全 文 ：工 艺 技 术
2012年第20期
Vol . 33 , No . 20 , 2012
响应面法优化超声提取
甘青铁线莲总皂苷
甘青铁线莲（Clematis tangutica（Maxim.）Korsh）
为毛茛科铁线莲属植物，其性辛、甘、温，具有祛寒，
增生胃火，活血化淤，排脓散痈，消痞块的作用。常用
于胃寒，消化不良，痞瘤病，黄水病及寒性肿瘤，浮肿
等症的治疗[1-2]。铁线莲属植物主要的化学成分为三
萜皂苷类化合物，现代药理研究表明，铁线莲属植物
的皂苷类化合物具有抗肿瘤[3-9]、抗炎、镇痛等药理活
性。因此，研究其总皂苷的提取工艺对于开发和利用
铁线莲资源有重要意义。选取乙醇浓度、提取时间、
料液比三个因素，以香草醛-高氯酸显色法制作标准
曲线，以总皂苷提取得率为依据，采用响应面法对唐
古特铁线莲总皂苷提取工艺进行了优化。以期为研
究铁线莲皂苷的提取工艺路线提供参考，为铁线莲
资源的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
唐古特铁线莲 于2011年8月份采自青海门源
仙米林场，由中国科学院西北高原生物研究所梅丽
娟高级工程师鉴定；齐墩果酸对照品 批号：110709-
200304，供含量测定用，中国药品生物制品检定所；
香草醛、冰醋酸、高氯酸、无水乙醇、正丁醇、乙醚 均
为分析纯。
RE-52A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；
DZKW-C型电子恒温水浴锅 北京化玻联医疗器械
公司；KQ-250DB型超声波清洗器 昆山市超声仪器
有限公司；AG-204型万分之一分析天平 METTLER
公司；SHB-Ⅲ型循环水真空泵 郑州长城科工贸有
限公司；RT-9型中药粉碎机 浙江缙云县超力机械
厂；UV-7504C型紫外-可见光分光光度计 上海精
科实业有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的
牛江进1，2，王 瑛1，2，张 琳1，2，邵 赟1，梅丽娟1，陶燕铎1，*
（1.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810008；
2.中国科院研究生院，北京 100049）
摘 要：利用单因素实验及响应面法优化确定甘青铁线莲总皂苷的提取参数条件。通过单因素实验确定乙醇浓度、超
声时间、料液比三因素的最佳水平。 以甘青铁线莲总皂苷提取得率为响应值进行Box-Behnken中心组合实验设计，建
立铁线莲总皂苷提取得率的二次回归方程，得到优化组合条件。 响应面法分析结果表明，当乙醇体积分数为80%，超
声提取时间50min，料液比1∶30时，铁线莲总皂苷提取得率最大为15.78mg/g，接近于模型预测值16.19mg/g。
关键词：甘青铁线莲，总皂苷，超声提取，响应面法
Optimization ultrasonic extraction process of total saponins from
Clematis tangutica（Maxim.） Korsh by response surface methodology
NIU Jiang-jin1，2，WANG Ying1，2，ZHANG Lin1，2，SHAO Yun1，MEI Li-juan1，TAO Yan-duo1，*
（1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China；
2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）
Abstract：Single-factor tests and response surface method（RSM） were used to optimize the extraction process
of total saponins in Clematis tangutica（Maxim.） Korsh. In order to obtain the maximum yield of the extraction of
total saponins，three main factors including alcohol concentration，ultrasonic extraction time and ratio of raw
material to alcohol were determined with the Box -Behnken design and established a quadric regression
equation to predict the yield of total saponins. Results showed that the optimum extraction conditions were as
follows：alcohol concentration 80% ，ultrasonic extraction time 50min，and ratio of raw material to alcohol 1 ∶30.
Under the conditions，the optimum extraction yield of total saponins was 15.78mg/g，which was well matched
with the predictive extraction yield 16.19mg/g.
