全 文 ：瘤果黑种草子总皂苷提取工艺研究
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金蕾明１＊＊，赵　军２，徐　芳２，谭　为２，王桂玲２，徐建国２＊＊＊
（１新疆医科大学药学院，２新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐　８３００００）
摘要：目的　研究瘤果黑种草子总皂苷的含量测定方法及提取工艺。方法　采用比色法测定瘤果黑种草子
总皂苷，并采用正交设计优选其提取工艺。结果　对照品浓度在４９．７８～１３２．７５μｇ／ｍＬ范围内线性关系良好 （ｒ
＝０．９９７　１），平均回收率为１０２．８０％，相对标准偏差（ＲＳＤ）为１．６９％ （ｎ＝６）；瘤果黑种草子总皂苷的最佳提取工
艺为８倍量的３０％乙醇在７０℃水浴中提取３次，１ｈ／次。结论　比色法用于测定瘤果黑种草子总皂苷含量简单
可行、重复性好，提取工艺稳定可行。
关键词：瘤果黑种草子；总皂苷；含量测定；提取工艺；正交设计
中图分类号：Ｒ２８４．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９－５５５１（２０１１）１０－１０７５－０４
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　Ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｎｉｇｅｌｌａ　ｇｌａｎｄｕｌｉｆｅｒａ　Ｆｒｅｙｎ　ｅｔ　Ｓｉｎｔ
ＪＩＮ　Ｌｅｉ－ｍｉｎｇ１，ＺＨＡＯ　Ｊｕｎ２，ＸＵ　Ｆａｎｇ２，ＴＡＮ　Ｗｅｉ　２，ＷＡＮＧ　Ｇｕｉ－ｌｉｎｇ２，ＸＵ　Ｊｉａｎ－ｇｕｏ２
（１　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍａｔｅｒｉａ　Ｍｅｄｉｃａ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｎｉｇｅｌｌａ　ｇｌａｎ－
ｄｕｌｉｆｅｒａ　Ｆｒｅｙｎ　ｅｔ　Ｓｉｎｔ　ａｓ　ｗｅｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｏｔａｌ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｎｉｇｅｌｌａ　ｇｌａｎ－
ｄｕｌｉｆｅｒａ　Ｆｒｅｙｎ　ｅｔ　Ｓｉｎｔ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＵＶ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｗａｓ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏ－
ｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅ　ｗａｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　４９．７８－１３２．７５μｇ／ｍＬ　ｆｏｒ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｗａｓ　１０２．８０％ａｎｄ　ＲＳＤ　ｗａｓ　１．６９％ （ｎ＝６）．Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘ－
ｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｗａｓ　８ｔｉｍｅｓ　ｔｈｅ　３０％ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ａｔ　７０℃ｆｏｒ　３ｔｉｍｅｓ，１ｈｗｉｔｈ　ｅａｃｈ
ｔｉｍｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｉｓ　ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅ　ａｎｄ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ；ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃ－
ｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｓ　ｆｅａｓｉｂｌｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｎｉｇｅｌｌａ　ｇｌａｎｄｕｌｉｆｅｒａ　Ｆｒｅｙｎ　ｅｔ　Ｓｉｎｔ；ｔｏｔａｌ　ｓａｐｏｎｉｎｓ；ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈ－
ｎｉｑｕｅｓ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ
　　瘤果黑种草子维医称之为“斯亚旦”，为毛茛科
（Ｒａｕｎｎｃｕｌａｃｅａｅ）黑种草，属（Ｎｉｇｅｌａ）植物瘤果黑种
草（Ｎｉｇｅｌｌａ　ｇｌａｎｄｕｌｉｆｅｒａＦｒｅｙｎ　ｅｔ　Ｓｉｎｔ）的种子，主
产于我国新疆南疆和云南西双版纳地区。该药材性
温，味甘、辛，具有利尿、补脑肾、活血、解毒、下乳、通
经和乌发等功效，主要用于胸闷气促、乳腺肿块、耳
鸣、脱发等疾病的治疗，收载于《中国药典》、《维吾尔
药志》等医药文献中。现代研究表明，瘤果黑种草子
５７０１新疆医科大学学报　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＸＩＮＪＩＡＮＧ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　２０１１Ｏｃｔ．，３４（１０）
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基金项目：新疆维吾尔自治区科技支撑项目（２０１０３３１２１）
作者简介：金蕾明（１９８７－），女，硕士，研究方向：药物新制剂的开发与研究。
通信作者：徐建国，研究员，研究方向：药物新制剂的开发与研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｊｇ０９９１＠１２６．ｃｏｍ。
具有抗氧化、抗炎、抗过敏和免疫调节等多种生物活
性，皂苷及黄酮类化合物是其所含的主要特征性成
分［１－２］。但有关瘤果黑种草子总皂苷的含量测定及
提取工艺的研究却少有文献报道。因此，本研究在
课题组前期化学成分研究的基础上，以黑种草皂苷
Ａ为对照品，对瘤果黑种草子总皂苷的含量测定方
法及提取工艺进行研究，以期为该药材的进一步开
发应用提供理论数据。
１　材料与仪器
１．１　仪器　Ｂｐ２１１Ｄ型电子天平（德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ有
限公司）；ＪＭ 电子计数天平（浙江余姚纪铭称重校
验设备有限公司）；ＵＶ－２５０１ＰＣ紫外可见分光光度
计（日本岛津有限公司）；ＡＳ１０２００ＡＤ超声波清洗
器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；ＲＥ－５２９８Ａ旋
转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ＳＨＢ－ⅢＳ循环水
