全 文 ：［收稿日期］ 20130606(025)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81100957);湖北省自然科学基金项目(2010CDB10703) ;三峡大学博士启动基金项目
(KJ2009B077)
［第一作者］ 代艳文，在读硕士，从事中药药理研究，Tel:0717-6397466，E-mail:dyw891122@ 163． com
［通讯作者］ * 王婷，医学博士，副教授，从事中药药理研究，Tel:0717-6397466，E-mail:tingting0301@ 126． com
竹节参醇提物对 LPS诱导 ＲAW264. 7 细胞炎症的保护作用
代艳文1，2，杨莉1，万静枝1，袁丁1，王婷1*
( 1. 三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002; 2. 三峡大学化学与生命科学学院，湖北 宜昌 443002)
［摘要］ 目的:观察竹节参醇提物对脂多糖(LPS)刺激小鼠单核巨噬白血病细胞 ＲAW264. 7 细胞炎症保护作用的初步
探讨。方法:用不同质量浓度的竹节参醇提物处理 ＲAW264. 7细胞，噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性;检测 LPS刺激的 ＲAW264. 7
细胞一氧化氮(NO)释放量以及竹节参醇提物干预后 ＲAW264. 7细胞 NO释放量;酶联免疫吸附(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α
(TNF-α)、白介素 1β(IL-1β)分泌;聚合酶链反应(PCＲ)法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mＲNA 的表达;免疫印迹(Western
blot)法检测胞浆胞核核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达。结果:竹节参醇提物作用 ＲAW264. 7 细胞的安全范围 ＜ 100 mg·L －1;
LPS的用药质量浓度为 1 mg·L －1;与 LPS模型组相比，竹节参醇提物 0. 1，1，10，40 mg·L －1能有效抑制 NO释放(抑制率分别为
31. 2%，41%，46. 1%，55. 2%)和抑制 TNF-α，IL-1β的分泌(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01);竹节参醇提物 10，40 mg·L －1能下调 LPS模
型组 iNOS mＲNA表达且抑制 NF-κB的核移位。结论:竹节参醇提物对 LPS刺激的 ＲAW264. 7 细胞炎症具有保护作用，其保
护机制可能与调控 NF-κB通路，进而抑制 NO的释放，降低 TNF-α，IL-1β，iNOS表达有关。
［关键词］ 竹节参醇提物;ＲAW264. 7 细胞;脂多糖;抗炎;肿瘤坏死因子-α;白介素 1β;一氧化氮;一氧化氮合酶
［中图分类号］ Ｒ285． 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)02-0163-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2014020163
Protective Effect of Panax japonicus Ethanol Extract on the
Inflammation of ＲAW264. 7 Cells Induced by LPS
DAI Yan-wen1，2，YANG Li1，WAN Jing-zhi 1，YUAN Ding 1，WANG Ting1*
(1. Medical College of China Three Gorge University，Yichang 443002，China;
2. Chemistry and life science College of China Three Gorges University，Yichang 443002，China)
［Abstract］ Objective:To observe the protective effect of Panax japonicus ethanol extract on the
inflammation of mice mononuclear macrophage ＲAW264. 7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS)． Method:
The ＲAW264. 7 cells were treated with different concentration of P． japonicus ethanol extract，cell viability was
determined with MTT method;the nitric oxide (NO)release of ＲAW264. 7 cells stimulated by LPS and treated
with LPS and P． japonicus ethanol extract was detected with Griess． ELISA were used to detect the expression of
Tumor necrosis factor-α (TNF-α)，interleukin 1β (IL-1β) ;nitric oxide synthase mＲNA (iNOS mＲNA)and