Key words：Clematis tangutica（Maxim.） Korsh；total saponins；ultrasonic extraction；response surface methodology
中图分类号：TS255.1 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2012）20-0199-05
收稿日期：2012－05－22 * 通讯联系人
作者简介：牛江进（1987-），男，硕士研究生，研究方向：天然药化。
基金项目：国家科技攻关项目（0713351614）；国家自然科学基金（31101012）。
199
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.20.030
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2012年第20期
齐墩果酸对照品3.5mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶
解并稀至刻度，摇匀，即得浓度为0.7mg/mL的齐墩果
酸对照品溶液。
1.2.2 供试品溶液的配制 称取干燥至恒重的甘青
铁线莲粉末0.5g，加入不同体积、不同浓度的乙醇，在
超声功率250W、频率53MHz下提取一定时间，过滤，
滤液减压浓缩后加水10mL溶解，以乙醚脱脂2次，每
次20mL，合并乙醚溶液并用10mL水洗涤，弃去醚层，
将洗液与水层合并，用水饱和过的正丁醇萃取3次，
每次20mL，合并萃取液，用20mL正丁醇饱和过的水
洗涤，挥去正丁醇后以甲醇溶解并定容至10mL[10]。
1.2.3 分析方法 精密吸取适量样品溶液或齐墩果
酸对照品溶液置于具塞试管中，于热水浴中挥去溶
剂，加入0.2mL新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和
0.8mL的高氯酸溶液，摇匀，70℃恒温水浴15min后，
流水冷至室温，加入乙酸乙酯使总量为5mL，摇匀，
在一定波长下以试剂空白为参比液测定吸光度[11-12]。
1.2.4 实验设计与数据分析
1.2.4.1 单因素实验设计 在进行响应面分析之前，
先通过单因素实验选出对唐古特铁线莲总皂苷提取
得率具显著影响的因素，并确定其实验的水平值。参
考相关文献，本文称取0.5g铁线莲干燥粉末，考查了
不同的料液比（1∶10~1∶50）、超声时间（20~60min）和
乙醇浓度（50%~90%）对铁线莲总皂苷提取得率的
影响。
1.2.4.2 响应面法实验设计与数据分析方法 根据
Box-Benhnken实验设计原理，选择影响铁线莲总皂
苷提取得率（Y）的3个主要影响因素：料液比（X1）、提
取时间（X2）、提取温度（X3）进行组合。以-1、0、1代表
因素水平，Xi（i=1、2、3）代表实验因素[13]。实验因素及
水平编码见表1。
采用Design-Expert 8.0软件对实验数据进行回
归分析，拟合二次多项式方程。多项式模型方程拟合
可靠性由R2表达，R2越接近于1，则多项式模型与实
际拟合可靠性越高；其统计学上的显著性由F值检
验，F值越大表明该变量对因变量的影响越显著；因
素的线性效应、平方效应及其交互效应的显著性由
模型系数的p值检验，概率p值越小，则相应变量的显
著程度越高，p＜0.01时影响为极显著，p＜0.05影响
显著[14]。
1.2.5 总皂苷提取得率的测定 计算公式为：总皂苷
提取得率（mg/g）=提取液中总皂苷质量（mg）/原料的质
量（g）。
提取液中总皂苷质量可按照1.2.3的分析方法，
测得吸光值后按齐墩果酸标准曲线的回归方程来
计算。
2 结果与分析
2.1 测定波长的选择
取齐墩果酸对照品溶液与供试品溶液各100μL，
分别置于具塞试管中，按1.2.3的分析方法于450~
650nm之间扫描，最终选择560nm为测定波长（见
图1A和图1B）。
2.2 标准曲线的绘制
分别精密移取上述齐墩果酸对照品溶液25、50、
75、100、125、150μL置于具塞试管中，沸水浴中挥去
溶剂。按显色条件显色，测定吸光度。以吸光度值为
纵坐标，取样量为横坐标绘标准曲线（见图2），得回
归方程：Y=0.0092X-0.0276，r=0.9989（n=6）。结果表
明，在17.5~105μg范围内，齐墩果酸显色后的吸光度
值A与加样量μg的线性关系良好。
2.3 稳定性实验
取上述齐墩果酸对照品溶液及供试品溶液各
100μL置于具塞试管中，沸水浴上挥去溶剂，按显色
条件显色。计时测定，隔一定时间测定一次吸光度
值，共测定120min。结果见图3，对照品溶液和供试品
溶液在120min内显色稳定。
因素
水平
-1 0 1
X1乙醇浓度（%） 70 80 90
X2超声时间（min） 40 50 60
