全 文 ：鼠 ELISAIL-2 、IFN-γ试剂盒使用说明操作 ,测定小
鼠血清中 IL-2 、IFN-γ的含量 ,结果见表 2。
表 2 复方人参皂苷胶囊对 IL-2、IFN-γ的影响(n=12)
Tab 2 Effects of compound ginsenoside capsule on IL-2 、
IFN-γlevels in se rum(n=12)
组 IL-2/ pg·L-1 IFN-γ/ pg·L -1
对照组 856.3±170.2 304.9±24.1
模型组 490.3±149.1 160.5±33.1
A 569.7±142.6 218.5±41.8b
B 647.0±157.3a 191.5±43.2
C 701.8±166.0b 273.0±38.9b
注:与环磷酰胺组相比 , aP <0.05 , bP <0.01
在测定 IL-2 、IFN-γ的试验中 ,可见复方人参皂
苷胶囊可增加环磷酰胺小鼠血清 IL-2 、IFN-γ的含
量 ,增加幅度比其余 2组大。
3 讨论
体液免疫效应是由 B细胞通过对抗原的识别 、
活化 、增殖 ,最后分化成浆细胞并分泌抗体来实现
的。血清中溶血素含量的高低是衡量体液免疫的重
要指标。本试验用鸡红细胞免疫小鼠 ,使小鼠溶血
素水平升高 ,取一定量的小鼠血清与鸡红细胞混合 ,
在补体(豚鼠血清)参与下 ,便产生溶血现象 ,释放出
血红蛋白 ,通过光密度值可反映出血红蛋白含量的
变化 ,进而反映小鼠产生溶血素的量的变化 ,即血清
溶血素含量升高 ,也就是抗体含量升高 ,表明复方人
参皂苷胶囊有促进 B 细胞分泌抗体的功能 。从而
提高机体体液免疫功能。
本试验结果表明灌服复方人参皂苷胶囊组光密
度值与环磷酰胺组相比显著提高 ,即血清溶血素含
量升高 ,组间差异达到极显著水平(P <0.01),从而
证明复方人参皂苷胶囊对小鼠体液免疫功能具有显
著促进作用。
试验中发现 ,使用保存过的鸡血进行测定 ,光密
度值偏大 ,而使用新鲜鸡血进行测定 ,光密度值就偏
小 ,但是每次试验的趋势不变 ,因此可以在每次试验
结果中进行比较。试验中的发酵虫草菌丝体组即为
阳性对照组。
由于小鼠存在较大的个体差异 , ♀♂鼠的差异
也很大 ,因此我们选用♂小鼠进行试验 。在用鸡红
细胞进行免疫时不是全部小鼠都能免疫上 ,而在用
环磷酰胺进行免疫抑制时也不是全部小鼠都被抑
制。模型的成功率一般在 70%左右 。
试验周期可以是 7 d ,也可以是 14 d[ 4] 。经过验
证 , 2种方法均能成功造模 ,并且灌服药物后能体现
差异 。因此后期我们均采用 7 d的周期 。
参考文献:
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[收稿日期] 2008-10-22
[ 基金项目] 广西教育厅自然科学基金项目(编号:200710MS014) [ 作者简介] 林兴 , 男, 硕士 , 讲师 ,电话:0771-5358342 , E-m ail:gxLx60@
163.com [ 通讯作者] 黄仁彬 ,男 ,教授 , 电话:0771-5358272 , E-m ail:huangrenbin518@163.com
六月青总皂苷对 HepG 2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响
林兴1 ,黄权芳2 ,张士军1 ,刘曦1 ,黄仁彬1 (1.广西医科大学 , 广西 南宁 530021;2.广西中医学院第一附属医院 , 广西
南宁 530021)
[ 摘要] 目的:观察六月青总皂苷(TLYQ)的体外抗乙型肝炎病毒的作用。方法:采用 HepG 2.2.15细胞模型进行体外培养 ,
给予不同浓度 T LYQ , 以拉米夫定作阳性对照 , 作用 72 h 后检测上清液中 HBsAg 、HBeAg 的分泌 ,观察药物对 HepG 2.2.15
细胞分泌 HBV 病毒抗原的影响 , 同时以四甲基偶氮唑盐(M TT)比色法检测药物在体外对 HepG 2.2.15细胞的生长抑制作