neclear factor-κB (NF-κB)was tested by PCＲ and Western bolt respectively． Ｒesult:The safe range of ethanol
extract of P． japonicus is less than 100 mg·L －1;Concentration of LPS was 1 mg·L －1;Compared with the LPS
model group，P． japonicus ethanol extract 0. 1，1，10，40 mg·L －1 could inhibit the of NO effectively，the
inhibition rates were 31. 2%，41%，46. 1%，55. 2%，and inhibit the release of TNF-α，IL-1β，with significant
difference (P ＜ 0. 05 or P ＜ 0. 01);P． japonicus ethanol extract 10，40 mg·L －1 could down-regulate the
expression of iNOS mＲNA and inhibit NF-κB nuclear translocation． Conclusion:P． japonicus ethanol extract has
protective effects on ＲAW264. 7 cells stimulated by LPS，the mechanism of P． japonicus ethanol extract may be
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2014 年 1 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 2
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related to its regulation on NF-κB signal pathway，thereby inhibiting the release of NO and reducing the expression
of TNF-α，IL-1β and iNOS．
［Key words］ Panax japonicus ethanol extract;ＲAW264. 7 cells;LPS;anti-inflammatory;TNF-α;
IL-1β;NO;iNOS
竹节参是我国名贵中草药，具有滋补强壮、散瘀
止痛、止血祛痰等多种药效。竹节参醇提物主要以
齐墩果烷型皂苷为主，尚有少量达玛烷型皂苷，另含
有竹节参多糖、挥发油等。药理研究显示，竹节参及
其活性成分具有抗炎等多种药理作用。基于此，本
研究拟建立 LPS 致小鼠单核白血病巨噬细胞株
ＲAW264. 7 炎症模型，探讨竹节参醇提物的抗炎效
果，为竹节参的研究及开发利用提供理论基础。
1 材料
1. 1 药品与试剂 竹节参采自湖北恩施椿木营竹
节参种植基地，经三峡大学湖北省天然产物研究与
利用重点实验室邹坤教授鉴定为五加科人参属植物
Panax japonicus C． A． Mey。醇提物干粉在本实验
室提得，取竹节参干燥根茎粗粉，加入 60%乙醇加
热回流 3 次，合并滤液后浓缩干燥，得竹节参醇提物
粉末，得率 25. 8%，实验前用 PBS 溶解配成 1 000
mg·L －1的母液，再用培养基稀释至所需质量浓度;
小鼠 ＲAW264. 7 细胞，细胞系购于中国科学院上海
细胞库。DMEM 高糖培养基(Gibico 公司，批号
884684);胎牛血清 (杭州四季清公司，批号
100607);脂 多 糖 (LPS，Sigma 公 司，批 号
110M4086V);Trizol，DEPC，PCＲ 扩增试剂盒［生工
生物 工 程 (上 海)有 限 公 司，批 号 A7107-1，
SJ0312B4013J 和 12091564F］;PrimeScript  ＲT
reagent Kit With gDNA Eraser［宝生物工程(大连)有
限公司，批号 BK401］;一氧化氮(NO)试剂盒(碧云
天生物公司，批号 S0021-3);肿瘤坏死因子-α(TNF-
α)、白介素 1β(IL-lβ)ELISA试剂盒(上海欣博盛生
物科技有限公司，批号 M121015-12a、M121029-
07a);NF-κB 抗体(Cell Signaling Technology 公司，
批号 L8F6);β-actin、一氧化氮合酶(iNOS)引物(上
海 生 工 合 成，批 号 8302054112、830254113 和
830205114、830254115);MTT(武汉博士德生物公
司，批号 AＲ1156);ECL试剂盒(武汉科瑞生物有限
公司，批号 P1010);胞浆胞核蛋白提取试剂盒和
BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公
司，批号 P1200、P1511)。
1. 2 仪器 NU-4750E 型二氧化碳培养箱(Nu Aire
公司)，CKX41 倒置显微镜(日本，Olympus 公司)
SW-4T-2F洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗
设备厂)，CT15ＲT 高速冷冻离心机(上海天美生化
仪器设备工程有限公司)，Thermo 全波长酶标仪(芬