X3料液比（mL/g） 1∶20 1∶30 1∶40
表1 Box-Behnken设计因素水平及编码
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
图2 齐墩果酸对照品的标准曲线
Fig.2 Standard curve of oleanolic acid
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 17.5 35 52.5 70 87.5 105 122.5
吸
光
度
（
A）
加样量（μg）
图1 光谱吸收图
Fig.1 Absorption spectrum chart
注：A：齐墩果酸显色后的光谱吸收；
B：供试品显色后的光谱吸收。
0.4
0.4
0.3
0.3
0.2
0.2
0.1
0.1
0.0
450 500 550 600 650
吸
光
度
（
A）
波长（nm）
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
450 500 550 600 650
吸
光
度
（
A）
波长（nm）
A
B
200
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Vol . 33 , No . 20 , 2012
2.4 精密度实验
分别精密移取上述齐墩果酸对照品溶液75、75、
75、75、75、75μL于具塞试管中，沸水浴中挥去溶剂。
按显色条件显色，测定吸光度。结果见表2。平均吸光
度为0.484（n=6），相对标准偏差为0.886%，结果表明
该方法有良好的精密度。
2.5 单因素实验结果
2.5.1 乙醇体积分数对铁线莲总皂苷提取率的影响
设定料液比1∶40，超声提取时间30min，以乙醇体积
分数对总皂苷提取率做单因素实验。设计乙醇体积
分数为50%、60%、70%、80%、90%。结果如图4所示。
总皂苷提取率随乙醇浓度增加而增加，当乙醇体积
分数为80%时，总皂苷提取得率最高，乙醇体积分数
大于80%时，提取得率下降。
2.5.2 超声提取时间对总皂苷提取率的影响 设定
料液比1∶40，乙醇体积分数为80%，以超声提取时间
对总皂苷做单因素实验。设计超声时间为20、30、40、
50、60min。结果如图5所示，总皂苷提取得率随超声
时间延长而增加，当超声提取时间为50min时，总皂
苷提取得率最高。
2.5.3 料液比对总皂苷提取率的影响 设定乙醇体
积分数为80%，超声提取时间50min，以料液比对总
皂苷做单因素实验。设计料液比为1∶10、1∶20、1∶30、
1∶40、1∶50。结果如图6所示。当料液比为1∶30时，总皂
苷提取得率最高，再增加乙醇的含量会使总皂苷提
取得率降低，同时增加生产成本。
2.6 响应面法优化甘青铁线莲总皂苷提取工艺
2.6.1 响应面分析方案与结果 对甘青铁线莲总皂
苷提取工艺进行响应面分析，其具体实验方案及结
果见表3。
采用Design-Expert 8.0软件对各因素进行回归
拟合，得回归方程方程：
Y=16.11+0.75X1-0.11X2+0.11X3+0.064X1X2+
图3 对照品及供试品溶液稳定性曲线
Fig.3 Stability of colored solution of oleanolic acid and
sample solution
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
15 30 45 60 75 90 105 120
吸
光
度
（
A）
对照品溶液稳定性曲线
供试品溶液稳定性曲线
时间（min）
图4 乙醇体积分数对总皂苷得率的影响
Fig.4 Influence of alcohol concentration on
total saponins extraction rate
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
50 60 70 80 90
吸
光
度
（
A）
乙醇体积分数（%）
图5 超声时间对总皂苷得率的影响
Fig.5 Influence of ultrasonic time on
total saponins extraction rate
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
20 30 40 50 60
吸
光
度
（
A）
超声时间（min）
图6 料液比对总皂苷得率的影响
Fig.6 Influence of ratio of raw material to alcohol on
total saponins extraction rate
