全 文 ：· 694· Ch ina Pharmacy 2006 Vo l.17 No.9 中国药房 2006年第 17卷第 9期
*副主任药师。研究方向:临床药学。电话:0378-5671123
Content Determination of Amino Acids in Fol ium Isatidis by RP-HPLC Precolumn Derivatization Method
FENG Ling ling(He nan Provincial Kaifeng No.1 People s Hospital , Kaifeng 475000 ,China)
YU E Shumei ,WAN Shaohui(Co llege of Pharmacy ,He nan U nive rsi ty ,Kaifeng 475001 ,China)
KANG Tingguo(Colleg e of TCM in Liaoning ,Shenyang 110032 ,China)
ABSTRACT OBJECTIV E:T o est ablish a RP-HPLC precolum n derivatiza tion m ethod fo r the content determination o f arg i-
nine(Arg)and proline(Pro)in Folium Isa tidis.M ETHOD:2 , 4-dinitro-fluorobenzene w as undergone precolum n derivatization
and the amino acids w as determined directly under alka line condition with Kromasil C 18 as ch rom atog raphic colum n , the m obile
phase w as com posed of sodium ace tate buff er so lution(pH=6.4)-ace tonitrile(850∶150)w ith detection w aveleng th at 360nm ,
the content w as calcula ted by ex te rnal re ference method.RESULTS:The linear ranges fo r Arg and Pro were 0.627μg ～
5.016μg(r=0.9 996)and 0.874μg ～ 7.000μg(r=0.9 995), respective ly.T he average recovery was 98.2%wit h RSD at 2.3%
and 2.2%, respectively.CONCLUSION:The met hod is simple ,accura te and re liable ,and suitable fo r the assay ing of amino acids
in Folium Isa tidis.
KEY WORDS RP-HPLC;Precolumn deriva tization;2 ,4—dinitro-fluo robenzene;Folium Isa tidis;Arginine;Proline
反相高效液相色谱-柱前衍生化法测定大青叶中氨基酸的含量
冯玲玲 1* ,岳淑梅 2 ,万绍晖 2 ,康廷国 3(1.河南开封市第一人民医院 ,开封市 475000;2.河南大学药学院 ,开
封市 475001;3.辽宁中医学院 ,沈阳市 110032)
中图分类号 R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2006)09-0694-02
摘 要 目的:建立以反相高效液相色谱法测定大青叶中精氨酸和脯氨酸含量的方法 。方法:采用 2 , 4—二硝基氟苯柱前衍生化 ,
将氨基酸在碱性条件下衍生后直接进样测定;色谱柱为 Kromasil C18 ,流动相为醋酸钠缓冲溶液(pH=6.4)-乙腈(850∶150),检
测波长为 360nm , 外标法计算含量 。结果:精氨酸和脯氨酸进样量分别在 0.627μg ～ 5.016μg(r=0.9 996)、 0.874μg ～ 7.000μg
(r=0.9 995)范围内线性关系良好;平均回收率均为 98.2%(RSD=2.3%、2.2%)。结论:本法简便 、准确、可靠 ,适用于大青叶中
氨基酸的含量测定 。
关键词 反相高效液相色谱法;柱前衍生化;2 , 4—二硝基氟苯;大青叶;精氨酸;脯氨酸
大青叶为十字花科植物菘蓝(I satis i ndigotica Fort)的干
燥叶 ,具有清热解毒 、凉血消斑的功效 [1 ]。在对大青叶和板蓝根