用 ,从而评价药物的抗 HBV 作用。结果:TLYQ 对 H epG 2.2.15细胞的 50%生长抑制率(TC50)为349.51 mg·L-1 ,对 HepG
2.2.15细胞分泌 HBsAg 的 50%抑制率(IC50)为 9.45 mg·L-1 , 其治疗指数(T I)为36.98。结论:TLYQ 在体外有显著的抗
HBV 的作用 ,且毒性较低。
[ 关键词] 六月青总皂苷;HepG2.2.15 细胞;HBsAg;HBeAg
[中图分类号] R285.6 [ 文献标识码] A [文章编号] 1001-5213(2009)17-1445-04
Effect of the terpenoids of Liuyueqing on HBsAg and HBeAg in the HepG 2.2.15 cells
·1445·中国医院药学杂志 2009年第 29卷第 17期 Chin H osp Pharm J , 2009 Sep , Vol 29 , No.17
LIN Xing1 , HUANG Quan-fang2 ,ZHANG Shi-jun1 , LIU Xi1 , HUANG Ren-bin1(1.Guangx i M edical Unive rsi-
ty , Guangxi Nanning 530021 , China;2.No.1 H ospital of Guangxi co lleg e o f T raditional Medicine , Guangx i Nangning 530021 ,
China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To obse rve the effect of the terpeno ids o f Liuyueqing(TLYQ)on excreting HBsAg and H BeAg of
HepG2.2.15 cells.METHODS The to xicity o f T LYQ on HepG 2.2.15 ce lls w as detec ted by means of M TT.The inhibito ry
effects of TLYQ on HepG 2.2.15 cells ex creting HBsAg and H BeAg w ere evaluated with me thod o f EL ISA.RESULTS The
half to xic concentration(TC50)of T LYQ on HepG 2.2.15 cells was 349.51 mg·L-1 .The half inhibito ry concentra tion (IC50)
of T LYQ on HBsAg was 9.45 mg·L-1 , the trealment index(T I)of T LYQ on H BsAg w as 36.98.CONCLUSION T LYQ can
inhibit significantly HBV in vitro , and is a lower toxic drug.
KEY WORDS:terpeno ids of Liuyueqing(T LYQ);HepG2.2.15 cell;HBsAg;HBeAg
乙型肝炎是一类严重危害人类健康的传染性疾
病 ,现阶段研究表明 ,乙型肝炎的发病主要与免疫力
低下 、病毒持续感染和进行性肝细胞损伤有关 ,而中
药提取物可三方面并重 ,从而提高了疗效。六月青
采于广西灵山县 ,经广西中医药研究所中药鉴定室
鉴定为爵床科植物肖鸡笼(顶花马兰)Tara-
phochlamys a f f inis(Gif f)Bremekhu(Strobi lanthes
a f f inis(Grif f)Y.C.Tang)的干燥地上部分[ 1] ,是
复方六月雪(CLYX)主要组成药材之一 ,本课题组
前期研究表明 , CLYX 具有明显地抗 HBV[ 2-3] 和保
护急性化学性肝损伤的作用[ 4] ;CLYX 对 HepG2.