式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；ＷＨＦ－
２０３Ｂ暗箱式三用紫外分析仪（上海精科实业有限公
司）；２０２－ＩＥＳ电热恒温干燥箱（北京市永光明医疗
仪器厂）；ＤＺＦ－１真空干燥箱（北京市永光明医疗仪
器厂）；ＨＨ－Ｗ６００三用恒温水箱（江苏省金坛市医
疗仪器厂）。
１．２　试剂与材料　自制黑种草皂苷 Ａ对照品（含
量＞９５％）；无水乙醇、香草醛、硫酸、甲醇等试剂均
为分析纯；瘤果黑种草子药材购自新疆乌鲁木齐市
二道桥药材市场，由新疆维吾尔自治区药物研究所
张彦福 研究员鉴定为毛茛科植物瘤果黑种草
（Ｎｉｇｅｌｌａ　ｇｌａｎｄｕｌｉｆｅｒａ　Ｆｒｅｙｎ　ｅｔ　Ｓｉｎｔ）的干燥成熟
种子，标本存放于新疆维吾尔自治区药物研究所标
本室。
２　方法与结果
２．１　瘤果黑种草子总皂苷含量测定方法［３］
２．１．１　对照品及供试品溶液的制备　取干燥的黑
种草皂苷Ａ对照品适量，精密称定，置２５ｍＬ量瓶
中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。取提取液
作为供试品溶液。
２．１．２　样品提取方法　取适量的瘤果黑种草子粉
碎，过１４目筛，加１０倍量的石油醚回流提取３次，
每次１ｈ，过滤，取出药材，挥干石油醚备用。精密
称取脱脂后瘤果黑种草子２．００ｇ，加规定量不同浓
度乙醇在规定温度的水浴中回流提取不同时间，共
提取３次，提取液合并，过滤至１００ｍＬ量瓶中，用
提取溶剂定容至刻度，摇匀备用。
２．１．３　总皂苷含量测定方法　精密量取供试品溶
液适量，置于具塞试管中，水浴挥干，精密加入８％
香草醛－无水乙醇溶液０．１ｍＬ，１ｍｉｎ后再加入
７７％硫酸３．０ｍＬ，摇匀，置６５℃水浴中保温１０ｍｉｎ，
取出置冰水浴中冷却１５ｍｉｎ，精密量取１．０ｍＬ该溶
液，加７７％硫酸定容至１０ｍＬ，摇匀，静置１０ｍｉｎ，同
法做空白，在最大吸收波长处测定吸光度。
２．１．４　最大吸收波长的确定　分别精密量取
１．０ｍＬ黑种草皂苷Ａ对照品溶液、２．０ｍＬ供试品
溶液，均按照“２．１．４”项操作，在４００～７００ｎｍ范围
内扫描，吸收图谱见图１。结果表明对照品和供试
品在５２９ｎｍ处有最大吸收，故选择５２９ｎｍ作为黑
种草子总皂苷的测定波长。
图１　瘤果黑种草子样品和对照品黑种草皂苷Ａ的吸收图谱
（图谱自上而下分别依次为样品、对照品黑种草皂苷Ａ）
２．１．５　标准曲线的绘制　精密称取黑种草皂苷Ａ
０．０６４　３ｇ，置于２５ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解并稀释
至刻度。精密量取对照品溶液０．６、０．８、１．０、１．２、
１．４、１．６ｍＬ分别置于具塞试管中，按照“２．１．３”项
下操作，于５２９ｎｍ处测定吸光度。以对照品浓度Ｃ
为横坐标，吸光度Ａ为纵坐标，绘制标准曲线，得回
归方程Ａ＝０．００９　６Ｃ－０．０４７　２（ｒ＝０．９９７　１），黑
种草皂苷 Ａ对照品浓度在４９．７８～１３２．７５μｇ／ｍＬ
范围内呈良好线性关系。
２．１．６　精密度试验　精密量取对照品溶液１．０ｍＬ
５份，均按“２．１．３”项下操作，于５２９ｎｍ处测定吸光
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度，结果相对标准偏差（ＲＳＤ）为０．３６％，表明该法
精密度良好。
２．１．７　稳定性试验　取供试品溶液，按照“２．１．３”
项下操作，分别于０、１５、３０、４５、６０ｍｉｎ时于５２９ｎｍ
处测定吸光度，计算总皂苷含量，ＲＳＤ为１．９３％，表
明供试品显色后放置１ｈ对测定结果影响不大，能
够满足测定需要。
