,原料中有葡萄、苹
果、李子和一种黑野樱桃。白兰地以法国干邑区的干邑白兰地
(COGNACBRANDY)最为出名。可以说所有干邑都是白兰地,
但所有的白兰地并不都是干邑。干邑地区著名的白兰地有
REMYMARTINX.O.——(V.S.O.P)人 头 马 、COURVOISI
ER——V.S.O.P拿破仑、F.O.V长颈、MARTELL——CORDON
BLUE蓝带马爹利等均为世界名酒。仅次于干邑的白兰地是
雅马邑(ARMAGNAC)也是法国生产的。在法国为保证两地白
兰地的品质,另立法规定葡萄的品种与蒸馏法。其他生产白兰
地的国家有西班牙、葡萄牙、美国、秘鲁、德国、南非、澳洲、希
腊、以色列和意大利等国。
2威士忌 (VHISKY)
所有的威士忌制造的主要程序为发芽、搅碎、发酵、蒸馏、
陈酿和混合,其一般含酒精度体积分数37%~43%,约 3~4年,
由原来透明无色转化为琥珀色。威士忌主要生产国为苏格兰、
爱尔兰、美国、加拿大,即是下列4种威十忌:
2.1苏格兰威士忌 (SCOTCH WHISKY)产于苏格兰,用大麦
芽为原料,经过发酵、蒸馏后,再装人酒槽贮存待熟,它的特性
是大麦芽以泥炭熏过,使熏过的清爽香味留在瓶内,故酒内有
第34卷 第5期
2007年 9月
酿 酒
LIQUOR MAKING
Vol.34.№.5
Sep.,2007
文章编号:1002-8110(2007)05-0075-02
收稿日期:2007-04-10
作者简介:梁 琳(1963-),女,黑龙江人,专科,实验师。
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