全 文 ： 2003, Vol. 24, No. 5 食品科学 ※工艺技术84
表8 正交试验极差分析
因 素
试验结果试验号
吸光度(A)A B C D
1 0.010.03 0.08 0.011.183
2 0.010.05 0.1 0.030.798
3 0.010.07 0.12 0.071.067
4 0.050.03 0.1 0.071.037
5 0.050.05 0.12 0.011.108
6 0.050.07 0.08 0.031.043
7 0.090.03 0.12 0.031.131
8 0.090.05 0.08 0.071.091
9 0.090.07 0.1 0.011.183
K1 3.0483.3513.3173.474
K2 3.1882.9973.0182.972
K3 3.4053.2933.3063.195
K1 1.0161.1171.1061.158
K2 1.0630.9991.0060.991∑=9.641
K3 1.1351.0981.1021.065
优水平 A3 B1 C1 D1
Rj 0.1190.1180.1 0.167
主次顺序 DABC
由表8可见，影响越桔天然色素吸光度因素的主
次顺序为：D＞A＞B＞C，即柚皮苷＞丁二酸＞阿
魏酸＞对羟基苯甲酸。根据K1、K2、K3确定各因素
的最优水平组合为A3B1C1D1，即丁二酸0.09%、阿魏
酸0.03%、对羟基苯甲酸0.08%、柚皮苷0.01%。
3 结 论
3.1 越桔天然色素短时受热和光照不变色，但较长
时间的加热和光照有较强的降解作用，耐氧化性差，
对普通还原剂较稳定。越桔色素在酸性条件下稳定，
在碱性条件下变色，蔗糖对越桔色素无不良影响。
除Fe3+外，其他金属离子对越桔色素无不良影响，且
有一定的护色作用。Fe3+对色素溶液有很大影响，易
使色素发生褪色或沉淀。
3.2 食品添加剂中苹果酸、丁二酸、阿魏酸、芦
丁、柚皮苷、对羟基苯甲酸对提高越桔色素稳定性有一
定的作用。其中丁二酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、柚皮
苷等四种物质作用效果较强，它们的组合使用效果更
明显，正交试验表明，最优水平组合为：丁二酸0.09%、
阿魏酸0.03%、对羟基苯甲酸0.08%、柚皮苷0.01%。
参考文献：
[1] 程素美,胡正强.食用天然色素的开发技术及前景初探[J].
江苏科技信息,1995,(12):31-33.
[2] 李丹,林琳.越桔食品资源的开发与利用[J].食品与发酵
工业,2000,26(4):76-81.
[3] 孔书敬,殷丽君,王萍.越桔色素的性质研究[J].黑龙江商
学院学报,2000,(16):25-28 .
[4] 章建浩,陈松,刘海斌等.食用玫瑰茄红色素的稳定性研究
[J].食品科技,2001,(1):49-55.
[5] Giuliani F.The cultivation and Roselle,1998,82(4):
715-728.
[6] Ando J.Chemical analyses of Roselle wood,1987,13:
79-80.
[7] 赵哲勋.天然色素稳定剂研究[J].农牧产品开发,1999,
(4):17-18.
[8] 李健,吴春,聂芊等.提高赤豆皮色素稳定性的方法研究
[J].黑龙江商学院学报,2000,16(2):28-31.
花生壳中木犀草素等抑菌活性成分的
提取、纯化与研究
陈春涛，马庆一，高玉美，孙红艳
(郑州轻工业学院食品与生物工程系，郑州　450002)
摘 要：本实验以甲醇粗提、溶剂梯度萃取、配合抑菌活性跟踪检测，得到了抑菌活性较强、富含黄酮类的花
生壳乙酸乙酯组分，并用酸碱沉淀、柱层析等法纯化得到三种化合物(1#，2#，3#)。其中2#从紫外光谱法确认为
木犀草素，得率为0.53%。它对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有一定的抑制效果。实验还发现3#对金黄色葡萄球菌、酿
酒酵母有一定的抑菌活性；1#则具有更广的抑菌谱，它对金黄色葡萄球菌、酿酒酵母、枯草杆菌和青霉均有较强
收稿日期：2002-11-22
作者简介：陈春涛(1969-)，女，硕士，讲师，主要从事微生物学教学与技术研究。
85※工艺技术 食品科学 2003, Vol. 24, No. 5
的抑制作用。它的紫外图谱具有二氢黄酮的特点，其结构有待进一步实验认证。
关键词：木犀草素；柱层析法；滤纸片法；抑菌活性
Abstract：In his experiment the flavonoids in peanut hulls with strong antimicrobial activity were found in ethyl acetate
component by methanol extraction and then successive polarity-increase solvent extraction to monitor the antimicrobial effect.