2.15 细胞毒性较低 ,无毒浓度的 CLYX 在 HepG
2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞 HBsAg 和
HBeAg 的分泌 ,且治疗指数(TI)均大于 2 ,为高效
低毒的抗 HBV药物[ 5] 。本实验旨在观察六月青总
皂苷(terpenoids of L iuyueqing , T LYQ)对 HepG
2.2.15细胞分泌 HBsA g 、HBeA g的影响 ,并初步探
讨其作用机制 ,为筛选出抗 HBV 主要活性部位提
供实验依据。
1 材料
HBsAg(乙型肝炎表面抗原)和 HBeAg(乙型
肝炎 E 抗原)酶联免疫检测试剂盒(上海荣盛生物
技术有限公司);HepG 2.2.15细胞株[北京医科大
学第一附属医院病毒研究所 ,本室自行传代 ,定期用
G418(一种筛选抗生素)筛选] ;六月青总皂苷(广西
医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心自
行提取);拉米夫定(100 mg/片 ,中国苏州葛兰素史
克制药有限公司 ,批号 2007090016);RPMI 1640培
养基(美国 Gibco 公司 ,批号 13200-035);小牛血清
(美国 Gibco 公司 , 批号 16000-036);G418(美国
Sigma公司 ,批号 108321-42)。
2 方法
2.1 六月青总皂苷的制备 六月青粗粉1.0 kg ,加
10倍量 80%乙醇回流提取 3次 ,每次1.5 h ,减压回
收乙醇至无醇味 ,分别用石油醚 、氯仿 、醋酸乙酯萃
取 ,弃去有机溶剂萃取液 ,最后再用水饱和正丁醇萃
取 ,取正丁醇萃取液减压浓缩至干 ,得到41.28 g浸
膏 ,上处理好的 AB-8型大孔树脂柱(40 mm×800
mm),分别用 6BV 的 30%乙醇和 50%乙醇洗脱 ,收
集醇洗脱液 ,减压回收乙醇 ,于60 ℃的减压恒温干
燥箱中干燥 ,得4.28 g淡黄色化合物 ,经常规化学定
性试验证实为皂苷类 ,利用香草醛-硫酸分光光度法
测定总皂苷含量[ 6] ,纯度为85.8%。
2.2 TLYQ 含药培养液的配制 将 TLYQ 以新鲜
注射用水配成1 000 mg·L -1(相当于生药233.64 g·
L -1)母液 ,经0.45μm 的微孔滤膜 ,再经0.22μm 微
滤膜过滤除菌后 ,置4 ℃冰箱保存备用。实验时用
完全培养液将 T LYQ稀释成所需终浓度的溶液 。
2.3 T LYQ 的细胞毒性实验(MTT 法) 取
HepG 2.2.15细胞 1瓶 ,用胰酶消化后制备成单细
胞悬液 ,计数后调整细胞浓度至 2×10 4cell·mL-1 ,
加入 96孔培养板中(每孔 100 μL),置二氧化碳孵
箱(37 ℃,5%二氧化碳)中培养 24 h 后 ,细胞贴壁
且生长良好 ,吸除全部培养液 ,加入用完全培养液将
TLYQ 系列 2 倍稀释成 1 000 , 500 , 250 , 125 , 62.5
mg·L-1的应用液 100 μL ,每个质量浓度设 6 个复
孔。连续培养 72 h , 培养结束前 4 h , 每孔加入
MT T 10 μL ,于二氧化碳孵箱中继续培养 。 4 h 后
小心吸弃上清液后 ,每孔加 DMSO 100 μL ,微量振
荡器振荡 5 min ,使结晶紫完全溶解 。自动酶标仪
(检测波长 570 nm ,参考波长 630 nm)读取各孔 OD
值 ,记录结果 。按 Reed-Muench法计算半数细胞毒
浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
2.4 酶联免疫吸附(ELISA)法定量检测 HBsAg
和 HBeAg 将 2×104 cell·mL-1的细胞悬液加至
24孔细胞培养板中 , 每孔 1 mL , 置二氧化碳孵箱
(37 ℃,5%二氧化碳)中培养 24 h 后 ,细胞贴壁且
生长良好 ,除去全部培养液 ,根据细胞毒性试验结
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果 ,分别加入无毒浓度以下系列 2倍稀释成 5 个终
质量浓度为 50 ,25 , 12.5 ,6.25 , 3.125 mg·L-1的溶
液 ,每个质量浓度设 3 个复孔 。以等量的完全培养
液为空白照 ,以拉米夫定(3TC)为阳性对照药 。连
