全 文 ：收稿日期:2008-07-27; 修订日期:2008-12-30
基金项目:广西教育厅自然科学基金项目(No.200710MS014)
作者简介:林 兴(1975-),男(壮族),广西南宁人 ,现任广西医科大学讲
师 ,硕士学位 ,主要从事生化药理学 、心血管药理学研究工作.
＊通讯作者简介:黄仁彬(1955-), 男(汉族),广西南宁人 , 现任广西医科
大学教授 ,博士生导师 ,主要从事心血管药理学 、生化药理学工作.
六月青含药血清
对 HepG2 .2 .15细胞系 HBsAg与 HBeAg表达的影响
林 兴 1 ,黄权芳2 ,张士军 1 ,刘 曦1 ,黄仁彬 1＊
(1.广西医科大学 ,广西 南宁 530021; 2.广西中医学院第一附属医院 ,广西 南宁 530021)
摘要:目的 观察六月青(Liuyueqing, LYQ)含药血清的体外抗乙型肝炎病毒的作用。方法 以 MTT法检测药物在体外对
HepG2.2.15细胞的生长抑制作用 ,采用酶联免疫法(ELISA法)检测 HepG2.2.15细胞上清液中 HBsAg、HBeAg的滴度。
结果 LYQ含药血清对 HepG2.2.15细胞 50%生长抑制率的给药剂量为 11.56 g· (kg· d)-1;而对 HepG2.2.15细胞分
泌 HBsAg50%生长抑制率的给药剂量为 0.178 g· (kg· d)-1 , 其治疗指数(TI)为 64.94;另外 , LYQ含药血清对 HBeAg
抑制作用不明显。结论 LYQ含药血清在体外有显著的抗 HBV的作用 , 且毒性较低。
关键词:六月青含药血清; HepG2.2.15细胞; HBsAg; HBeAg
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2009)07-1603-02
TheInhibitoryEffectoftheSerumContainingLiuyueqingontheExpressionofHBsAg
andHBeAgintheHepG2.2.15 Cells
LINXing1 , HUANGQuan-fang2 , ZHANGShi-jun1 , LIUXi1 , HUANGRen-bin1＊
(1.GuangxiMedicalUniversity, Nanning530021, China;2.TheFirstAfiliatedHospitalofGuangxiTradition-
alChineseMedicalUniversity, Nanning530021, China)
Abstract:ObjectiveToobservetheeffectoftheserumcontainingLiuyueqing(LYQ)ontheexpressionofHBsAgandHBeAg
inHepG2.2.15cells.MethodsThetoxicityoftheserumcontainingLYQonHepG2.2.15 celswasdetectedbymeansofMTT.
TheinhibitoryeffectsoftheserumcontainingLYQontheexcreationofHBsAgandHBeAginHePG2.2.15cellswereevaluated
withmethodofenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).ResultsThedosewhichtheserumcontainingLYQcouldinhibit
50% HepG2.2.15 celswas11.56g.(kg.d)-1.ThedosewhichtheserumcontainingLYQcouldinhibit50% HBsAgwas0.
178g.(kg.d)-1, anditstreatmentindex(TI)onHBsAgwas64.94.TheinhibitoryefectoftheserumcontainingLYQon
HBeAgwasnotobvious.ConclusionTheserumcontainingLYQcaninhibitHBVsignificantlyinvitro, anditisalowtoxicdrug.