Through base-acid precipitation, and TLC purification three compounds (1# 2# 3#) were obta ned a d 2# was confirmed by UV
chemical structure analysis as Luteolin (the yield was 0.53 %) to have antimicrobial activities against Staphylococcus Aur us and
Bacillus subtilis , while 3# to have activities against Staphylococcus Aurous a d Saccha myces. 1#should even broader antimicrobial
effects on Staphylococcus Aurous，Saccharomyces , Bacillus subtilis，and Pen c lliam. According to UV, 1# might belong to
flavanones, and need to be determined further.
Key words：Luteolin；TLC purification；antim crobial activity
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2003)05-0084-05
木犀草素[1]是一种有代表性的天然黄酮。利用其
具有的抗氧化性，可用来抑制含油食品的哈变[2][4]。
虽有报道披露其可用于食品防腐保鲜[4]，但一般描述
措词简略，缺少细节。木犀草素的天然源植物尽管
很多，不过皆含量稀少，提取不易，故鲜见其提纯
和应用的详细报道。
农业废弃物花生壳中化学成分非常复杂，除含有
少量黄酮类物质如木犀草素外，还有约3.34%～7.13%
的多酚类物质[3,4]、大量碳水化合物及粗纤维。根据
黄酮类的性质，我们将花生壳用甲醇粗提、溶剂梯
度萃取并辅以同步抑菌活性跟踪检测，从而得到了抑
菌活性较强、富含黄酮类的组分，并用酸碱沉淀法
富集其强酸性成分以及柱层析纯化得到三种活性化合
物包括木犀草素，显而易见，本实验的结果不仅使
我们更加认识了有关天然抑菌防腐剂，还有利于农产
品废物的综合利用，减轻环境污染。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种
供试的六种菌如下，由本系微生物实验室提供
大肠杆菌Escherichia.coli；
枯草杆菌 Bacillus subtilis；
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus Aurous；
青霉 Penicilliam；
黑曲霉 Aspergillus niger；
酿酒酵母 Saccharomyces。
1.1.2 试剂 所用试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 活性成分的提取
将小心清洗过的花生壳晾干，用粉碎机粉碎至
40目，称取200g花生壳粉，分装于2个1000ml圆
底烧瓶，注入占烧瓶1/2体积的甲醇，接上回流冷
凝管，于水浴中加热回流3h，滤去残渣，滤液真空
浓缩至干，转移至滤纸包，移入索氏提取器，依次
用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇分别提取5h，
浓缩，定容。
1.2.2 活性成分的分离纯化
取少量乙酸乙酯提取液点样，用自制的硅胶G分
析板层析，选用丙酮为展开剂，以1% FeCl3溶液显
色。
a) 取50ml提取液真空浓缩到约10ml进行硅胶柱
层析，丙酮洗脱，最后阶段使用甲醇。
b)另取50ml乙酸乙酯提取液，用20ml 5％NaHCO3
水溶液萃取两次，合并水相，HCl酸化至pH2.0，以
15ml乙酸乙酯反萃两次，合并有机相, 无水Na2SO4干
燥，过滤，浓缩至约10ml，硅胶柱层析，分别接
取分开的色带浓缩并定容。
1.2.3 活性成分的结构确认
移取样品溶液50μl于蒸发皿中室温挥发干后，
用甲醇转移并最终定容为50ml，制成甲醇溶液，再
用滴加方式配制其他测定溶液，分别对其进行紫外光
谱扫描。
1.2.4 抑菌活性测定
采用圆形滤纸片法跟踪测定各种粗提取物和纯
化组分对测试菌的抑菌活性大小。以相对应的溶剂
为对照，抑菌活性大小以减去对照后的抑菌圈直径
大小表示。