复方制剂的研究中发现 , 大青叶中也含有一定量的氨基酸 。而
氨基酸是板蓝根定性 、定量分析的指标性成分 。故笔者参照板
蓝根的主药定量分析采用 2 , 4—二硝基氟苯(DNF)柱前衍生
化法 [2 ] , 将氨基酸在碱性条件下衍生后直接进样 , 以反相高效
液相色谱法(RP -HPLC)对大青叶中精氨酸(Arg)和脯氨酸
(Pro)进行定量分析 。
1 仪器与试药
1.1 仪器
HPLC 仪 , 包括 LC-10AT 泵 、 SPD -10A 紫外检测器 、
中北色谱数据处理工作站 (日本岛津公司);KQ -100型超声
波清洗器(江苏昆山市超声波仪器厂)。
1.2 试药
大青叶(市售药材 ,经鉴定为十字花科植物菘蓝的干燥叶);
Arg 对照品(中国药品生物制品检定所 , 批号:872-200203);
Pro 对照品(美国 Sigma 公司 , 经峰面积归一化法检查 ,纯度均
大于 98%,符合定量要求 , 批号:22638004);乙腈为色谱纯 ,其
它试剂均为分析纯 , 水为重蒸馏水 , 2 , 4—二硝基氟苯(经减压
蒸馏纯化)为生化试剂 。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Kromasil C18(250mm×4.6mm , 5μm);流动相:醋
酸钠缓冲溶液(pH=6.4)-乙腈(850∶150 , 流动相缓冲溶液
的制备:取醋酸钠 2.9g , 加入重蒸馏水约 700ml , 用 36%醋酸
调 pH=6.4 ,加入 N ,N —二甲基甲酰胺 7m l ,加水至 850ml);
流速:1.0m l/min;检测波长:360nm;进样量:10μl。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备:分别准确称取 Arg 和 Pro 对照品
约 10mg , 置于 10ml容量瓶中 , 用 40%乙醇溶解并稀释至刻
度 ,摇匀 ,即得 Arg 和 Pro 对照品溶液 。另准确称取 Arg 和 Pro
对照品 31.35 、33.02mg , 置于 25ml容量瓶中 , 用 40%乙醇溶
解并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得对照品混合溶液 。
2.2.2 衍生缓冲溶液的制备:配制浓度为 0.5mol/L 的碳酸
氢钠溶液(NaHCO 3)pH=9 ,即称取 NaHCO 3 4.2g , 用水溶解
并定容至 100ml ,即得 。
2.2.3 衍生溶液的制备:准确量取 DNF 1ml , 置于 100ml容
量瓶中 ,用乙腈稀释至刻度 ,即得 。
2.2.4 平衡溶液的制备:准确称取磷酸二氢钾 (KH 2PO 4)
3.4g ,置于 500ml容量瓶中 ,用水溶解 ,再加入浓度为 0.1mol/
L 的氢氧化钠(NaOH)145.5ml ,用水定容 ,即得 。
中国药房 2006年第 17卷第 9期 China Pharm acy 2006 Vol.17 N o.9 · 695·
表 1 回收率试验结果(n=5)
Tab 1 Results of recovery test(n=5)
对照品 加入量(mg)测得量(mg)回收率(%) (%) RSD(%)
Arg 5.122 5.107 99.7
5.175 5.284 102.1
4.855 4.743 97.7 98.2 2.3
4.869 4.655 95.6
5.002 4.862 97.2
Pro 4.881 4.881 100.0
5.200 5.132 98.7
4.925 4.718 95.8 98.2 2.2
5.101 4.897 96.0
4.928 4.943 100.3
x
图 1 高效液相色谱
A.对照品混合溶液;B.供试品溶液;1.A rg ;2.Pro
Fig 1 HPLC
A.mix ed control art icle;B.test sample;1.Arg;2.Pro
2.2.5 大青叶供试品溶液的制备:取大青叶粉末 (过 40目
筛)约 1.0g , 准确称定 ,加入 40%乙醇 40m l , 超声提取 30min ,
滤过 ,滤渣连同滤纸以 40%乙醇 15ml分 3次洗涤 , 合并滤液 ,
蒸干 , 残渣用 40%乙醇溶解并定容至 10m l容量瓶中 。准确量
取 1m l ,置于 10m l容量瓶中 ,加入衍生缓冲液 1.0ml , 摇匀 ,加
入衍生溶液 1.0ml ,避光 ,于 60℃恒温水浴中衍生 1h ,取出 ,放
置冷却 , 加入平衡缓冲液并稀释至刻度 , 摇匀 , 放置 15min , 经
0.45μm微孔滤膜滤过 ,取续滤液 ,即得 。
2.3 保留时间的测定
分别准确量取 Arg 和 Pro 对照品溶液各 2ml , 置于 10ml