２．１．８　重复性试验　取同一批供试品５份，按照
“２．１．３”项下操作，于５２９ｎｍ处测定吸光度，计算
总皂苷含量，ＲＳＤ为１．３１％，表明该法重复性良好。
２．１．９　加样回收率试验　精密量取已知总皂苷含
量的供试品溶液１．０ｍＬ　６份，分别精密加入黑种草
皂苷Ａ对照品溶液０．５ｍＬ，均按“２．１．３”项下操
作，于５２９ｎｍ处测定吸光度，计算总皂苷含量，结
果见表１。
表１　加样回收率试验结果
序号 样品量／ｍｇ 加入量／ｍｇ 实测量／ｍｇ 回收率／％ 平均值／％ ＲＳＤ／％
１　 １．４０５　 １．２７６　 ２．７３４　 １０４．１６
２　 １．４０５　 １．２７６　 ２．７２７　 １０３．６３
３　 １．４０５　 １．２７６　 ２．７３９　 １０４．５４
１０２．８０　 １．６９
４　 １．４０５　 １．２７６　 ２．７１９　 １０３．００
５　 １．４０５　 １．２７６　 ２．６９３　 １００．９２
６　 １．４０５　 １．２７６　 ２．６８８　 １００．５２
２．２　瘤果黑种草子总皂苷提取工艺研究
２．２．１　乙醇浓度对总皂苷含量的影响［４］　选择乙
醇浓度分别为０、３０％、５０％、７０％、９５％。瘤果黑种
草子的脱脂处理方法见“２．１．２”项，精密称取脱脂后
瘤果黑种草子２．００ｇ，加１０倍量不同浓度乙醇在
７０℃水浴中回流提取３次，每次９０ｍｉｎ，合并提取
液，过滤至１００ｍＬ量瓶中，用相应的提取溶剂定容
至刻度，摇匀。分别精密量取各提取液２．０ｍＬ，按
“２．１．２”项下方法操作，于５２９ｎｍ处测定吸光度，
并计算总皂苷的含量。采用３０％乙醇提取时总皂
苷含量最高，当乙醇浓度大于３０％时，总皂苷含量
逐渐减小，因此选定３０％乙醇作为瘤果黑种草子总
皂苷的提取溶剂，见图２。
图２　乙醇浓度对总皂苷含量的影响
２．２．２　提取温度对总皂苷含量的影响［５］　选择提
取温度为５０、６０、７０、８０、９０℃。瘤果黑种草子的脱
脂处理方法见“２．１．２”项，精密称取脱脂后瘤果黑种
草子２．００ｇ，加１０倍量３０％乙醇在不同温度水浴
中回流提取３次，每次９０ｍｉｎ，合并提取液，过滤至
１００ｍＬ量瓶中，用相应的提取溶剂定容至刻度，摇
匀。分别精密量取各提取溶液２．０ｍＬ，按“２．１．２”
项下方法操作，于５２９ｎｍ处测吸光度，并计算总皂
苷含量。采用７０℃提取时总皂苷含量最高，当提取
温度大于７０℃时，总皂苷含量逐渐减小，因此选定
７０℃作为瘤果黑种草子总皂苷的提取温度，见图３。
图３　提取温度对总皂苷含量的影响
２．２．３　正交试验结果　根据单因素考察结果确定
了最佳提取温度和提取溶剂后，以影响总皂苷含量
的料液比、提取时间、提取次数为考察因素，每个因
素选取３个水平，按Ｌ９（３）４ 正交表安排试验，以总
皂苷含量为考察指标，优选最佳提取工艺。正交设
计因素水平表见表２，正交设计试验结果见表３，方
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差分析结果见表４。
表２　因素水平表
水平 Ａ（料液比／倍） Ｂ（提取时间／ｈ） Ｃ（提取次数／次）
１　 ８　 １．０　 １
２　 １０　 １．５　 ２
３　 １２　 ２．０　 ３
表３　正交试验结果
试验号 Ａ　 Ｂ　 Ｃ 总皂苷含量／％
１　 １　 １　 １　 ３．９２
２　 １　 ２　 ２　 ７．０４
３　 １　 ３　 ３　 ８．３１
４　 ２　 １　 ２　 ７．４３
５　 ２　 ２　 ３　 ８．４８
６　 ２　 ３　 １　 ５．３５
７　 ３　 １　 ３　 ７．７３
８　 ３　 ２　 １　 ４．６７
９　 ３　 ３　 ２　 ６．５１
ｋ１ ６．４２　 ６．３６　 ４．６５
ｋ２ ７．０９　 ６．７３　 ６．９９
ｋ３ ６．３０　 ６．７２　 ８．１７