Keywords:SerumcontainingLiuyueqing; HepG2.2.15cell; HBsAg; HBeAg
六月青(Liuyueqing, LYQ)系爵床科(Acanthaceae)植物肖鸡
笼(顶花马兰)Taraphochlamysaffinis(Griff)Bremekhu(Strobi-
lanthesafinis(Grif)Y.C.Tang)的干燥地上部分 [ 1] 。六月青是
复方六月雪(CLYX)主要成分之一 , 本课题组前期研究表明 ,
CLYX具有明显地抗 HBV[ 2, 3] 和保护急性化学性肝损伤的作
用 [ 4] 。本研究以转染有 HBVDNA的 HepG2.2.15为模型 , 采用
中药血清药理学方法 ,观察 LYQ含药血清对 HepG2.2.15细胞系
HBsAg与 HBeAg表达的影响 , 并初步探讨其作用机制 , 为筛选出
复方六月雪中抗 HBV主要活性部位提供实验依据。
1 材料
HBsAg(乙型肝炎表面抗原)和 HBeAg(乙型肝炎 E抗原)酶
联免疫检测试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司);HepG2.2.15
细胞株 , 购自北京医科大学第一附属医院病毒研究所 ,本室自行
传代 , 定期用 G418(一种筛选抗生素)筛选;六月青水提物 , 由广
西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心自行提取。
阿昔洛韦(AciclovirACV):湖南迪诺制药有限公司医药工业研究
所产品 , 批号:20070518;RPMI1640培养基(美国 Gibco公司 ,批
号 13200-035);小牛血清(美国 Gibco公司 , 批号 16000-036);
G418(美国 Sigma公司 ,批号 108321-42)。
2 方法
2.1 LYQ含药血清的制备 3月龄 Wistar大鼠 70只 , 随机分为
7组 , 每组 10只。空白对照组:予等量的生理盐水;阳性对照组:
ACV1×10-4g· (kg· d)-1;LYQ1组:13.2 g· (kg· d)-1;LYQ2
组:6.6 g· (kg· d)-1;LYQ3组:3.3 g· (kg· d)-1;LYQ4组:
1.7 g· (kg· d)-1;LYQ5组:0.9 g· (kg· d)-1。 各组动物在同
样条件下饲养 ,每日早晚各 1次空腹灌胃给药 , 连续给药 7d。于
末次灌胃(灌胃前禁食不禁水 12 h)后 2 h, 乙醚吸入麻醉 , 腹主
动脉抽血 , 低速离心分离血清 , 并将每组动物的血清混合。 经
56℃ 30 min灭活处理 ,经 0.45μm的微孔滤膜 , 再经 0.22μm微
孔滤膜过滤除菌后 ,置 -20℃冰箱保存备用。
2.2 LYQ含药血清的细胞毒性实验(MTT法)取 HepG2.2.15
细胞 1瓶 ,用胰酶消化后制备成单细胞悬液 , 计数后调整细胞浓
度至 2×104 cel· ml-1 , 加入 96孔培养板中(每孔 100 μl), 置
CO
2
孵箱(37℃, 5%CO
2
)中培养 24 h后 , 细胞贴壁且生长良好 ,
吸除全部培养液 ,加入上述含药血清 100 μl, 每个浓度设 6个复
孔。连续培养 72h,培养结束前 4h,每孔加入 MTT10 μl, 于 CO2
孵箱中继续培养。 4 h后小心吸弃上清液后 , 每孔加 DMSO100
μl,微量振荡器振荡 5 min, 使结晶紫完全溶解。自动酶标仪(检
测波长 570 nm, 参考波长 630 nm)读取各孔 OD值 , 记录结果。
按 Reed-Muench法计算半数细胞毒浓度(TC50)和最大无毒浓
度(TC0)。
2.3 ELISA法定量检测 HBsAg和 HBeAg将 2×104 cell· ml-1
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.7 时珍国医国药 2009年第 20卷第 7期
的细胞悬液加 24孔细胞培养板 , 每孔 0.5 ml,置 CO2孵箱(37℃
5%CO2)中培养 24 h后 ,细胞贴壁且生长良好 , 除去全部培养液 ,