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1∶10 1∶20 1∶30 1∶40 1∶50
吸
光
度
（
A）
料液比（W∶V）
实验号 X1 X2 X3 总皂苷得率（mg/g）
1 -1 -1 0 12.968
2 1 -1 0 14.402
3 -1 1 0 12.614
4 1 1 0 14.304
5 -1 0 -1 12.966
6 1 0 -1 13.943
7 -1 0 1 12.708
8 1 0 1 14.567
9 0 -1 -1 14.947
10 0 1 -1 14.842
11 0 -1 1 15.291
12 0 1 1 15.006
13 0 0 0 16.071
14 0 0 0 16.108
15 0 0 0 16.143
16 0 0 0 16.116
17 0 0 0 16.099
表3 总皂苷提取工艺条件优化实验设计及结果
Table 3 Optimization of extraction conditions and results of
experimental design
取样量（μL） 75 75 75 75 75 75
吸光度（A） 0.480 0.483 0.481 0.492 0.485 0.483
表2 精密度试验
Table 2 The precision of method
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0.22X1X3-0.045X2X3-2.01X12-0.53X22-0.56X32
由表4可知，方程中除X2X3（超声时间和料液比
因素的交互作用）无显著影响外，三因素的其他交互
项、线性及其平方项对总皂苷提取得率均达到显著
水平（p＜0.05），其中乙醇体积分数和料液比二因素
的交互作用极显著（p＜0.01）。三因素与响应值之间
线性关系极为显著；R2=0.9915表明该二次回归得到
的总皂苷提取得率模型与实际拟合较好，使用该方
程模拟实际的三因素三水平分析是可行的。同时，由
F值的大小可以推断，在所选择的实验范围内，3个因
素对总皂苷提取得率影响的排序为乙醇浓度（X1）＞
料液比（X3）＞超声时间（X2）。
2.6.2 因素间的交互影响 根据拟合模型绘制铁线
莲总皂苷的响应面，可直观地看出响应面的最高点，
即参数范围内的极值以及因素间的相互作用对响应
值的影响，依次可以确定最佳工艺参数范围。Design-
Expert 8.0软件处理后三维响应面图见图7~图9。
图7是料液比为1∶30时不同乙醇体积分数和超声
提取时间对总皂苷提取得率的影响，由图7可知，较
低浓度的乙醇和长时间超声会使样品中的杂质随着
总皂苷一起被提出来，造成总皂苷提取得率的下降。
图8是超声时间为50min时不同乙醇体积分数与
料液比对总皂苷提取得率的影响，从图8中可知，当
乙醇体积分数和料液比较低时，使总皂苷提取得率
较低，表明提取液极性的大小和用量对总皂苷提取
得率影响较大。
总的来说，乙醇浓度对总皂苷提取得率影响最
大，在所选的浓度范围内，随着乙醇浓度的增加，总
皂苷提取得率也随之增加，表现为曲面较陡。料液比
和超声时间对总皂苷提取得率影响不显著，故结果
未以响应面图形式列出。
2.6.3 铁线莲总皂苷提取工艺条件的确定 通过软
件Design-Expert 8.0求解方程，得出了最佳提取参数
条件：乙醇体积分数为81.92%，超声时间48.85min，
液料比1∶32.29，铁线莲总皂苷提取得率可达到。考虑
到实际操作的可行性，同时又达到节省时间与能耗
并取得最佳效果的目的，将铁线莲总皂苷的提取参
数条件修正为：乙醇体积分数80%，超声时间50min，
料液比1∶30。
按上述最佳参数即乙醇体积分数80%，超声时间
50min，料液比1∶30提取铁线莲总皂苷（n=3）以验证
响应面法的可行性。结果，平均提取得率为15.78mg/g，
与预测值16.19mg/g比较，基本吻合。
3 结论
本文在单因素实验的基础上，采用响应面法对
铁线莲总皂苷提取参数进行了优化。通过回归方程
优化得总皂苷的最佳提取参数条件为：乙醇体积分
数80%，超声提取时间为50min，料液比1∶30，此条件
下铁线莲总皂苷平均提取得率为15.78mg/g。回归分
析和验证实验结果表明，采用响应面法优化铁线莲
总皂苷的提取参数条件，得到的总皂苷提取参数具
有实际应用价值。
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参数 平方和 自由度 均方 F值 p值（Pr>F）
X1 4.44 1 4.44 1939.64 <0.0001
X2 0.089 1 0.089 38.63 0.0004
X3 0.095 1 0.095 41.73 0.0003
X1X2 0.016 1 0.016 7.10 0.0322
X1X3 0.19 1 0.19 84.98 <0.0001