续培养 72 h后 ,分别吸出上清液置于 1.5 mL 灭菌
Eppendorf管中 , -20 ℃保存 ,统一待检。
采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测 ,结果以抑
制率表示 ,药物对抗原的抑制百分率=[ 1-实验孔
抗原 OD 值/对照孔抗原 OD 值] ×100%, 并按
Reed-Muench 法计算半数抑制浓度(IC50)。
2.5 药效评价 一般用治疗指数(TI)来评价药物的
临床应用前景。TI=TC50/ IC50 , TI>2为药物有效低
毒 ,1
3 结果
3.1 药物毒性实验 不同稀释倍数的药物加于单
层 HepG 2.2.15细胞上 ,连续培养 72 h 后 ,观察细
胞生长形态 ,检测有无病变 ,并以 M TT 法测定细胞
的活力 , 按照 Reed-Muench 法计算得出:TC0 =
86.64 mg ·L-1 , TC50 = 349.51 mg ·L-1 , 即当
T LYQ药物浓度≤TC0时 , HepG 2.2.15细胞无论
在形态上还是数量上与空白对照无明显差异 , 对
HepG 2.2.15细胞毒性低 。结果见表 1。
表 1 TLYQ 对 HepG 2.2.15的生长抑制作用( x±s , n=6)
Tab 1 Inhibito ry effect o f TLYQ on HepG 2.2.15 cell( x±
s , n=6)
组别 质量浓度/mg·L-1 OD 570 抑制率/ %
T LYQ 1 000 0.225±0.008 95.66
500 1.5±0.4 53.79
250 2.4±0.5 22.47
125 2.61±0.24 15.19
62.5 2.98±0.19 2.83
细胞对照 — 3.06±0.11 —
拉米夫定 1 000 0.71±0.08 71.88
500 1.34±0.13 43.40
250 1.84±0.20 20.54
125 2.9±0.4 -29.58
62.5 2.01±0.25 12.46
细胞对照 — 2.3±0.3 —
空白对照 — 0.096±0.008 —
3.2 病毒抗原抑制试验 HepG 2.2.15在 24 孔
培养板上生长至单层 , 加入不同稀释倍数的
T LYQ ,同时设细胞对照组和药物对照组 ,培养 72
h ,分别取上清液测定 HBsA g 和 HBeA g ,并与细胞
对照组比较 ,计算抑制率 、IC50以及 TI 。结果表明 ,
T LYQ对 HBsAg 的抑制率在 50 ～ 12.5 mg·L-1范
围内均高于 50%;与细胞对照组比较 ,除3.125 mg·
L
-1剂量组外其余各组均有 P <0.05;TLYQ 对
HBsAg 的抑制作用呈现剂量依赖性;经计算 ,
T LYQ半数有效浓度 IC50 =9.45 mg·L-1 ,治疗指
数 TI=36.98。而对于 HBeAg , T LYQ在所选浓度
范围内对 HepG 2.2.15细胞分泌 HBeAg 的抑制率
均低于 50%,抑制作用不明显 ,但高于相应浓度拉
米夫定的抑制率。结果见表 2 。
表 2 TLYQ 对 HBsAg 、HBeAg 的抑制作用( x±s , n=3)
Tab 2 I nhibito ry effect o f TLYQ on HBsAg and H BeAg( x
±s , n=3)
组别 质量浓度/
mg·L -1
OD570 抑制率/%
HBsAg H BsAg H BsAg HBsAg
T LYQ 50 0.21±0.03a 1.50±0.27a 67.11 44.25
25 0.22±0.04a 1.5±0.3a 64.47 43.12
12.5 0.28±0.04a 1.6±0.4 51.54 39.78
6.25 0.32±0.05a 1.8±0.3 42.32 33.80
3.125 0.34±0.06 1.8±0.3 39.60 32.01
拉米夫定 50 0.44±0.06 1.9±0.4 16.45 27.58
25 0.37±0.05 1.9±0.4 31.58 30.03
12.5 0.32±0.04a 2.2±0.4 41.67 18.10
6.25 0.34±0.05 2.2±0.4 38.38 6.01
3.125 0.34±0.03 2.2±0.5 37.72 19.08
细胞对照 — 0.51±0.18 2.6±0.2 — —