根据细胞毒性试验结果 ,以 1.7 g· (kg· d)-1给药剂量组的含药
血清为第 1个浓度 , 再用完全培养液系列 2倍稀释成 4个浓度的
应用液 , 即相当于 5个给药剂量级别:1.7, 0.85, 0.425, 0.213,
0.107g· (kg· d)-1的含药血清 ,每孔加入上述各级别的含药血
清应用液 0.5 ml,每个浓度设 3个复孔。连续培养 72 h后 ,分别
吸出上清液置于 1.5 ml灭菌 Eppendorf管中 , -20℃保存 , 统一
待检。
采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测 , 结果以抑制率表示 ,
药物对抗原的抑制百分率(%)=[ 1-实验孔抗原 OD值 /对照
孔抗原 OD值 ] ×100%, 并按 Reed-Muench法计算半数抑制浓
度(IC50)。
2.4 药效评价 一般用治疗指数(TI)来评价药物的临床应用前
景。 TI=TC
50
/IC
50
, TI>2为药物有效低毒 , 1
2.5 统计学处理 数据以 x±s表示 , 统计学采用 SPSS11.5软
件 , 配对 t检验。
3 结果
3.1 药物对细胞的毒性实验 各含药血清加于单层 HepG
2.2.15细胞上 ,连续培养 72 h后 , 观察细胞生长形态 , 检测有无
病变。结果发现 , 除了给药剂量为 13.2 g· (kg· d)-1组的含药
血清对细胞生长抑制率大于 50%外 , 其余各组的抑制率均小于
50%;以 MTT法测定细胞的活力 , 按照 Reed-Muench法计算得
出:TC
0
=1.65g· (kg· d)-1 , TC
50
=11.56 g· (kg· d)-1 , 即当
LYQ给药剂量≤1.65 g· (kg· d)-1时 , 其含药血清对 HepG
2.2.15细胞没有毒性。结果见表 1。
表 1 LYQ对 HepG2.2.15的生长抑制作用( x±s)
组别 剂量 C/g· (kg· d)-1 OD570 抑制率(%)
空白对照 - 0.088±0.012 -
细胞对照 - 2.315±0.438 -
ACV 1×10-4 1.029±0.214＊ 57.75
LYQ 13.2 1.064±0.527 56.17
6.6 1.581±0.573 32.96
3.3 2.172±0.689 6.42
1.7 2.381±0.516 -2.96
0.9 2.323±0.741 -0.36
与细胞对照组比较 , ＊P<0.05;n=6
3.2 病毒抗原抑制试验 HepG2.2.15在 24孔培养板上生长至
单层 , 加入不同稀释倍数的 LYQ含药血清 , 同时设空白对照组和
细胞对照组 , 培养 72h, 分别取上清液测定 HBsAg和 HBeAg,并与
细胞对照组比较 , 计算抑制率 、IC50以及 TI。
实验结果表明 , 给药剂量相当于 0.213 ～ 1.7 g· (kg· d)-1
的 LYQ含药血清对 HBsAg的抑制率均高于 50%,与细胞对照组
比较均有 P<0.05,其抑制作用呈现剂量依赖性 , 经计算 , 对 HB-
sAg半数有效给药剂量 IC50 =0.178 g· (kg· d)-1 , 治疗指数
TI=64.94。而对于 HBeAg, LYQ在所选剂量范围内对 HepG
2.2.15细胞分泌 HBeAg的抑制率均低于 50%,抑制作用不明显。
结果见表 2。
4 讨论
复方六月雪(CLYX)是通过长时期的民间临床观察而拟定
的治疗急慢性乙型肝炎和肝硬化的验方 ,主要由广西民间草药六
月青 、白花蛇舌草 、栀子花根等组成 , 本课题组前期大量的实验研
究表明 , 该方可有效地抑制鸭乙型肝炎病毒 DNA和 HepG2.2.15
细胞 HBVDNA的复制 [ 2 , 5 , 6];无毒浓度的 CLYX在 HepG2.2.15
细胞培养中可有效地抑制细胞 HBVDNA的复制及 HBsAg(乙型
肝炎表面抗原)和 HBeAg(乙型肝炎 E抗原)的分泌 [ 3, 7];此外 ,
CLYX对 CCl4 , AP, D-Gal所致小鼠急性化学性肝损伤均有明显
的保护作用 ,并由此推测其保肝作用可能与诱导肝药酶有关 [ 4] 。
中药复方成分非常复杂 ,其组方配伍多数是以某一味药为主