兰，Tecan Inpinifetm 200)，9902 型 PCＲ 扩增仪(新
加坡 AB Applied Biosystems)，Gene Genius 凝胶分析
系统(英国 Syngne 公司)，165-1801 型 PCＲ 及
Western电泳仪(美国 Bio-Ｒad)。
2 方法
2. 1 细胞培养 ＲAW264. 7 细胞培养于含 10%胎
牛血清的 DMEM 培养液中，置 37 ℃，5% CO2 培养
箱内培养。取对数生长期细胞用于实验。
2. 2 对细胞活力的影响 取对数期 ＲAW264. 7(调
整细胞密度为 105 个 /mL)细胞悬液接种于 96 孔
板，每孔 100 μL，4 ～ 6 h 贴壁后，设调零孔、空白对
照组(细胞 +培养基)、竹节参醇提物 5，10，20，40，
80，100，200 mg·L －1组，每组 4 个复孔，24 h 后吸取
上清液，每孔加入含 MTT 的培养液，继续培养 4 h，
弃上清，每孔加 150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，置摇
床上低速震荡 10 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫
检测仪 490 nm处测量各孔的吸光度(A)。
2. 3 LPS致炎浓度的确定 取对数期 ＲAW264. 7
细胞悬液接种 96 孔板，细胞密度为 105 个 /mL，每孔
100 μL，4 ～ 6 h贴壁后加入 LPS 刺激，设置调零孔、
空白对照组、LPS组，LPS刺激质量浓度为 0. 5，1，5，
10，50，100，200 mg·L －1，每组 4 个复孔。24 h 后用
Griess法检测细胞上清液 NO含量。
2. 4 对 LPS 刺激 ＲAW264. 7 细胞 NO，TNF-α，IL-
1β的影响 取对数期 ＲAW264. 7 细胞悬液接种 24
孔板，细胞密度为 5 × 105 个 /mL，每孔 1 mL，4 ～ 6 h
贴壁后，同时加入竹节参醇提物 0. 1，1，10，40 mg·
L －1和 LPS 1 mg·L －1作用，设调零孔、空白对照组、
LPS组、LPS +竹节参醇提物组，每组 4 个复孔，24 h
后，用 Griess法检测上清 NO 释放量，ELISA 试剂盒
检测上清 TNF-α，IL-1β分泌情况。
2. 5 iNOS mＲNA 表达的检测 采用 PCＲ 法。取
对数期 ＲAW264. 7 细胞悬液接种 6 孔板，细胞密度
为 106 个 /mL，每孔 2 mL，4 ～ 6 h 贴壁后，先加入竹
节参醇提物 10，40 mg·L －1保护 12 h，再加入 LPS 1
mg·L －1刺激 12 h，设为调零孔、空白对照组、LPS组、
LPS +竹节参醇提物组，12 h 后，按 Trizol 试剂盒提
取总 ＲNA，反转录为 cDNA，然后扩增 iNOS 基因。
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 2
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iNOS 引物上游:5-GCCCTGCTTTGTGCGAAG-3;下
游:5-GCCCTTTGTGCTGGGAGTC-3，扩增条件 94
℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，GOTO2，
34 次，72 ℃ 5 min，产物 500 bp;内参 β-actin引物上
游:5-CGTGCGTGACATCAAAGAGAA-3，下游:5-
TGGATGCCACAGGATTCCAT-3，扩增条件 94 ℃ 5
min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 10 s，GOTO2，34
次，72 ℃ 5 min，产物 201 bp，琼脂糖凝胶电泳检测
iNOS表达情况。
2. 6 ＲAW264. 7 胞浆胞核 NF-κB 蛋白表达检测
采用 Weetern blot 法。分组剂量同 2. 5。取对数期
ＲAW2647 细胞悬液(调细胞密度为 5 × 105 /mL，接
种 6 孔板，每孔 2 mL，4. 6 h 贴壁后，先加入竹节参
总提物 10，40 mg·L －1，保护 20 h，再加入 1 mg·L －1
LPS刺激 4 h，2 h后，提取胞浆胞核蛋白，检测细胞
NF-κB蛋白表达情况，采用 BCA蛋白定量法检测各
组细胞胞浆胞核浓度，95 ℃灭活蛋白 5 ～ 10 min，
SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，ECL显色。
2. 7 统计学处理 采用 GraphPad Prism 5 软件，
PCＲ与 Western数据采用 Image J软件分析，组间用
单因素方差分析，P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 对细胞活力的影响 竹节参醇提物 5 ～ 100
mg·L －1时对细胞活力无明显影响，200 mg·L －1时，
与空白对照组相比，细胞活力明显下降至 54. 8%
(P ＜ 0. 01)。见图 1。
与空白对照组比1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01(图 2 同)
图 1 竹节参醇提物对 ＲAW264. 7 细胞活力的影响(珋x ± s，n = 4)
3. 2 LPS 致炎浓度的确定 LPS 能有效诱导
ＲAW264. 7 细胞释放 NO，与空白对照组相比，1 mg·