容量瓶中 ,按“2.4”项下方法衍生 ,分别进样 , 测得 Arg 和 Pro
的保留时间分别为 26.40 、40.49min。
2.4 标准曲线的绘制
准确量取对照品混合溶液 0.5 、1.0 、1.5 、2 、2.5 、3 、3.5 、
4m l , 置于 10ml容量瓶中 ,加入衍生缓冲液 1.0ml , 摇匀 , 加入
衍生溶液 1.0ml , 摇匀 , 闭光 , 于 60℃水浴保温 1h , 放置冷却 ,
加入平衡溶液至刻度 ,放置 15min ,分别进样 10μl。以质量(Y)
对峰面积(X)进行线性回归 ,分别得 Arg 和 Pro 线性回归方程
为 Y=1.623 876×10 -5X —1.664 578×10 -2(r =0.9 996 ,
n=8)和 Y=1.625 322×10 -5X —2.564 872×10 -2(r =
0.9 995 , n=8), 表明 Arg 和 Pro 进样量分别在 0.627μg ～
5.016μg 和 0.874μg ～ 7.000μg 范围内线性关系良好 。
2.5 方法专属性考察
按“2.1”项下的色谱条件进样分析混合对照品溶液和供试
品溶液 ,结果 Arg 、Pro 与大青叶中其它组分分离完全 , 色谱详
见图 1。
2.6 重现性试验
取同一批大青叶粉末 , 按“2.2.5”项下方法提取 、衍生 、进
样 , 平行操作 5份;同时取对照品混合液 2m l , 置于 10ml容量
瓶中 ,同法衍生 ,进样 5μl 。利用外标法进行计算 ,得 Arg 平均
含量为 1.27% (RSD =2.0%), Pro 平均含量为 2.44%
(RSD=1.9%)。
2.7 稳定性试验
取“2.6”项下方法所得的同一供试品溶液的衍生溶液 , 按
“2.1”项下色谱条件每隔 0.5h测定 1次 ,共测定至 8h 。以 Arg
的峰面积积分值计算 ,结果样品在 8h内保持稳定 。
2.8 加样回收率试验
准确称取已测含量的大青叶粉末 1.0g , 再分别准确加入
Arg 和 Pro 对照品各约 5mg , 按“2.2.5”项下方法提取 、衍生 、
进样 10μl。同时 ,准确量取对照品混合溶液 2ml ,置于 10ml容
量瓶中 ,同法衍生 ,进样 5μl ,计算加样回收率 ,结果详见表 1。
2.9 样品含量测定
按上述方法 ,分别对 3种不同市售的大青叶样品中 A rg 和
Pro 的含量进行测定 ,结果详见表 2。
表 2 样品含量测定结果(n=3)
Tab 2 Content determinat ion result s of sample(n=3)
编号 Arg含量(%) Pro含量(%)
1 1.27 2.44
2 1.43 2.74
3 0.90 1.73
3 讨论
提取时间的考察:参照板蓝根中氨基酸的提取方法 [1 ] , 笔
者考察了样品超声提取 20 、30 、40min后的提取率 , 结果表明 ,
30min与 40min的提取率无显著性差异 。故采用 30min超声提
取 。
提取溶媒的考察:分别采用 60%[1 ]和 40%[3 ]的乙醇提取氨
基酸 , 结果表明 , 二者的提取率无显著性差异 , 故采用 40%的
乙醇为提取溶媒 。
对照品纯度的考察:所用对照品经峰面积归一化法检查纯
度均大于 98%,符合定量要求。
衍生化时间的考察:60℃衍生 1h , 本法结果在 8h内保持
稳定。
测定波长的考察:取 Arg 对照品溶液依法衍生后 , 以相应
试剂为空白 , 于 190nm ～ 700nm波长范围内扫描 , 最大吸收峰
位于 358nm 。Pro 对照品溶液依法衍生后的紫外吸收行为与
A rg 相似 ,故测定波长确定为 360nm 。
部分氨基酸的分离度与流动相的组成和 pH 值有较大关
系 , 应严格按规定配制流动相 。本衍生化反应彻底 , 衍生产物
DNF -氨基酸稳定 , 过量的 2 , 4—二硝基氟苯(DNFB)对氨基
酸定量测定无干扰 ,适用范围广 ,准确度高 ,重现性好 。大青叶
中 Pro 的含量高于 Arg ,而同法测得的板蓝根中 Arg 的含量高
于 Pro 。
参考文献
[ 1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[ S].2000
年版.北京:化学工业出版社 , 2000:163.
[ 2] 陈娅兰 ,付宜和 ,王国林 ,等 .十八种氨基酸注射液的
HPLC 2 , 4—二硝基氟苯柱前衍生化法含量测定 [ J] .药
物分析杂志 , 1990 , 10(3):149.
[ 3] 苗 虹 , 杨 涛 , 霍君生 ,等 .柱前衍生高效液相色谱法
测定食物中氨基酸含量[ J] .分析化学 ,2000 , 28(9):1 091.
(收稿日期:2005-05-31 修回日期:2005-08-19)