Ｒ　 ０．７９　 ０．３７　 ３．５２
表４　方差分析结果
方差来源 离差平方和 自由度 均方 Ｆ值 Ｐ值
Ａ　 １．０７　 ２　 ０．５４　 ２．５７　 ０．２０１
Ｂ　 ０．２７　 ２　 ０．１４　 ０．６７　 ０．５００
Ｃ　 １９．３４　 ２　 ９．６７　 ４６．０５　 ０．０１４
误差 ０．４２　 ２　 ０．２１
　　注：Ｆ１－０．０５（２，２）＝１９．０，Ｆ１－０．１０（２，２）＝９．００。
由表３和表４结果可知，各因素对试验结果的
影响程度依次为Ｃ＞Ａ＞Ｂ，即提取次数＞料液比＞
提取时间。提取次数对瘤果黑种草子总皂苷含量的
影响有差异 （Ｐ＜０．０５），Ｃ３ 优于Ｃ２ 和Ｃ１；而料液
比和提取时间对瘤果黑种草子总皂苷含量的影响无
差异 （Ｐ＞０．０５），从节省时间和成本考虑，选择Ａ１
和Ｂ１。综合考虑，确定各因素的最佳水平组合为
Ａ１Ｂ１Ｃ３，即：８倍量的３０％乙醇，７０℃水浴提取３
次，每次１ｈ。
２．２．４　验证试验　精密称取脱脂处理过的瘤果黑
种草子３份，每份２．００ｇ，按优选出的最佳工艺条件
进行验证试验，结果总皂苷平均含量为８．４１％，说
明此提取工艺合理可行。
３　讨论
本试验采用香草醛－浓硫酸比色法，于５２９ｎｍ
波长处测定瘤果黑种草子总皂苷的含量，方法学考
察结果符合含量测定要求。由于该显色反应非常灵
敏，操作不当会影响试验结果。加入显色剂后摇匀
是该反应的关键，因而应在各种试剂都加入后，一起
振摇均匀后再进行温水浴，温水浴后要快速及时冷
却，且各样品的反应时间应严格一致。而且由于反
应后溶液较粘，在量取定容时待管壁上的粘附溶液
完全流下来后，再准确定容，否则会影响试验结果的
准确性。此外，香草醛溶液易被氧化变色，使用前需
新鲜配制。
三萜皂苷是黑种草子所含的特征性活性物质，由
于皂苷类化合物易溶于水、乙醇、甲醇等极性较大的
溶剂，而难溶于乙醚、石油醚等亲脂性溶剂，常利用这
一理化性质提取植物中的总皂苷［６－７］。因此本研究
先采用石油醚脱脂，再用低浓度乙醇从瘤果黑种草子
中提取总皂苷，并通过单因素考察和正交试验优化提
取工艺，确定了瘤果黑种草子总皂苷最佳提取工艺
为：脱脂处理后的药材加入８倍量的３０％乙醇，７０℃
水浴提取３次，每次１ｈ。经验证试验表明此提取工
艺合理可行。该提取方法简单易操作、成本低，可应
用于瘤果黑种草子总皂苷的工业化生产中。
参考文献：
［１］　信学雷，薛慧清，阿吉艾克拜尔·艾萨，等．黑种草属植物研
究进展［Ｊ］．时珍国医国药，２００８，１９（６）：１５１４－１５１７．
［２］　郝海峰，任丽娟．黑种草的应用及化学成分研究概况［Ｊ］．国外
医学中医中药分册，１９９４，１６（６）：８－１０．
［３］　潘正，高运玲，蔡应繁，等．紫外分光光度法测定唐松草中皂甙
的含量［Ｊ］．时珍国医国药，２００７，１８（１）：４０．
［４］　王川．龙舌兰皂苷的提取工艺［Ｊ］．食品与发酵工业，２００８，３４
（１１）：１９０－１９３．
［５］　孟庆艳，刘圆，李厚聪，等．川产藏药材红毛五加中总皂苷提取
工艺研究［Ｊ］．中成药，２００８，３０（４）：３９３－３９６．
［６］　魏永春，张卫，李冲．皂苷的提取与纯化工艺研究进展［Ｊ］．广东
化工，２００８，１１（３５）：５８－６１．
［７］　刘亚婷，徐建国，赵军，等．瘤果黑种草子超临界ＣＯ２ 流体萃取
物的ＧＣ－ＭＳ分析［Ｊ］．新疆医科大学学报，２００９，３２（１２）：１６６１－
１６６３．
［收稿日期：２０１１－０５－１７］
８７０１ 新疆医科大学学报　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＸＩＮＪＩＡＮＧ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　２０１１Ｏｃｔ．，３４（１０）