空白对照 — 0.056±0.009 0.063±0.007 — —
注:与细胞对照组比较 , aP<0.05
4 讨论
研究表明 ,乙肝病变进展与病毒持续复制密切
相关 ,抗病毒治疗是治疗慢性乙肝的根本措施之一。
目前 ,临床上治疗慢性乙型肝炎的常用药物有干扰
素(IFN)和拉米夫定(lamivudine),但干扰素不良反应
大 、复发率高 ,而拉米夫定疗程长 ,易使病毒变异而产
生耐药性 ,临床治疗效果不理想。在筛选抗 HBV药
物过程中 ,病毒模型的选择对评价药物的疗效起着极
其重要的作用。HepG 2.2.15细胞是通过将重组
HBV-DNA直接导入受体细胞而建立的转染细胞株 ,
该细胞能长期 、稳定地向培养上清液中分泌 HBsAg 、
HBeAg和 HBV 颗粒及对人有感染性 ,可表达乙肝病
毒的全部标志 ,HepG 2.2.15细胞是当前体外筛选抗
HBV药物和药物评价的较好细胞模型 ,已被广泛用
于抗乙型肝炎病毒药物的体外研究[ 7] 。
本研究以 HepG2.2.15细胞株作为对象 ,首先
观察不同质量浓度的 TLYQ 对 HepG 2.2.15细胞
的毒性作用 , 以 MT T 法测定细胞的活力 , 按照
Reed-Muench法计算得出:TC0 = 86.64 mg·L-1 ,
TC50 =349.51 mg·L-1 ,提示 TLYQ 浓度≤86.64
mg·L-1时 ,对 HepG 2.2.15细胞的毒性低 。
而 TLYQ 对抗原抑制作用的实验发现 ,药物作
用 72 h后 , TLYQ 对 HBsAg 的抑制率在 50 ～ 12.5
mg·L-1范围内均高于 50%,提示 TLYQ 在体外具
有显著的抑制 HepG 2.2.15细胞分泌 HBsAg 的作
用(与细胞对照组比较 P <0.05),且对 HBsAg 的
抑制作用呈现剂量依赖性 ,经计算 , TLYQ 半数有
效浓度 IC50 =9.45 mg ·L-1 , 其治疗指数 TI =
·1447·中国医院药学杂志 2009年第 29卷第 17期 Chin H osp Pharm J , 2009 Sep , Vol 29 , No.17
36.98。TLYQ 对 HepG 2.2.15细胞分泌 HBeAg
的抑制率在所选浓度范围内均低于 50%,但高于拉
米夫定对 HepG 2.2.15细胞分泌 HBeAg 的抑制
率。本实验初步表明 TLYQ体外有明显的抗 HBV
的作用 ,且不良反应较低 ,是六月青主要抗 HBV 活
性部位之一 ,值得进一步研究和开发。
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[收稿日期] 2008-07-03
[ 基金项目] 湖北省教育厅科学技术项目(B20091801) [ 作者简介] 任占冬 ,男 ,硕士研究生 ,讲师 ,电话:027-63943866 , E-mai l:ren zhandong@
163.com
强碱性还原电位水的制备和杀菌效果
任占冬 ,朱玉婵 ,刘晔 ,陈红梅 ,张智勇 (武汉工业学院化学与环境工程系 ,湖北 武汉 430023)
[ 摘要] 目的:考察强碱性还原电位水(ERW)的制备工艺和杀菌效果。方法:利用三槽型离子膜电解槽和自制钛基贵金属电
极制备强碱性还原电位水。采用悬液定量杀菌法 ,利用 ERW 对大肠杆菌(8099)和枯草杆菌黑色变种芽孢(ATCC9372)进行
灭菌实验。结果:在电解质质量浓度为 1～ 5 g · L -1 ,电解时间为 10～ 80 min ,电流密度为 40～ 100 mA·cm -2下 , 电解质浓度 、
电解时间和电流密度的增加 , 会增加 ERW的 pH 值 ,减少其氧化还原电位(ORP值)。杀菌试验结果表明 , 10 min 内 , ERW对
大肠杆菌的杀菌率达到99.91%, 30 min 内接近 100%;60 min 内 ERW 对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀菌率为94.12%。结论:
ERW最佳制备工艺是 2 ～ 5 g·L -1NaCl ,电解时间为 30 ～ 60 min , 电流密度为 60 ～ 100 mA·cm-2 。 ERW对大肠杆菌和枯草杆
菌黑色变种芽孢具有很强杀灭作用。
[ 关键词] 强碱性还原电位水;制备;杀菌;大肠杆菌;枯草杆菌黑色变种芽孢