X2X3 0.0081 1 0.0081 3.54 0.1020
X12 16.93 1 16.93 7398.95 <0.0001
X22 1.18 1 1.18 516.49 <0.0001
X32 1.30 1 1.30 568.94 <0.0001
模型 25.53 9 2.84 1239.81 <0.0001
残差 0.016 7 0.0023 - -
失拟项 0.013 3 0.0044 6.47 0.0515
纯误差 0.0027 4 0.00068 - -
总离差 25.55 16 - - -
表4 方差分析结果
Table 4 ANOVA of regression analysis
总
皂
苷
提
取
率
（
m
g/
g） 17
16
15
14
13
12
20
25
30
35
40
液料比（mL/g） 70
75
85
80
90
乙醇体积分数（%）
图8 Y=f（X1，X3）的响应面
Fig.8 Responsive surfaces of Y=f（X1，X3）
总
皂
苷
提
取
率
（
m
g/
g） 17
16
15
14
13
12
40
45
50
55
60
超声时间（min） 70
75
85
80
90
乙醇体积分数（%）
图7 Y=f（X1，X2）的响应面
Fig.7 Responsive surfaces of Y=f（X1，X2）
（下转第205页）
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工 艺 技 术
2012年第20期
Vol . 33 , No . 20 , 2012
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2.5 正交试验结果
在壳聚糖絮凝蛋清蛋白质过程中，很多因素影
响絮凝效果。根据影响絮凝效果的主要因素，取壳聚
糖溶液用量、絮凝温度、絮凝pH、加水量四个因素，各
取3个水平，进行L9（34）正交试验设计，结果见表2。
由表2可见，四个影响因素的最优水平组合为
A2B1C2D2，极差RA>RC>RD>RB。因此，壳聚糖用量是主
要因素，其次是溶液pH，然后是加水量、溶液温度。根
据分析结果进行验证试验，确定壳聚糖絮凝咸蛋清
中蛋白质的最佳条件为：10g咸蛋清，加水量10g，壳
聚糖溶液用量1.25mL，咸蛋清溶液pH=6、温度20℃，
粗蛋白质回收率为86.21%；均高于表2中其他组合的
回收率结果。
2.6 壳聚糖絮凝蛋白质质量
按着壳聚糖絮凝咸蛋清中蛋白质的最佳条件、
粗蛋白质回收率86.21%计算，每1.25mL（0.0125g）壳
聚糖溶液可以絮凝、回收0.7931g粗蛋清蛋白质（10g
蛋清×9.20g/100g×86.21%）；每克壳聚糖可以絮凝、回
收63.20g粗蛋清蛋白质。
3 结论
3.1 实验结果表明，可以利用壳聚糖絮凝方法除去
咸蛋清中的盐分。
3.2 壳聚糖溶液（1.00g/100mL）絮凝咸蛋清中蛋白
质的最佳条件是：10g咸蛋清，加水量15g，壳聚糖溶
液用量1.25mL，咸蛋清溶液pH=6、温度20℃，粗蛋白
质回收率为86.21%。每克壳聚糖可以絮凝、回收
63.20g粗蛋清蛋白质。
参考文献
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图4 加水量与絮凝效果的关系
Fig.4 Relationship between the amount of water and
flocculation effect
2.5 5 7.5 10 12.5 15
加水量（g）
90
80
70
60
50
40
粗
蛋
白
质
回
收
率
（
%）
实验号 A B C D 粗蛋白质回收率（％）
1 1 1 1 1 72.53
2 1 2 2 2 78.24
3 1 3 3 3 72.04
4 2 1 2 3 86.03
5 2 2 3 1 72.83
6 2 3 1 2 84.02
7 3 1 3 2 76.81
8 3 2 1 3 78.61
9 3 3 2 1 76.86
K1 222.81 235.37 233.16 222.22
K2 242.88 229.68 241.13 239.07
K3 232.28 232.92 221.68 236.68
k1 74.27 78.46 77.72 74.07
k2 80.96 76.56 80.38 79.69
k3 77.43 77.64 73.89 78.89
R 6.75 2.29 6.55 5.62
表2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiment
（上接第202页）
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