2 结果与讨论
2.1 分离纯化结果
乙酸乙酯提取液，以丙酮做展开剂,薄层层析后,
用FeCl3显色，分出三个点。自下而上依次为黑绿、
蓝黑、黄色，显然3并非多酚或黄酮类，其结果如
2003, Vol. 24, No. 5 食品科学 ※工艺技术86
图1所示：
计算三个点的Rf值分别为：
Rf(1)＝ 0.26　 Rf(2)＝ 0.87　　Rf(3)＝0.94
2.1.1 取一份乙酸乙酯提取液直接经硅胶柱层析得三
组分，根据洗脱的先后顺序分别标号为1#、2#、3#；
2.1.2 另一份经碱液萃取、酸化、乙酸乙酯反萃
后，同样用硅胶柱层析，得单一色带，编号为4#，
贮存。柱层析结果如图2所示。
图 5 3#样液的光谱图
图 3 1#样液的光谱图
图4 2# 样液的光谱图
溶 剂 峰 值(nm)
MeOH 268
MeOH/NaAc 278
表1 带Ⅱ吸收峰比较
图1 薄层层析示意图 图2 柱层析示意图
经薄层层析验证2#和4#具有相同的Rf值,它们可
能是同一物质。
2.2 组分的结构确认[1]
2.2.1 紫外(UV)分光光度计法分析
2.2.1.1 测定样品在甲醇溶液中的UV光谱，将对
层析纯化后各组分样品的0.01%甲醇溶液紫外扫描、
记录，并以吸光度A、波长λ为纵、横坐标作图，见图
3、4和5。
多数黄酮类化合物由两吸收带组成，带Ⅰ在
300～400nm区间，由B环桂皮酰基系统的电子跃迁所
引起的；带Ⅱ位于240～285nm区间，由A环苯甲酰
基系统电子跃迁所引起的吸收[1] 。
1#在285nm有一吸收峰，说明分子中有A环苯甲
酰基，具二氢黄酮结构；2#在240～400nm区间出现
两个吸收峰，分别为258nm(Ⅱ)，336nm(Ⅰ)，因而
初步断定，组分2#具有黄酮类化合物的结构；3#在
0～400nm无吸收峰，而且FeCl3显色为阴性，进一
步说明它不是黄酮或多酚类。
2.2.1.2 2#的10倍甲醇稀释液加一滴1% NaAc溶液，
其紫外扫描结果见图6。
2.2.1.3 于MeOH/NaAc溶液中再加一滴2%硼酸溶液，
紫外扫描结果见图7。
由图6、图7光谱图可观察到峰值的红移现象，
结果如表1、表2所示。
MeOH/NaAc溶液光谱图与MeOH液光谱图相比，带
Ⅱ红移10nm。
87※工艺技术 食品科学 2003, Vol. 24, No. 5
B为样品MeOH液 D为样品MeOH/NaAc溶液
图6 2#样液及其NaAc溶液光谱图
C为样品MeOH+NaAc/H3BO3溶液
图7 2#样液及其NaAc/H3BO3溶液光谱图
溶 剂 峰 值(nm)
MeOH 336
MeOH/NaAc/H3BO3 352
表2 带Ⅰ吸收峰比较
MeOH+NaAc/H3BO3溶液光谱图与MeOH液光谱图相
比，带I红移16nm。
2.2.2 2#样液的颜色反应
a)三氯化铁反应，呈现蓝黑色。
b)取5ml 2# MeOH溶液加一滴浓HCl和2% H3BO3，
溶液呈现亮黄色。
2.2.3 将4#样循同样方法进行颜色反应和紫外扫描,
结果发现与2#的颜色、紫外图谱及各种红移特征完全
一致，这足以证明2#与4#事实上是同一组分。
2.2.4 木犀草素结构确认[1]
由颜色反应和紫外分析的结果可知：2#组分遇
FeCl3呈蓝黑色，表明其具有酚羟基；其MeOH溶液
UV图具有黄酮的两特征吸收带，即同时具备苯甲酰
和桂皮酰两结构的特征，属于黄酮化合物；它溶于
5% NaHCO3水溶液, 说明它具有相对强的酸性，一般
具有7,4，-二羟基；弱碱性的醋酸钠能使黄酮母核
酸性较强的酚羟基解离，从而使相应峰带红移。7-
OH可使带Ⅱ红移5～20nm，这里MeOH/NaAc溶液中带
Ⅱ的10 nm红移确认了7-OH的存在；B环邻二酚羟基
结构在醋酸钠碱性下可与硼酸螯合并引起带I红移
12～30nm，此处MeOH+NaAc/H3BO3溶液中带I的16nm
红移证实了B环邻二酚结构的存在。
黄酮类若有-C-C-C-结构，则在有机酸存
在条件下，与硼酸反应生成亮黄色，而5-羟基黄酮
可满足以上要求，表明了5-OH的存在。
表3 各种粗提取物的抑菌试验结果
注：— 无抑菌作用；＋ 抑菌圈d≤1.0mm；＋＋ 抑菌圈1.0≤d≤5.0mm。
菌种 大肠杆菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌 青霉 黑曲霉 酿酒酵母
甲醇 - + - - - ++
石油醚 + - - - - -
乙醚 + - - - - -
乙酸乙酯 + ++ - ++ ++ -
正丁醇 + - ++ ++ - -
表4 层析组分抑菌试验结果