其余为辅 ,诸药发挥协同治疗作用。为了能更好地保证 CLYX疗
效稳定性 ,本研究对该方中的六月青进行了抗 HBV药效学研究 ,
旨在筛选出该方有效活性部位 ,进而为下一步分离纯化有效化学
成分 , 建立处方质控标准提供实验依据。
表 2 LYQ对抗原的抑制作用( x±s)
组别 剂量C/g· (kg· d)-1
HBsAg
OD570 抑制率(%)
HBeAg
OD570 抑制率(%)
空白对照 - 0.037±0.011 - 0.047±0.021 -
细胞对照 - 0.341±0.065 - 1.969±0.312 -
ACV 1×10-4 0.133±0.042＊ 82.21 0.923±0.243 54.42
LYQ 1.7 0.158±0.047＊ 72.33 1.085±0.322＊ 45.99
0.85 0.162±0.049＊ 70.75 1.121±0.621 44.12
0.425 0.179±0.054＊ 64.03 1.238±0.571 38.03
0.213 0.201±0.058＊ 55.34 1.317±0.519 33.92
0.107 0.237±0.085 41.11 1.402±0.417 29.50
与细胞对照组比较 , ＊P<0.05;n=3
本实验以 HepG2.2.15细胞株作为对象 ,首先观察不同给药
剂量的 LYQ含药血清对 HepG2.2.15细胞的毒性作用 , 以 MTT
法测定细胞的活力 ,按照 Reed-Muench法计算得出:TC0 =1.65
g· (kg· d)-1 , TC50 =11.56 g· (kg· d)-1 ,提示 LYQ给药剂量
≤1.65 g· (kg· d)-1时 , 其含药血清对 HepG2.2.15细胞没有
毒性。
而对抗原抑制作用的实验发现 ,药物作用 72 h后 , 给药剂量
相当于 0.213 ～ 1.7 g· (kg· d)-1的 LYQ含药血清对 HBsAg的
抑制率在均高于 50%, 提示 LYQ在体外具有显著的抑制 HepG
2.2.15细胞分泌 HBsAg的作用(与细胞对照组比较 P<0.05),
且对 HBsAg的抑制作用呈现剂量依赖性 , 经计算 ,对 HBsAg半数
有效给药剂量 IC50 =0.178g· (kg· d)-1 ,治疗指数 TI=64.94。
另外 , LYQ对 HepG2.2.15细胞分泌 HBeAg的抑制率在所选剂
量范围内均低于 50%,抑制作用不明显。
本实验初步表明 LYQ含药血清体外有明显的抗 HBV的作
用 , 且毒性较低 , 并据此认为六月青应是复方六月雪中主要活性
部位之一 ,值得进一步研究。
参考文献:
[ 1 ] 林 兴 ,黄权芳 ,李 江 ,等.广西民间药六月青的性状与显微鉴定
[ J] .中药材 , 2005, 28(7):541.
[ 2 ] 张士军 ,林 军 ,蒋伟哲.等.复方六月雪对鸭乙型肝炎病毒 DNA
的抑制作用 [ J] .中药材 , 2007, 30(2):191.
[ 3 ] 杨霞芳 ,张士军 ,黄春喜.等.复方六月雪体外抗 HBV的实验研究
[ J] .内科 , 2007, 2(3):317.
[ 4 ] 苏洁寒 ,荣延平 ,蒋伟哲 ,等.复方六月雪对急性化学性肝损伤的保
护作用 [ J] .广西医科大学学报 , 2003, 20(4):497.
[ 5 ] 张士军 , 焦 杨 ,林 兴 , 等.复方六月雪对 HepG2.2.15细胞
HBVDNA的抑制作用 [ J].中药药理与临床 , 2007, 23(1):59.
[ 6 ] 张士军 ,林 军 ,焦 杨 , 等.复方六月雪含药血清对 HepG2.2.15
细胞 HBVDNA的抑制作用 [ J] .中药材 , 2006, 29(12):1338.
[ 7 ] 张士军 ,黄春喜 ,谢海源 ,等.复方六月雪对 HepG2.2.15细胞 HB-
sAg和 HBeAg的抑制作用 [ J] .中国医院药学杂志 , 2007, 27
(6):715.
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 7期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.7