[中图分类号] X172 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 1001-5213(2009)17-1448-03
Study on preparation and sterilization of strong electrolyzed- reductive water
REN Zhan-dong ,ZH U Yu-chan ,LIU Ye ,CHEN Hong-mei ,ZHANG Zhi-yong(Depar tment of Chemical and En-
vironmental Eng inee ring , Wuhan Poly technic Univer sity ,Wuhan H ubei 430023 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To study the prepa ration techno lo gy and ste rilizing effects o f strong electro lyzed-reductiv e w ater
(ERW).METHODS We go t the st rong E RW with titanium electrodes coating with noble me ta l in three ion film electro ly ser.
The steriliza tion manner of Escherichia coli(8099)and Bacillus subti lis var .niger(ATCC9372)w as the suspension quantitative
germicidal test.RESULTS When the electro ly te concentration w as 1-5 g·L-1 , the electroly sis time was 10-100 min w ith the
cur rent density o f 40-100 mA cm -2 , the increases of them had enhanced the value of pH and dec reased the value o f reductant-
oxidant potential(ORP)of ERW.The sterilizing re sults indica ted tha t the sterilizing ratio s of Escherichia coli w ere 99.91%(10
min)and nea rly 100%(30min).The sterilizing ra tio of Baci llus subtilis var.niger was 94.12% in 60 minute s.CONCLUSION
The optimum conditions a re a s follows:2-5 g·L -1 sodium chlo ride so lution ste rilizing time of 30-60 min and the current den-
sity of 60-100 mA·cm -2 .ERW has w ell sterilizing effect on Escherichia coli and Bacillus subtilis v ar.nig er.
KEY WORDS:electro ly zed-reduc tive w ate r;prepar ation;ste rilization;Escherichia coli ;B acillus subtilis var .niger
电位水是通过在特制的电解槽中 ,添加一定浓度
的电解质 ,通过电解得到的特殊功能的水。其中在阳
极区得到强酸性氧化还原水;而在阴极区可以得到强
碱性还原电位水(ERW:pH >12.0 , ORP <-400
mV)。对酸性氧化电位水研究最早始于日本 ,其具有
杀菌广谱 、迅速 、强力 、持续等特点 ,可以在短时间内
杀灭多种细菌[ 1-5] 。最近 ,国外广泛开展 EOW对水
果 、蔬菜 、肉类等消毒的研究 ,以及对家禽消毒和对农
·1448· 中国医院药学杂志 2009年第 29卷第 17期 Chin H osp Pharm J , 2009 Sep , Vol 29 , No.17