注：对照为0.01%甲醇溶剂，以上结果为减去对照后所得抑菌圈直径。- 无抑菌效果；+ 抑菌圈直径d≤1.0mm；
++ 抑菌圈直径1≤d≤5mm； +++ 抑菌直径5≤d≤8.5mm。
菌种 大肠杆菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌 青霉 黑曲霉 酿酒酵母
1# + ++ +++ ++ - ++
2# - + ++ - - -
3# - - ++ - - +++
O
综上所述可推演出2#是木犀草素，结构为：
2003, Vol. 24, No. 5 食品科学 ※工艺技术88
2.2.5 木犀草素得率。
粉碎干花生壳重：200g；
烧瓶+产物重：59.99g；
空烧瓶重：58.93g；
得率计算：(59.99-58.93)/200 =0.53%。
2.2.6 抑菌试验结果[5,6]
2.2.6.1 花生壳的各种粗提取物的抑菌试验 结果见
表3。
由此表可知，花生壳的乙酸乙酯提取物对枯草杆
菌，青霉和黑曲霉有较好的抑菌效果，对大肠杆菌的
抑制效果次之；正丁醇提取物对葡萄球菌及青霉有较
好的抑菌效果；甲醇提取物对酿酒酵母有一定抑菌效
果。
2.2.6.2 层析组分抑菌试验 结果见表4。
花生壳乙酸乙酯提取物柱层析后所得的三组分都
对金黄色葡萄球菌有很好的抑制效果，对黑曲霉均无
效果；而乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌无抑制效
果，对黑曲霉的抑制效果较强。可能三组分对黑曲
霉的抑菌效果是辅配的，分离之后，都无法表现出
来。而三者对金黄色葡萄球菌的抑制效果有拮抗性，
分离前，因拮抗作用而未表现，分离后拮抗性消
失，各自都表现出抑菌活性。
2#木犀草素对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌有一定
的抑菌效果，而3#对酿酒酵母抑菌效果较强；1#在三
组分中抑菌效果最好，对枯草杆菌、青霉、酿酒酵母
的抑制活性强，特别对金黄色葡萄球菌有更强的抑菌
活性。
3 结论与展望
甲醇粗提、溶剂梯度萃取、酸碱沉淀以及柱层
析是分离和纯化花生壳中含量不高的木犀草素等黄酮
类天然抑菌成分、去除杂质的行之有效的方法。它
们多富集于乙酸乙酯相中。
花生壳乙酸乙酯提取物对枯草杆菌，青霉和黑曲
霉有显著的抑菌效果；正丁醇提取物能较好地抑制葡
萄球菌及青霉，而甲醇提取物对酿酒酵母有一定的抑
制活性。
乙酸乙酯提取液纯化得到三种化合物(1#，2#，
3#)其中2#被确认为木犀草素，得率为0.53%。它对
金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有一定的抑制效果。而3#
对金黄色葡萄球菌、酿酒酵母有一定的抑制活性；1#则
具有更广的抑菌谱，它对金黄色葡萄球菌、酿酒酵母、
枯草杆菌和青霉均有很强的抑制活性。它的紫外图谱
具有二氢黄酮的特点，其结构有待进一步实验认证。
我国是花生主要生产国，花生壳收获颇丰，但
遗憾的是它常被用作燃料或当作废物弃去。本实验揭
示了它含有黄酮类等抑菌活性物质，因而具有作为天
然食品防腐剂或医用的开发潜力，值得进一步探讨和
研究。
参考文献：
[1] 北京医学院,中医学院编.中草药成分化学[M].人民出版
社,1983.
[2] 黎碧娜,曾庆赞等.从花生壳中提取天然抗氧化成分的研
究[J].现代化工,1995,(10):31-33.
[3] 罗伟强.花生壳中总黄酮量的测定[J].西部粮油科技,
2002,27(2):48-49
[4] 孟阳,于丽娟等.花生壳中黄酮类抗氧化的提取与及在食
品中的应用[J].食品科学,1997,18(12):27-29.
[5] 颜栋美.中国芦荟抑菌作用的研究[J].食品工业科技,
1998,(3):10-11.
[6] 王维华,王南舟.连翘制剂对常见食品污染菌抑制作用的
研究[J].食品工业科技,1996,(1):27-29.
收稿日期：2002-11-15
作者简介：周海滨，男，32岁，工程师，主要从事超临界技术及微囊缓释剂技术应用研究、保健食品的开发研究工作。
超临界CO2脱除茶叶咖啡碱的工艺优化研究
周海滨，宋新生
(江西省鹰潭市工业技术研究所，鹰潭 335001)
摘 要：本文在大量实验基础上，研究了超临界CO2脱除茶叶中咖啡碱的工艺条件优化，着重讨论了影响咖啡碱
脱除率的因素及茶叶风味的保存因素，结合产品质量分析，得到了预脱茶香和脱咖啡碱的两级萃取、茶香吸附和咖啡
碱解析的两路分离、加稀乙醇作夹带剂的最佳工艺路线及参数，达到既保持了茶叶特别香味，又能有效脱除茶叶中咖
啡碱的目的。