L －1 LPS 刺激的 ＲAW264. 7 细胞释放 NO 是正常组
的 2. 4 倍(P ＜ 0. 01)，并呈剂量依赖性。见图 2。
图 2 LPS致 ＲAW264. 7 细胞 NO释放量的影响(珋x ± s，n = 4)
3. 3 对 LPS 刺激 ＲAW264. 7 细胞 NO，TNF-α，IL-
1β的影响 与空白对照组相比，LPS组处理后，NO，
TNF-α，IL-1β释放量显著升高;与 LPS 组相比，竹节
参醇提物各组均能显著抑制 NO(0. 1，1，10，40 mg·
L －1的抑制率为 31. 2%，41%，46. 1%，55. 2%)，
TNF-α，IL-1β释放量。见图 3。
与空白对照组相比 1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01;与模型组相比 3)P ＜ 0. 05，4)P ＜ 0. 01(图 4-5 同)
图 3 竹节参醇提物对 LPS刺激 ＲAW264. 7 细胞 NO，TNF-α，IL-1β释放量的影响(珋x ± s，n = 4)
3. 4 对 iNOS mＲNA表达的影响 与空白对照组相
比，LPS模型组 iNOS mＲNA 表达显著升高;与 LPS
组相比，竹节参醇提物各剂量组均能显著抑制 iNOS
mＲNA表达。见图 4。
3. 5 对胞浆胞核 NF-κB 蛋白表达的影响 与空白
对照组相比，LPS 模型组胞浆内 NF-κB 蛋白表达降
低，胞核内 NF-κB 蛋白表达升高;与 LPS 组相比，竹
节参醇提物能升高胞浆内 NF-κB 蛋白表达，降低胞
核内 NF-κB蛋白表达。见图 5。
4 讨论
体内有数十种炎症介质参与了炎症反应，其中
NO ，IL-1β，TNF-α 是重要的炎症细胞因子，均可促
进炎症反应和组织损伤［2］。研究发现，竹节参及其
活性成分具有抗炎等多种药理活性［3-4］。本实验发
·561·
代艳文，等:竹节参醇提物对 LPS诱导 ＲAW264. 7 细胞炎症的保护作用
图 4 竹节参醇提物对 LPS刺激
ＲAW264. 7 细胞 iNOS mＲNA表达的影响(珋x ± s，n = 4)
图 5 竹节参醇提物对 LPS刺激 ＲAW264. 7
胞浆胞核 NF-κB蛋白表达的影响(珋x ± s，n = 3)
现，当竹节参醇提物在 100 mg·L －1以下时对细胞无
明显影响，提示其安全用药范围在≤100 mg·L －1。
NO 参与多种生理和病理过程。在体内 NO 是由
NOS催化 L-精氨酸(L-Arg)产生。NOS 主要包括神
经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)3 种，
其中 iNOS主要是在炎症和免疫刺激下表达，进而
催化 NO 持续生成，过量 NO 则会促进炎症性疾病
的发生和发展［5-6］。竹节参醇提物各剂量均能有效
抑制 LPS组 NO的释放。TNF-α在机体的免疫中发
挥着重要作用。IL-1β 由激活的单核和巨噬细胞分
泌，内毒素能够诱导其产生，是机体早期炎症的标志
物，主要生物学特性是介导炎症反应，此外还能诱导
炎性因子如 IL-6，IL-8 等的产生［7-8］。本实验发现，
竹节参各剂量组均能显著抑制 TNF-α和 IL-1β 释放
及 iNOS mＲNA表达。NF-κB是早期核转录因子，参
与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子都
受 NF-κB 的调控，在静息状态下，NF-κB 和 IκB 形
成复合体存在于胞浆中。当受到刺激后，IκB 激酶
复合体(IκB kinase，IKK)活化将 IκB 磷酸化，使
NF-κB与 IκB 解离，游离的NF-κB迅速移位到细胞
核，诱导相关基因转录。本实验结果显示，当
ＲAW264. 7 细胞受到 LPS 刺激后，NF-κB 发生了核
移位，而竹节参醇提物能抑制 NF-κB的核移位。
综上，竹节参醇提物对 LPS 刺激的 ＲAW264. 7
细胞炎症具有一定的保护作用，其保护机制可能与
其能调控 NF-κB 通路，进而抑制 NO 的释放、降低
iNOS，TNF-α和 IL-1β 表达有关。但调控 NF-κB 的
上游分子很多，竹节参醇提物如何通过上游分子调
控 NF-κB仍需进一步研究。
［参考文献］
［1］ 赵晖，张秋霞，穆阳．竹节参总皂苷对脑缺血损伤大鼠
海马一氧化氮合酶的影响［J］． 中国中药杂志，2008，
33(5):557．
［2］ 李艳丽，胡彦武． 紫花地丁抗炎作用及机制研究［J］．
中国实验方剂学杂志，2012，18(24):244.
［3］ 敖明章． 竹节参皂苷抗炎抗风湿作用及机理研究
［D］．湖北:华中科技大学，2012:1.
［4］ 袁丁，姚琦，张长城． 竹节参总皂苷对佐剂关节炎大
鼠血清 TNF-α 和 IL-1β 表达的影响［J］． 山东医药，
2009，49(19):4．
［5］ 杨晓露，章丹丹，唐宁，等． 诱导型一氧化氮合酶的
调控机制及其抑制剂的研究进展［J］． 中国药房，
2011，22(39):3728.
［6］ 孙世学，李运曼． NO在类风湿性关节炎症中的作用及
相关药物研究进展［J］． 药学与临床研究，2007，15
(3):175.
［7］ 朱明琼，邝国平． 白介素-1 与眼底病变［J］． 现代医
药卫生，2013，29(2):235.
［8］ 姚艳敏，徐彤彤，武琦，等． 兔急性肺血栓栓塞症血
清 TNF-α，IL-1β和 IL-4 的变化［J］． 中国实验方剂学
杂志，2012，18(8):222.
［责任编辑 李玉洁］
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